免疫共沉淀原理及步骤

范文一:免疫共沉淀原理及步骤

免疫共沉淀原理及步骤

免疫沉淀(Immunoprecipitation, IP)原理

IP是利用抗原蛋白质和抗体的特异性结合以及细菌蛋白质的“protein A/G"特异性地结合到抗体(免疫球蛋白)的FC片段的现象开发出来的方法。目前多用protein A/G预先结合在argarose beads上,使之与含有抗原的溶液及抗体反应后,beads上的prorein A/G就能达到吸附抗原的目的。通过低速离心,可以从含有目的抗原的溶液中将目的抗原与其它抗原分离。

免疫沉淀实验的操作步骤比较多,同时由于在非变性条件下进行实验,所以要得到一个完美的实验结果,不仅需要高质量的抗体,同时对免疫沉淀体系也需要有严格的控制指标。免疫沉淀实验从:蛋白样品处理;抗体-agarose beads孵育;抗体-agarose beads复合物洗涤到最后的鉴定,每步都非常关键,需要严格控制实验流程中每个关键步骤的质量,才能最终达到你的实验目的。

IP实验步骤

基本实验步骤

(1)收获细胞,加入适量细胞IP裂解缓冲液(含蛋白酶抑制剂),冰上或者4℃裂解30min, 12,000g离心30 min后取上清;

(2) 取少量裂解液以备Western blot分析,剩余裂解液将1μg相应的抗体和10-50 μl protein A/G-beads加入到细胞裂解液,4°C缓慢摇晃孵育过夜;

(3)免疫沉淀反应后,在4°C 以3,000 g速度离心5 min,将protein A/G-beads离心至管底;将上清小心吸去,protein A/G-beads用1ml裂解缓冲液洗3-4次;最后加入15μl的2×SDS 加样缓冲液,沸水煮10分钟;

(4)SDS-PAGE, Western blotting或进行质谱分析。一、 样品处理:

免疫沉淀实验成功与否,第一步处理样品非常关键。免疫沉淀实验本质上是处于天然构象状态的抗原和抗体之间的反应,而样品处理的质量决定了抗原抗体反应中的抗原的质量,

浓度以及抗原

是否处于天然构象状态。所以制备高质量的样品以用于后续的抗体-agarose beads孵育对免疫沉淀实验是否成功非常关键。在这个环节中,除了要控制所有操作尽量在冰上或者4°完成外,最为关键的是裂解液的成份。

用于免疫沉淀实验的样品一般是原代培养细胞裂解液或者细胞系裂解液。我们以常用的RIPA裂解液为例(主要含有pH7.4左右的离子缓冲液,接近生理浓度下的NaCl,一定比例的去垢剂和甘油以及各类蛋白酶抑制剂等)来说明其各主要成份的用途,进而帮助我们如何针对不同的实验目的和不同的蛋白质特性来选择最佳的裂解液。

a. 缓冲液:离子缓冲液常采用pH7.4的Hepes或者Tris-Cl。

b. NaCl浓度一般习惯用150 mM,这主要是因为150 mM接近生理浓度,不会破坏蛋白质之间的相互作用。然而细胞内部的NaCl浓度并不是均一的,局部NaCl的浓度可以低到50 mM,150 mM的NaCl有可能会破坏这个区域的蛋白质相互作用。因此裂解液配方最佳的NaCl浓度要视所分析的蛋白的亚细胞定位而定。

c. 甘油由于其粘性,可以对蛋白质之间的相互作用起到一个很好的保护作用。一般添加10%的甘油有助于稳定蛋白质之间的相互作用。

d. 裂解液中的去垢剂可以裂解细胞质膜,也同时破坏了许多细胞器的膜,从而释放了其中储存的许多蛋白酶。而由于用于免疫沉淀实验的去垢剂作用比较温和,因此蛋白酶的活性大部分得以保存。还有一部分蛋白酶来自胞质中,主要由于其抑制蛋白或者其活性抑制环境受到改变后从而恢复了蛋白酶活性。因此,添加蛋白酶抑制剂对于防止目的蛋白的降解从而完成免疫沉淀实验非常关键。一般主要通过添加EDTA抑制金属蛋白酶,通过Protease Cocktail(多种蛋白酶抑制剂混合物)可以抑制蛋白酶。

e. 去垢剂对于免疫沉淀实验尤其是免疫共沉淀实验是一个非常关键的因素。不同的去垢剂种类和不同的去垢剂浓度主要通过影响以下三个因素来影响免疫沉淀效果:

- 细胞质/器膜的通透性:因为许多目的蛋白都定位在细胞器中,所以必须先将这些蛋白释放出来,抗体才能与之反应。

- 膜蛋白的释放:许多膜蛋白的构象对去垢剂种类和浓度非常敏感,因此针对这类蛋白的免疫沉淀实验,需要谨慎地尝试多种去垢剂以及不同浓度。

- 蛋白相互作用:不同去垢剂对不同性质的蛋白质的相互作用影响程度不一样,需要根据具体蛋白的特性进行分析选择去垢剂种类和浓度。而由于何种去垢剂适应作用于何种蛋白质现在很难精准预测,所以一个更为切实可行的办法就是通过具体实验筛选合适的去垢剂种类和浓度。

二、 抗体-agarose beads孵育

裂解细胞,离心并去除不可溶的膜组份后,上清可以储存在-80°保存3个月,但最好能够使用新鲜制备的细胞裂解液上清去进行抗体-agarose beads孵育实验。抗体可以先加入上清中与样品孵育数小时后再加入Protein A或者G beads孵育过夜,也可以同时加入抗体和Protein A或者G beads孵育过夜。一般选择1mg总蛋白(1mg/ml)对应添加1 ug抗体,最高可以添加至5 ug抗体,过多的抗体会产生假阳性。这个步骤中关键因素在于选择合适的阴性对照。一般选用加同样量的IgG,但更为妥当的方法是选择针对胞内其它无关目的蛋白的一抗做对照。例如,做膜蛋白A的免疫沉淀,选择膜蛋白B来做阴性对照,只要确认二者之间没有相互作用;而做胞质可溶性蛋白C的免疫沉淀,则选择另外一个可溶性蛋白D来做阴性对照。同时,为避免Protein A或者G beads有(非)特异性吸附从而造成免疫沉淀实验结果的假阳性,一般在加入目的蛋白抗体之前,预先将Protein A或者G beads与细胞裂解液孵育数小时,然后取上清用于后续的抗体-agarose beads孵育。

同时,Protein A或者G beads对不同类型的抗体亲和力不同,结合一抗的种属和Ig亚型,选择合适的Protein A或者G beads也是决定免疫沉淀实验成功与否的一个重要因素。一般推荐使用Protein A和Protein G beads的混合物,这样可以达到最佳实验效果,而且省去了许多选择的烦恼。三、 抗体-agarose beads复合物洗涤:

除了选择特异性好的抗体以及选择合适的阴性对照外,去除免疫沉淀实验非特异性的一个办法是对抗体-agarose beads复合物进行多次洗涤。一般洗涤缓冲液使用和裂解液一样的配方,但去除甘油,以减少由于甘油的粘性带来的非特异性吸附。针对不同的实验要求,还可以通过更改NaCl的浓度以及去垢剂的比例,种类来达到去除非特异性吸附的效果。例如,针对单纯的免疫沉淀而非免疫共沉淀实验或者虽然是进行免疫共沉淀实验,但蛋白质之间的结合比较牢靠,可以考虑使用低浓度(0.2-0.5%)的SDS洗涤抗体-agarose beads复合物,这样可以去除绝大部分非特异性相互作用。四、 鉴定

免疫沉淀实验用途非常广泛(见IP: Q&A),而且基于最基本的免疫沉淀实验衍生出了许多免疫沉淀相关实验手段(比如免疫共沉淀,染色质免疫沉淀和RNA-蛋白免疫沉淀),因此,免疫沉淀实验的鉴定方法主要视实验目的而定。

我们在本手册中主要简单概述常见的免疫沉淀之后的WB检测需要注意的实验环节。由于免疫沉淀实验使用目的蛋白抗体加Protein A/G beads与样品孵育,因此在最后离心获得抗体-agarose beads复合物后,eppendorf管中主要含有抗体,目的蛋白,Protein A/G beads以及一些其它非特异性作用蛋白。其中,抗体和目的蛋白以及Protein A/G beads三者之间是以非共价健结合在一起,只有Protein A/G与agarose beads是共价结合在一起的。因此,最后经过添加含巯基乙醇的加样缓冲液以及煮沸变性并离心出去Protein A/G beads后,eppendorf管只有抗体和目的蛋白以及少量非特异性吸附蛋白。这样SDS-PAGE中就含有目的蛋白和抗体二种蛋白,由于加样缓冲液中含有巯基乙醇从而导致抗体的重链与轻链之间的二硫键被破坏从而使得抗体分子变成重链分子(55KD)和轻链分子(25KD)。因此,WB显色反应中除了能检测到目的蛋白外,如果所使用的二抗与用于免疫沉淀实验的抗体分子属于同一种属的话,还能检测到重链和轻链分子。通常用于免疫沉淀的抗体量非常大(1ug),所以当目的蛋白的大小接近重链或者轻链分子时,重链或者轻链分子的WB信号常常由于信号过强而导致影响对目的蛋白的WB结果判断。

针对上述情况,通常有二种解决办法:

a. 选择不同种属的抗体分别进行免疫沉淀实验和WB实验,这样再选择一个种属交叉反应比较弱或者无种属交叉反应的二抗进行WB实验,就可以大大减弱重链和轻链分子的WB信号。

b. 使用交联剂将抗体和Protein A/G beads交联,然后通过添加不含巯基乙醇的加样缓冲液处理目的蛋白-抗体-agarose beads复合物,最后离心去除抗体-agarose beads复合物,上清中只留下目的蛋白。

免疫共沉淀 免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation)是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。 其原理是:当细胞在非变性条件下被裂解时,完整细胞内存在的许多蛋白质-蛋白质间的相互作用被保留了下来。如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X,那么与X在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合;也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档。

其优点为:(1)相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的,处于天然状态;(2)蛋白的相互作用是在自然状态下进行的,可以避免人为的影响;(3)可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物。缺点为:(1)可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质-蛋白质相互作用;(2)两种蛋白质的结合可能不是直接结合,而可能有第三者在中间起桥梁作用; (3)必须在实验前预测目的蛋白是什么,以选择最后检测的抗体,所以,若预测不正确,实验就得不到结果,方法本身具有冒险性。

实验流程为:

(1)转染后24-48 h 可收获细胞,加入适量细胞裂解缓冲液(含蛋白酶抑制剂),冰上裂解30min, 细胞裂解液于4°C, 最大转速离心30 min后取上清;

(2)取少量裂解液以备Western blot分析,剩余裂解液加1μg相应的抗体加入到细胞裂解液,4°C缓慢摇晃孵育过夜;

(3)取10μl protein A 琼脂糖珠,用适量裂解缓冲液洗3 次,每次3,000 rpm离心3 min;

(4)将预处理过的10μl protein A 琼脂糖珠加入到和抗体孵育过夜的细胞裂解液中4°C缓慢摇晃孵育2-4h,使抗体与protein A琼脂糖珠偶连;

(5)免疫沉淀反应后,在4°C 以3,000 rpm 速度离心3 min,将琼脂糖珠离心至管底;将上清小心吸去,琼脂糖珠用1ml裂解缓冲液洗3-4次;最后加入15μl的2×SDS 上样缓冲液,沸水煮5分钟;

(6)SDS-PAGE, Western blotting或质谱仪分析。

注意的问题:

(1)细胞裂解采用温和的裂解条件,不能破坏细胞内存在的所有蛋白质-蛋白质相互作用,多采用非离子变性剂(NP40或Triton X-100)。每种细胞的裂解条件是不一样的,通过经验确定。不能用高浓度的变性剂(0.2%SDS),细胞裂解液中要加各种酶抑制剂,如商品化的cocktailer。

(2)使用明确的抗体,可以将几种抗体共同使用

(3)使用对照抗体:

单克隆抗体:正常小鼠的IgG或另一类单抗

兔多克隆抗体:正常兔IgG

在免疫共沉淀实验中要保证实验结果的真实性,应注意以下几点:

(1) 确保共沉淀的蛋白是由所加入的抗体沉淀得到的,而并非外源非特异蛋白,单克隆抗体的使用有助于避免污染的发生;

(2) 要确保抗体的特异性,即在不表达抗原的细胞溶解物中添加抗体后不会引起共沉淀;

(3) 确定蛋白间的相互作用是发生在细胞中,而不是由于细胞的溶解才发生的,这需要进行蛋白质的定位来确定。

ChIP是个很郁闷的实验,时间花费N长,如果做的不好非常打击人,我也谈不上什么成功经验呢

1)显然抗体来源要可靠,很多在WB上很好的商业化抗体并不能成功使用到ChIP上。

2)超声处理要充分,处理完呢以后DNA一定要跑胶检测看看,如果片段都很大,结果受到的影响很大,特别是如果ChIP组蛋白

范文二:免疫沉淀与免疫共沉淀原理及方法

免疫沉淀与免疫共沉淀原理及方法

一、基本概念

免疫沉淀(immunoprecipitation)是利用抗体可与抗原特异性结合的特性,将抗原(常为靶蛋白)从混合体系沉淀下来,初步分离靶蛋白的一种方法。

免疫共沉淀(coimmunoprecipitation)是一种在体外探测两个蛋白分子间是否存在特异性相互作用的一种方法。其原理是如果两个蛋白在体外体系能够发生特异性相互作用的话,那么当用一种蛋白的抗体进行免疫沉淀时,另一个蛋白也会被同时沉淀下来。与酵母双杂交技术不同,免疫共沉淀技术所利用的是抗原和抗体间的免疫反应,是一种基于体外非细胞的环境中研究蛋白质与蛋白质的相互作用的方法。 不难看出,免疫共沉淀与免疫沉淀技术所使用的原理与方法大致相似,所不同的是,在免疫共沉淀中,对靶蛋白的结合与沉淀由另一个与之发生相互作用的蛋白替代。在免疫共沉淀或免疫沉淀的基础上,通过进一步与其它技术的结合,如聚丙烯酰胺凝胶电泳,还可进一步对靶蛋白的的分子量等特性进行鉴定。

二、抗体的选择

(一)多克隆抗体

多克隆抗体因其制备相对简单,可与靶蛋白分子的多个位点结合,所形成的抗原抗体复合物较稳定因而应用的最为广泛。但多克隆抗体的缺点在于非特异性结合较多,常会导致反映本底(是否是背景)升高和一定的假阳性结果。

(二)单克隆抗体

与多克隆抗体相比,单克隆抗体往往只结合一种抗原表位,具有单一结合特异性,所以发生非特异结合的机会少,可被用于确定靶蛋白上某一部位的特殊结构,甚至可被用于区分相同靶蛋白的不同形式如构象变化和修饰。但反过来,单克隆抗体仅与单一表位结合的特性也会引起具有同一表位的不同靶蛋白间的交叉反应。

三、免疫沉淀方法

免疫沉淀的靶蛋白一般来自细胞裂解液,可以是被同位素标记的也可以是未被标记的。若为前者,免

疫沉淀后再经聚丙烯酰胺凝胶电泳,只需压片即可检测到靶蛋白的存在;若为后者,经免疫沉淀和聚丙烯酰凝胶电泳后,尚需借助银染或免疫印迹进行鉴定。

(一)所需试剂及溶液

改良的RIPA液(细胞裂解液)、稀释缓冲液(常用PBS溶液)、TSA溶液、0.05mol/lTris(pH6.8)、2×SDS蛋白上样缓冲液、抗体与Sepharose或抗免疫球蛋白抗体、蛋白A、蛋白G的交联物。

改良的RIPA液的组成(100ml体系):Tris-HCl: 50 mM(pH 7.4)、NP-40: 1%脱氧胆酸钠(0.25%)、NaCl(150 mM)、EDTA(1 mM)、PMSF(1 mM)、抑肽酶、亮肽酶素、抑肽素(各1µg /ml)、Na3VO4(1 mM)、NaF(1 mM)。

(二)方法

1.用冰冷的PBS溶液洗涤贴壁细胞两次,弃干净PBS。(对于悬浮细胞则用台式离心机以800-1000rpm转速通过离心洗涤)。

2.给细胞培养瓶中加入冰冷的改良RIPA液,RIPA液的用量:按照1 ml/10 细胞/100mm 培养面/150cm瓶或 0.5 ml每5×10 细胞/60mm 培养面/75cm 瓶计算。

3.用经蒸馏水预冷的橡皮或塑料细胞刮棒将贴壁细胞转移至一离心管中,轻轻混匀细胞悬液,用振荡器在4℃振荡15min以裂解细胞。

4.于4℃,14000g离心裂解液15min,迅速转移上清至另一离心管中,弃掉沉淀。

5.准备蛋白A(蛋白G或Sepharose):用PBS洗涤蛋白A(蛋白G或Sepharose)珠子两次,并将其用PBS调制成50%悬液。

6.每1ml细胞裂解液上清加入100µl蛋白A,4℃,振荡10min,进行预清除。

7.4℃,14000g离心10min移去蛋白A(蛋白G或Sepharose)珠子,转移上清至一新离心管中。

8.用Bradford法(考马斯亮蓝染色法)测定蛋白浓度。(应至少将细胞裂解液作1:10稀释后再测定,这是因为存在于裂解液中的去污剂成分会干扰考马斯亮蓝的作用)。

9.根据所测得的细胞裂解液蛋白浓度,用PBS将其稀释至1mg/ml以降低缓冲体系中去污剂的浓度(但对于那些在细胞中表达水平较低的蛋白而言,10mg/ml这样更高的浓度可能对免疫沉淀更有效一些)。

10.加入推荐体积的免疫沉淀抗体至500µl细胞裂解液中。(抗体的最适用量要根据每一细胞模型中免疫沉淀靶蛋白的数量来确定)。 2627

11.将细胞裂解液与抗体轻轻混匀后孵育2h,或置摇床上振荡4℃过夜。(选择孵育2h常用于免疫沉淀与激酶或磷酸酯酶作用的活化酶。)加入100µl蛋白A(蛋白G或Sepharose)轻轻振荡1h或4℃过夜以捕获免疫沉淀复合物。(在多数情况下,加入2µg像兔抗小鼠IgG这样的桥连抗体可以增强对免疫复合物的捕获能力,这对于像小鼠IgG1或由鸡所产生的低亲和力抗体尤为重要)。

12.通过脉冲离心(14000 rpm,5s)收集琼脂糖/Sepharose珠子,弃掉上清,用800µl冰冷的改良RIPA缓冲液洗涤珠子3次。

13.将琼脂糖/Sepharose珠子重悬于60µl 2×SDS蛋白上样缓冲液中,轻混均匀后煮沸5min,200g离心1min弃掉珠子。

14.将上清转移至一新离心管中-20℃冻存或进行SDS-PAGE电泳。

范文三:免疫共沉淀步骤-磁珠

一、细胞裂解

1、转染后24-48 h收获细胞,用冷的PBS(4°C)洗细胞三次,最后一次吸干PBS;

2、加入适量(500μl)预冷的细胞裂解缓冲液(含蛋白酶抑制剂),冰上裂解30min;

3、用预冷的细胞刮将细胞从培养瓶上刮下,将裂解液收集到1.5mlEP管中,4°C、最大转速(14000rpm)离心30 min后取上清;

4、取少量(20μl)裂解液以备western blotting分析;

二、准备磁珠

5、将Dynabeads完全重悬;

6、吸取50μl(1.5mg)Dynabeads到一个EP管中;(准备两份,一份结合抗体,一份去除非特异性蛋白)

7、将EP管放在磁力架上,将Dynabeads从溶液中分离出来,吸去上清;

8、再用预冷的lysis buffer 500μl洗三次,每次都用磁力架将Dynabeads分离出来,最后将EP管从磁力架上取下来;

三、结合抗体

9、取10μl的Antibody(Ab),加入到准备好Dynabeads的EP管中; 10、4°C旋转、孵育5h;

11、将EP管放在磁力架上,把Dynabeads-Ab复合物从溶液中分离出来,吸去上清;

12、用冷的lysis buffer 1000μl洗三次,最后一次尽量吸尽上清,再加入25μl的lysis buffer和0.2μl的10%叠氮化钠;

四、免疫共沉淀

13、在裂解好的细胞样品500μl(步骤3)中加入Dynabeads(步骤6)25μl中,4°C旋转2h(去除非特异性蛋白);

14、将EP管放在磁力架上,收集上清;

15、将上清加入预处理的Dynabeads-Ab复合物中,轻轻重悬Dynabeads-Abs复合物;

16、4°C旋转、孵育2h,让Ag与Dynabeads-Abs复合物结合;

17、将EP管置于磁力架上,转移上清到一个新的EP管中,以备需要时进一步分析;

18、用1000μl的lysis buffer洗Dynabeads-Ab-Ag复合物三次,每次清洗后在磁力架上分离,移去上清,再温柔地重悬复合物;(Avoid co-elution of proteins bound to the tube wall)

四、洗脱目标蛋白

19、将EP管放在磁力架上,吸去上清;

20、加入20μl的2×SDS 上样缓冲液,轻轻重悬Dynabeads-Ab-Ag复合物; 21、50°C加热10min;

22、将EP管放在磁力架上,取上清作为样品,SDS-PAGE电泳。

范文四:免疫共沉淀和免疫沉淀原理

免疫沉淀是指用抗体把抗原(包括单体、复合物)沉淀下来 ,是一种抗原纯化、浓集的方法;

免疫共沉淀 指用抗体把抗原复合物沉淀下来,常用来研究蛋白质的相互作用

免疫沉淀(Immunoprecipitation, IP)

免疫沉淀是利用抗体特异性反应纯化富集目的蛋白的一种方法。抗体与细胞裂解液或表达上清中相应的蛋白结合后,再与蛋白A/G(ProteinA/G)或二抗偶联的agaose或Sepharose珠子孵育,通过离心得到珠子-蛋白A/G或二抗-抗体-目的蛋白复合物,沉淀经过洗涤后,重悬于电泳上样缓冲液,煮沸5-10min,在高温及还原剂的作用下,抗原与抗体解离,离心收集上清,上清中包括抗体、目的蛋白和少量的杂蛋白。

免疫共沉淀(Co- Immunoprecipitation, Co-IP)

是利用抗原和抗体的特异性结合以及细菌的Protein A或G特异性地结合到免疫球蛋白的Fc片段的现象开发出来的方法。其基本原理是,在细胞裂解液中加入抗兴趣蛋白的抗体,孵育后再加入与抗体特异结合的结合于Agarose珠上的Protein A或G,若细胞中有与兴趣蛋白结合的目的蛋白,就可以形成这样一种复合物:“目的蛋白—兴趣蛋白—抗兴趣蛋白抗体—Protein A或G”,经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,复合物又被分开。然后经免疫印迹或质谱检测目的蛋白。这种方法得到的目的蛋白是在细胞内与兴趣蛋白天然结合的,符合体内实际情况,得到的结果可信度高。这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合;也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档。

免疫共沉淀优点

(1)相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的,处于天然状态;

(2)蛋白的相互作用是在自然状态下进行的,可以避免人为的影响;

(3)可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物

免疫共沉淀缺点

(1)可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质-蛋白质相互作用;

(2)两种蛋白质的结合可能不是直接结合,而可能有第三者在中间起桥梁作用;

(3)必须在实验前预测目的蛋白是什么,以选择最后检测的抗体,所以,若预测不正确,实验就得不到结果,方法本身具有冒险性。

一 原理:免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation)是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。 其原理是:当细胞在非变性条件下被裂解时,完整细胞内存在的许多蛋白质-蛋白质间的相互作用被保留了下来。如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X,那么与X在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。目前多用精制的prorein A预先结合固化在argarose的beads上,使之与含有抗原的溶液及抗体反应后,beads上的prorein A就能吸附抗原达到精制的目的。这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合;也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档。

其优点为:(1)相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的,处于天然状态;(2)蛋白的相互作用是在自然状态下进行的,可以避免人为的影响;(3)可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物。缺点为:(1)可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质-蛋白质相互作用;

(2)两种蛋白质的结合可能不是直接结合,而可能有第三者在中间起桥梁作用; (3)必须在实验前预测目的蛋白是什么,以选择最后检测的抗体,所以,若预测不正确,实验就得不到结果,方法本身具有冒险性。

范文五:免疫共沉淀Co-IP实验操作步骤

免疫共沉淀Co-IP实验操作步骤

一、原理:

免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation)是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。其原理是:当细胞在非变性条件下被裂解时,完整细胞内存在的许多蛋白质-蛋白质间的相互作用被保留了下来。如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X,那么与X在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。目前多用精制的prorein A预先结合固化在argarose的beads上,使之与含有抗原的溶液及抗体反应后,beads上的prorein A就能吸附抗原达到精制的目的。这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合;也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档。

其优点为:(1)相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的,处于天然状态;(2)蛋白的相互作用是在自然状态下进行的,可以避免人为的影响;(3)可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物。缺点为:(1)可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质-蛋白质相互作用;(2)两种蛋白质的结合可能不是直接结合,而可能有第三者在中间起桥梁作用;

(3)必须在实验前预测目的蛋白是什么,以选择最后检测的抗体,所以,若预测不正确,实验就得不到结果,方法本身具有冒险性。

二、准备工作:

预冷PBS,RIPA Buffer,细胞刮子(用保鲜膜包好后,埋冰下),离心机

1. 用预冷的PBS洗涤细胞两次,最后一次吸干PBS;

2. 加入预冷的RIPA Buffer(1ml/107个细胞、10cm培养皿或150cm2培养瓶,

0.5ml/5×106个细胞、6cm培养皿、75cm2培养瓶)

3. 用预冷的细胞刮子将细胞从培养皿或培养瓶上刮下,把悬液转到1.5EP管中,4℃,缓慢晃动15min(EP管插冰上,置水平摇床上)

4. 4℃,14000g离心15min,立即将上清转移到一个新的离心管中

5. 准备Protein A agarose,用PBS 洗两遍珠子,然后用PBS配制成50%浓度,建议减掉枪尖部分,避免在涉及琼脂糖珠的操作中破坏琼脂糖珠

6. 每1ml总蛋白中加入100μl Protein A琼脂糖珠(50%),4℃摇晃10min(EP管插冰上,置水平摇床上),以去除非特异性杂蛋白,降低背景

7. 4℃,14000g离心15min,将上清转移到一个新的离心管中,去除Protein A珠子

8. (Bradford 法)做蛋白标准曲线,测定蛋白浓度,测前将总蛋白至少稀释1:10倍以上,以减少细胞裂解液中去垢剂的影响(定量,分装后,可以在-20℃保存一个月)

9. 用PBS将总蛋白稀释到约1 μg/μl,以降低裂解液中去垢剂的浓度,如果兴趣蛋白在细胞中含量较低,则总蛋白浓度应该稍高(如10 μg/μl)

10. 加入一定体积的兔抗到500μl总蛋白中,抗体的稀释比例因兴趣蛋白在不同细胞系中的多少而异

11. 4℃缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或室温2h,激酶或磷酸酯酶活性分析建议用2 h室温孵育

12. 加入100μl Protein A琼脂糖珠来捕捉抗原抗体复合物,4℃缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或室温1h,如果所用抗体为鼠抗或鸡抗,建议加2 μl

13. 14000rpm瞬时离心5s,收集琼脂糖珠-抗原抗体复合物,去上清,用预冷的RIPA buffer洗3遍,800μl/遍,RIPA buffer有时候会破坏琼脂糖珠-抗原抗体复合物内部的结合,可以使用PBS

14. 用60μl 2×上样缓冲液将琼脂糖珠-抗原抗体复合物悬起,轻轻混匀,缓冲液的量依据上样多少的需要而定(60 μl足够上三道)

15. 将上样样品煮5min,以游离抗原,抗体,珠子,离心,将上清电泳,收集剩余琼脂糖珠,上清也可以暂时冻-20℃,留待以后电泳,电泳前应再次煮5min变性。

RIPA Buffer配制:

基础成分:

Tris-HCl(缓冲液成分,防止蛋白变性)

NaCl(盐份,防止非特异蛋白聚集)

NP-40(非离子去污剂,提取蛋白;用H2O配制成10%储存液)

去氧胆酸钠(离子去污剂,提取蛋白;用H2O配制成10%储存液;避光保存)

注意:准备激酶(致活酶)实验时,不要加去氧胆酸钠,因为离子型去污剂能够使酶变性,导致活性丧失。

RIPA蛋白酶抑制剂

苯甲基磺酰氟(PMSF)(用异丙醇配制成200mM的储存液,室温保存) EDTA(钙螯合剂;用H2O配制成100mM的储存液,PH 7.4)

亮抑酶肽(Leupeptin)(用H2O配制成1mg/ml的储存液,分装,-20℃保存) 抑蛋白酶肽(Aprotinin)(用H2O配制成1mg/ml的储存液,分装,-20℃保存) 胃蛋白酶抑制剂(Pepstatin)(用甲醇配制成1mg/ml的储存液,分装,-20℃保存) RIPA磷酸(酯)酶抑制剂

激活的Na3VO4(用H2O配制成200mM的储存液,见Sodium Orthovanadate Activation Protoco)

NaF(200mM的储存液,室温保存)

范文六:免疫共沉淀(Co-IP)详细步骤教程(

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一原理:免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation)是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。其原理是:当细胞在非变性条件下被裂解时,完整细胞内存在的许多蛋白质-蛋白质间的相互作用被保留了下来。如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X,那么与X在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。目前多用精制的prorein A预先结合固化在argarose的beads上,使之与含有抗原的溶液及抗体反应后,beads上的prorein A就能吸附抗原达到精制的目的。这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合;也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档。

其优点为:(1)相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的,处于天然状态;(2)蛋白的相互作用是在自然状态下进行的,可以避免人为的影响;(3)可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物。缺点为:(1)可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质-蛋白质相互作用;(2)两种蛋白质的结合可能不是直接结合,而可能有第三者在中间起桥梁作用;(3)必须在实验前预测目的蛋白是什么,以选择最后检测的抗体,所以,若预测不正确,实验就得不到结果,方法本身具有冒险性。

二、准备工作:

预冷PBS,RIPA Buffer,细胞刮子(用保鲜膜包好后,埋冰下),离心机

1. 用预冷的PBS洗涤细胞两次,最后一次吸干PBS;

2. 加入预冷的RIPA Buffer(1ml/107个细胞、10cm培养皿或150cm2培养瓶,0.5ml/5×106个细胞、6cm培养皿、75cm2培养瓶)

3. 用预冷的细胞刮子将细胞从培养皿或培养瓶上刮下,把悬液转到1.5EP管中,4℃,缓慢晃动15min(EP管插冰上,置水平摇床上)

4. 4℃,14000g离心15min,立即将上清转移到一个新的离心管中

5. 准备Protein A agarose,用PBS 洗两遍珠子,然后用PBS配制成50%浓度,建议减掉枪尖部分,避免在涉及琼脂糖珠的操作中破坏琼脂糖珠

6. 每1ml总蛋白中加入100μl Protein A琼脂糖珠(50%),4℃摇晃10min(EP管插冰上,置水平摇床上),以去除非特异性杂蛋白,降低背景

7. 4℃,14000g离心15min,将上清转移到一个新的离心管中,去除Protein A珠子

8. (Bradford 法)做蛋白标准曲线,测定蛋白浓度,测前将总蛋白至少稀释1:10倍以上,以减少细胞裂解液中去垢剂的影响(定量,分装后,可以在-20℃保存一个月)

9. 用PBS将总蛋白稀释到约1 μg/μl,以降低裂解液中去垢剂的浓度,如果兴趣蛋白在细胞中含量较低,则总蛋白浓度应该稍高(如10 μg/μl)

10. 加入一定体积的兔抗到500μl总蛋白中,抗体的稀释比例因兴趣蛋白在不同细胞系中的多少而异

11. 4℃缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或室温2h,激酶或磷酸酯酶活性分析建议用2 h室温孵育

12. 加入100μl Protein A琼脂糖珠来捕捉抗原抗体复合物,4℃缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或室温1h,如果所用抗体为鼠抗或鸡抗,建议加2 μl"过渡抗体"(兔抗鼠IgG,兔抗鸡IgG)

13. 14000rpm瞬时离心5s,收集琼脂糖珠-抗原抗体复合物,去上清,用预冷的RIPA buffer洗3遍,800μl/遍,RIPA buffer有时候会破坏琼脂糖珠-抗原抗体复合物内部的结合,可以使用PBS

14. 用60μl 2×上样缓冲液将琼脂糖珠-抗原抗体复合物悬起,轻轻混匀,缓冲液的量依据上样多少的需要而定(60 μl足够上三道)

15. 将上样样品煮5min,以游离抗原,抗体,珠子,离心,将上清电泳,收集剩余琼脂糖珠,上清也可以暂时冻-20℃,留待以后电泳,电泳前应再次煮5min变性。

RIPA Buffer配制:

基础成分:

Tris-HCl(缓冲液成分,防止蛋白变性)

NaCl(盐份,防止非特异蛋白聚集)

NP-40(非离子去污剂,提取蛋白;用H2O配制成10%储存液)

去氧胆酸钠(离子去污剂,提取蛋白;用H2O配制成10%储存液;避光保存)

注意:准备激酶(致活酶)实验时,不要加去氧胆酸钠,因为离子型去污剂能够使酶变性,导致活性丧失。

RIPA蛋白酶抑制剂

苯甲基磺酰氟(PMSF)(用异丙醇配制成200mM的储存液,室温保存)

EDTA(钙螯合剂;用H2O配制成100mM的储存液,PH 7.4)

亮抑酶肽(Leupeptin)(用H2O配制成1mg/ml的储存液,分装,-20℃保存)

抑蛋白酶肽(Aprotinin)(用H2O配制成1mg/ml的储存液,分装,-20℃保存)

胃蛋白酶抑制剂(Pepstatin)(用甲醇配制成1mg/ml的储存液,分装,-20℃保存) RIPA磷酸(酯)酶抑制剂

激活的Na3VO4(用H2O配制成200mM的储存液,见Sodium Orthovanadate Activation Protoco)

NaF(200mM的储存液,室温保存)

注意:在准备做磷酸(酯)酶实验的时候,不加磷酸酯酶抑制剂

工作液配制:

配制100ml的modified RIPA buffe:

1. 称取790mg 的Tris-Base,加到75ml 去离子水中,加入900mg的NaCl,搅拌,直到全部溶解,用HCl调节PH值到7.4

2. 加10 ml 10%的NP-40

3. 加2.5 ml 10%的去氧胆酸钠,搅拌,直到溶液澄清

4. 加1 ml 100mM的EDTA,用量筒定容到100ml,2-8℃保存

5. 理论上,蛋白酶和磷酸酯酶抑制剂应该在使用当天同时加入(抑蛋白酶肽,亮抑酶肽,胃蛋白酶抑制剂各100 μl; PMSF, Na3VO4, NaF各500 μl),但是PMSF在水溶液中很不稳定,30分钟就会降解一半,所以PMSF应该在使用前现加,其他抑制剂成分可以在水溶液中稳定5天。

各种成分在工作液中的终浓度:

* Tris-HCl: 50 mM, pH 7.4

* NP-40: 1%

* 去氧胆酸钠:0.25%

* NaCl: 150 mM

* EDTA: 1 mM

* PMSF: 1 mM

* 抑蛋白酶肽,亮抑酶肽,胃蛋白酶抑制剂: 各1 μg/ml

* Na3VO4: 1 mM

* NaF: 1 mM

三、实验流程为:

(1)转染后24-48 h 可收获细胞,加入适量细胞裂解缓冲液(含蛋白酶抑制剂),冰上裂解30min, 细胞裂解液于4°C,最大转速离心30 min后取上清;

(2)取少量裂解液以备Western blot分析,剩余裂解液加1μg相应的抗体加入到细胞裂解液,4°C缓慢摇晃孵育过夜;

(3)取10μl protein A 琼脂糖珠,用适量裂解缓冲液洗3 次,每次3,000 rpm离心3 min;

(4)将预处理过的10μl protein A 琼脂糖珠加入到和抗体孵育过夜的细胞裂解液中4°C缓慢摇晃孵育2-4h,使抗体与protein A琼脂糖珠偶连;

(5)免疫沉淀反应后,在4°C 以3,000 rpm 速度离心3 min,将琼脂糖珠离心至管底;将上清小心吸去,琼脂糖珠用1ml裂解缓冲液洗3-4次;最后加入15μl的2×SDS 上样缓冲液,沸水煮5分钟;

(6)SDS-PAGE, Western blotting或质谱仪分析。通过免疫共沉淀确定结合蛋白

1.用磷酸盐缓冲液洗30块10 cm培养板上的适宜细胞。刮去每块板上的细胞到1 ml冰冷的EBC裂解缓冲液中。

2.将每毫升细胞悬液转移到微量离心管中,在微量离心机上4℃以最大速度离心15 min。

3.收集上清(约30 ml)并加入30μg的适当抗体,4℃摇动免疫沉淀物1 h。

4.加入0.9 ml的蛋白质A-Sepharose 悬液,4℃摇动免疫沉淀物30 min。

5.用含900 mmol/L NaCl的NETN洗蛋白A-Sepharose混合物,再重复洗5次。最后,用NETN洗一次。

6.吸出混合物的液体部分。加入800μl的1×SDS胶加样缓冲液到球珠中,煮沸4 min。

7.将样品加入到大孔的不连续SDS-PAGE梯度胶中,在10 mA的恒定电流下电泳过夜。

8.通过考马斯蓝染色观察蛋白质泳带。

9.从胶上切下目标带,将其放到微量离心管中,用1ml 50%乙腈洗两次,每次3 min。

10. 用胰蛋白酶消化胶中的蛋白质,再将肽电洗脱。

11. 通过窄孔高效液相色谱分离肽。将收集的肽在ABI 477A或494A机器上进行自动Edman降解测序。

四、注意的问题:

(1)细胞裂解采用温和的裂解条件,不能破坏细胞内存在的所有蛋白质-蛋白质相互作用,多采用非离子变性剂(NP40 或Triton X-100)。每种细胞的裂解条件是不一样的,通过经验确定。不能用高浓度的变性剂(0.2%SDS),细胞裂解液中要加各种酶抑制剂,如商品化的 cocktailer。

(2)使用明确的抗体,可以将几种抗体共同使用

(3)使用对照抗体:

单克隆抗体:正常小鼠的IgG或另一类单抗

兔多克隆抗体:正常兔IgG

在免疫共沉淀实验中要保证实验结果的真实性,应注意以下几点:

(1) 确保共沉淀的蛋白是由所加入的抗体沉淀得到的,而并非外源非特异蛋白,单克隆抗体的使用有助于避免污染的发生;

(2) 要确保抗体的特异性,即在不表达抗原的细胞溶解物中添加抗体后不会引起共沉淀;

(3) 确定蛋白间的相互作用是发生在细胞中,而不是由于细胞的溶解才发生的,这需要进行蛋白质的定位来确定

范文七:免疫共沉淀(Co-IP)详细步骤教程

免疫共沉淀(Co-IP)详细步骤教程

一、原理:免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation)是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。其原理是:当细胞在非变性条件下被裂解时,完整细胞内存在的许多蛋白质-蛋白质间的相互作用被保留了下来。如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X,那么与X在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。目前多用精制的prorein A预先结合固化在argarose的beads上,使之与含有抗原的溶液及抗体反应后,beads上的prorein A就能吸附抗原达到精制的目的。这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合;也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档。

其优点为:(1)相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的,处于天然状态;(2)蛋白的相互作用是在自然状态下进行的,可以避免人为的影响;(3)可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物。缺点为:(1)可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质-蛋白质相互作用;(2)两种蛋白质的结合可能不是直接结合,而可能有第三者在中间起桥梁作用;(3)必须在实验前预测目的蛋白是什么,以选择最后检测的抗体,所以,若预测不正确,实验就得不到结果,方法本身具有冒险性。

二、准备工作:

预冷PBS,RIPA Buffer,细胞刮子(用保鲜膜包好后,埋冰下),离心机

1. 用预冷的PBS洗涤细胞两次,最后一次吸干PBS;

2. 加入预冷的RIPA Buffer(1ml/107个细胞、10cm培养皿或150cm2培养瓶,0.5ml/5×106个细胞、6cm培养皿、75cm2培养瓶)

3. 用预冷的细胞刮子将细胞从培养皿或培养瓶上刮下,把悬液转到1.5EP管中,4℃,缓慢晃动15min(EP管插冰上,置水平摇床上)

4. 4℃,14000g离心15min,立即将上清转移到一个新的离心管中

5. 准备Protein A agarose,用PBS 洗两遍珠子,然后用PBS配制成50%浓度,建议减掉枪尖部分,避免在涉及琼脂糖珠的操作中破坏琼脂糖珠

6. 每1ml总蛋白中加入100μl Protein A琼脂糖珠(50%),4℃摇晃10min(EP管插冰上,置水平摇床上),以去除非特异性杂蛋白,降低背景

7. 4℃,14000g离心15min,将上清转移到一个新的离心管中,去除Protein A珠子

8. (Bradford 法)做蛋白标准曲线,测定蛋白浓度,测前将总蛋白至少稀释1:10倍以上,以减少细胞裂解液中去垢剂的影响(定量,分装后,可以在-20℃保存一个月)

9. 用PBS将总蛋白稀释到约1 μg/μl,以降低裂解液中去垢剂的浓度,如果兴趣蛋白在细胞中含量较低,则总蛋白浓度应该稍高(如10 μg/μl)

10. 加入一定体积的兔抗到500μl总蛋白中,抗体的稀释比例因兴趣蛋白在不同细胞系中的多少而异

11. 4℃缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或室温2h,激酶或磷酸酯酶活性分析建议用2 h室温孵育

12. 加入100μl Protein A琼脂糖珠来捕捉抗原抗体复合物,4℃缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或室温1h,如果所用抗体为鼠抗或鸡抗,建议加2 μl"过渡抗体"(兔抗鼠IgG,兔抗鸡IgG)

13. 14000rpm瞬时离心5s,收集琼脂糖珠-抗原抗体复合物,去上清,用预冷的RIPA buffer洗3遍,800μl/遍,RIPA buffer有时候会破坏琼脂糖珠-抗原抗体复合物内部的结合,可以使用PBS

14. 用60μl 2×上样缓冲液将琼脂糖珠-抗原抗体复合物悬起,轻轻混匀,缓冲液的量依据上样多少的需要而定(60 μl足够上三道)

15. 将上样样品煮5min,以游离抗原,抗体,珠子,离心,将上清电泳,收集剩余琼脂糖珠,上清也可以暂时冻-20℃,留待以后电泳,电泳前应再次煮5min变性。

RIPA Buffer配制:

基础成分:

Tris-HCl(缓冲液成分,防止蛋白变性)

NaCl(盐份,防止非特异蛋白聚集)

NP-40(非离子去污剂,提取蛋白;用H2O配制成10%储存液)

去氧胆酸钠(离子去污剂,提取蛋白;用H2O配制成10%储存液;避光保存) 注意:准备激酶(致活酶)实验时,不要加去氧胆酸钠,因为离子型去污剂能够

使酶变性,导致活性丧失。

RIPA蛋白酶抑制剂

苯甲基磺酰氟(PMSF)(用异丙醇配制成200mM的储存液,室温保存) EDTA(钙螯合剂;用H2O配制成100mM的储存液,PH 7.4)

亮抑酶肽(Leupeptin)(用H2O配制成1mg/ml的储存液,分装,-20℃保存) 抑蛋白酶肽(Aprotinin)(用H2O配制成1mg/ml的储存液,分装,-20℃保存) 胃蛋白酶抑制剂(Pepstatin)(用甲醇配制成1mg/ml的储存液,分装,-20℃保存)

RIPA磷酸(酯)酶抑制剂

激活的Na3VO4(用H2O配制成200mM的储存液,见

Sodium Orthovanadate Activation Protoco)

NaF(200mM的储存液,室温保存)

注意:在准备做磷酸(酯)酶实验的时候,不加磷酸酯酶抑制剂

工作液配制:

配制100ml的modified RIPA buffe:

1. 称取790mg 的Tris-Base,加到75ml 去离子水中,加入900mg的NaCl,搅拌,直到全部溶解,用HCl调节PH值到7.4

2. 加10 ml 10%的NP-40

3. 加2.5 ml 10%的去氧胆酸钠,搅拌,直到溶液澄清

4. 加1 ml 100mM的EDTA,用量筒定容到100ml,2-8℃保存

5. 理论上,蛋白酶和磷酸酯酶抑制剂应该在使用当天同时加入(抑蛋白酶肽,亮抑酶肽,胃蛋白酶抑制剂各100 μl; PMSF, Na3VO4, NaF各500 μl),但是

PMSF在水溶液中很不稳定,30分钟就会降解一半,所以PMSF应该在使用前现加,其他抑制剂成分可以在水溶液中稳定5天。

各种成分在工作液中的终浓度:

* Tris-HCl: 50 mM, pH 7.4

* NP-40: 1%

* 去氧胆酸钠:0.25%

* NaCl: 150 mM

* EDTA: 1 mM

* PMSF: 1 mM

* 抑蛋白酶肽,亮抑酶肽,胃蛋白酶抑制剂: 各1 μg/ml

* Na3VO4: 1 mM

* NaF: 1 mM

三、实验流程为:

(1)转染后24-48 h 可收获细胞,加入适量细胞裂解缓冲液(含蛋白酶抑制剂),冰上裂解30min, 细胞裂解液于4°C,最大转速离心30 min后取上清;

(2)取少量裂解液以备Western blot分析,剩余裂解液加1μg相应的抗体加

入到细胞裂解液,4°C缓慢摇晃孵育过夜;

(3)取10μl protein A 琼脂糖珠,用适量裂解缓冲液洗3 次,每次3,000 rpm离心3 min;

(4)将预处理过的10μl protein A 琼脂糖珠加入到和抗体孵育过夜的细胞裂解液中4°C缓慢摇晃孵育2-4h,使抗体与protein A琼脂糖珠偶连;

(5)免疫沉淀反应后,在4°C 以3,000 rpm 速度离心3 min,将琼脂糖珠离心至管底;将上清小心吸去,琼脂糖珠用1ml裂解缓冲液洗3-4次;最后加入15μl的2×SDS 上样缓冲液,沸水煮5分钟;

(6)SDS-PAGE, Western blotting或质谱仪分析。通过免疫共沉淀确定结合蛋白

1.用磷酸盐缓冲液洗30块10 cm培养板上的适宜细胞。刮去每块板上的细胞到1 ml冰冷的EBC裂解缓冲液中。

2.将每毫升细胞悬液转移到微量离心管中,在微量离心机上4℃以最大速度离心15 min。

3.收集上清(约30 ml)并加入30μg的适当抗体,4℃摇动免疫沉淀物1 h。

4.加入0.9 ml的蛋白质A-Sepharose 悬液,4℃摇动免疫沉淀物30 min。

5.用含900 mmol/L NaCl的NETN洗蛋白A-Sepharose混合物,再重复洗5次。最后,用NETN洗一次。

6.吸出混合物的液体部分。加入800μl的1×SDS胶加样缓冲液到球珠中,煮

沸4 min。

7.将样品加入到大孔的不连续SDS-PAGE梯度胶中,在10 mA的恒定电流下电泳过夜。

8.通过考马斯蓝染色观察蛋白质泳带。

9.从胶上切下目标带,将其放到微量离心管中,用1ml 50%乙腈洗两次,每次3 min。

10. 用胰蛋白酶消化胶中的蛋白质,再将肽电洗脱。

11. 通过窄孔高效液相色谱分离肽。将收集的肽在ABI 477A或494A机器上进行自动Edman降解测序。

四、注意的问题:

(1)细胞裂解采用温和的裂解条件,不能破坏细胞内存在的所有蛋白质-蛋白质相互作用,多采用非离子变性剂(NP40 或Triton X-100)。每种细胞的裂解条件是不一样的,通过经验确定。不能用高浓度的变性剂(0.2%SDS),细胞裂解液中要加各种酶抑制剂,如商品化的 cocktailer。

(2)使用明确的抗体,可以将几种抗体共同使用

(3)使用对照抗体:

单克隆抗体:正常小鼠的IgG或另一类单抗

兔多克隆抗体:正常兔IgG

在免疫共沉淀实验中要保证实验结果的真实性,应注意以下几点:

(1) 确保共沉淀的蛋白是由所加入的抗体沉淀得到的,而并非外源非特异蛋白,单克隆抗体的使用有助于避免污染的发生;

(2) 要确保抗体的特异性,即在不表达抗原的细胞溶解物中添加抗体后不会引起

共沉淀;

(3) 确定蛋白间的相互作用是发生在细胞中,而不是由于细胞的溶解才发生的,这需要进行蛋白质的定位来确定。

范文八:免疫共沉淀(Co-IP)详细步骤教程

免疫共沉淀(Co-IP)详细步骤教程

一、 原理:

免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation)是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。

其原理是:当细胞在非变性条件下被裂解时,完整细胞内存在的许多蛋白质-蛋白质间的相互作用被保留了下来。如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X,那么与X在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。目前多用精制的protein A预先结合固化在argarose的beads上,使之与含有抗原的溶液及抗体反应后,beads上的prorein A就能吸附抗原达到精制的目的。这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合;也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档。

其优点为:(1)相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的,处于天然状态;

(2)蛋白的相互作用是在自然状态下进行的,可以避免人为的影响;

(3)可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物。

缺点为:(1)可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质-蛋白质相互作用;

(2)两种蛋白质的结合可能不是直接结合,而可能有第三者在中间起桥梁作

用;

(3)必须在实验前预测目的蛋白是什么,以选择最后检测的抗体,所以,若

预测不正确,实验就得不到结果,方法本身具有冒险性。

二、准备工作:

预冷PBS,RIPA Buffer,细胞刮子(用保鲜膜包好后,埋冰下),离心机

1. 用预冷的PBS洗涤细胞两次,最后一次吸干PBS;

2. 加入预冷的RIPA Buffer (1ml/107个细胞、10cm培养皿或150cm2培养瓶,0.5ml/5×106个细胞、6cm培养皿、75cm2培养瓶)

3. 用预冷的细胞刮子将细胞从培养皿或培养瓶上刮下,把悬液转到1.5EP管中,4℃,缓慢晃动15min(EP管插冰上,置水平摇床上)

4. 4℃,14000g离心15min,立即将上清转移到一个新的离心管中

5. 准备Protein A agarose,用PBS 洗两遍珠子,然后用PBS配制成50%浓度,建议减掉枪尖部分,避免在涉及琼脂糖珠的操作中破坏琼脂糖珠

6. 每1ml总蛋白中加入100μl Protein A琼脂糖珠(50%),4℃摇晃10min(EP管插冰上,置水平摇床上),以去除非特异性杂蛋白,降低背景

7. 4℃,14000g离心15min,将上清转移到一个新的离心管中,去除Protein A珠子

8. (Bradford 法) 做蛋白标准曲线,测定蛋白浓度,测前将总蛋白至少稀释1:10倍以上,以减少细胞裂解液中去垢剂的影响(定量,分装后,可以在-20℃保存一个月)

9. 用PBS将总蛋白稀释到约1 μg/μl,以降低裂解液中去垢剂的浓度,如果兴趣蛋白在细胞中含量较低,则总蛋白浓度应该稍高(如10 μg/μl)

10. 加入一定体积的兔抗到500μl总蛋白中,抗体的稀释比例因兴趣蛋白在不同细胞系中的多少而异

11. 4℃缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或室温2h,激酶或磷酸酯酶活性分析建议用2 h室温孵育

12. 加入100μl Protein A琼脂糖珠来捕捉抗原抗体复合物,4℃缓慢摇动抗原抗体混合物过

夜或室温1h,如果所用抗体为鼠抗或鸡抗,建议加2 μl"过渡抗体"(兔抗鼠IgG,兔抗鸡IgG)

13. 14000rpm瞬时离心5s,收集琼脂糖珠-抗原抗体复合物,去上清,用预冷的RIPA buffer洗3遍,800μl/遍,RIPA buffer有时候会破坏琼脂糖珠-抗原抗体复合物内部的结合,可以使用PBS

14. 用60μl 2×上样缓冲液将琼脂糖珠-抗原抗体复合物悬起,轻轻混匀,缓冲液的量依据上样多少的需要而定(60 μl足够上三道)

15. 将上样样品煮5min,以游离抗原,抗体,珠子,离心,将上清电泳,收集剩余琼脂糖珠,上清也可以暂时冻-20℃,留待以后电泳,电泳前应再次煮5min变性。

RIPA Buffer配制:

基础成分:

Tris-HCl(缓冲液成分,防止蛋白变性)

NaCl(盐份,防止非特异蛋白聚集)

NP-40(非离子去污剂,提取蛋白;用H2O配制成10%储存液)

去氧胆酸钠(离子去污剂,提取蛋白;用H2O配制成10%储存液;避光保存)

注意:准备激酶(致活酶)实验时,不要加去氧胆酸钠,因为离子型去污剂能够使酶变性,导致活性丧失。

RIPA蛋白酶抑制剂

苯甲基磺酰氟(PMSF)(用异丙醇配制成200mM的储存液,室温保存)

EDTA(钙螯合剂;用H2O配制成100mM的储存液,PH 7.4)

亮抑酶肽(Leupeptin)(用H2O配制成1mg/ml的储存液,分装,-20℃保存)

抑蛋白酶肽(Aprotinin)(用H2O配制成1mg/ml的储存液,分装,-20℃保存)

胃蛋白酶抑制剂(Pepstatin)(用甲醇配制成1mg/ml的储存液,分装,-20℃保存) RIPA磷酸(酯)酶抑制剂

激活的Na3VO4(用H2O配制成200mM的储存液,见Sodium Orthovanadate Activation Protoco)

NaF(200mM的储存液,室温保存)

注意:在准备做磷酸(酯)酶实验的时候,不加磷酸酯酶抑制剂

工作液配制:

配制100ml的modified RIPA buffe:

1. 称取790mg 的Tris-Base,加到75ml 去离子水中,加入900mg的NaCl,搅拌,直到全部溶解,用HCl调节PH值到7.4

2. 加10 ml 10%的NP-40

3. 加2.5 ml 10%的去氧胆酸钠,搅拌,直到溶液澄清

4. 加1 ml 100mM的EDTA,用量筒定容到100ml,2-8℃保存

5. 理论上,蛋白酶和磷酸酯酶抑制剂应该在使用当天同时加入(抑蛋白酶肽,亮抑酶肽,胃蛋白酶抑制剂各100 μl; PMSF, Na3VO4, NaF各500 μl),但是PMSF在水溶液中很不稳定,30分钟就会降解一半,所以PMSF应该在使用前现加,其他抑制剂成分可以在水溶液中稳定5天。

各种成分在工作液中的终浓度:

* Tris-HCl: 50 mM, pH 7.4

* NP-40: 1%

* 去氧胆酸钠:0.25%

* NaCl: 150 mM

* EDTA: 1 mM

* PMSF: 1 mM

* 抑蛋白酶肽,亮抑酶肽,胃蛋白酶抑制剂: 各1 μg/ml

* Na3VO4: 1 mM

* NaF: 1 mM

三、实验流程为:

(1)转染后24-48 h 可收获细胞,加入适量细胞裂解缓冲液(含蛋白酶抑制剂),冰上裂解30min, 细胞裂解液于4°C,最大转速离心30 min后取上清;

(2)取少量裂解液以备Western blot分析,剩余裂解液加1μg相应的抗体加入到细胞裂解液,4°C缓慢摇晃孵育过夜;

(3)取10μl protein A 琼脂糖珠,用适量裂解缓冲液洗3 次,每次3,000 rpm离心3 min;

(4)将预处理过的10μl protein A 琼脂糖珠加入到和抗体孵育过夜的细胞裂解液中4°C缓慢摇晃孵育2-4h,使抗体与protein A琼脂糖珠偶连;

(5)免疫沉淀反应后,在4°C 以3,000 rpm 速度离心3 min,将琼脂糖珠离心至管底;将上清小心吸去,琼脂糖珠用1ml裂解缓冲液洗3-4次;最后加入15μl的2×SDS 上样缓冲液,沸水煮5分钟;

(6)SDS-PAGE, Western blotting或质谱仪分析。通过免疫共沉淀确定结合蛋白

1.用磷酸盐缓冲液洗30块10 cm培养板上的适宜细胞。刮去每块板上的细胞到1 ml冰冷的EBC裂解缓冲液中。

2.将每毫升细胞悬液转移到微量离心管中,在微量离心机上4℃以最大速度离心15 min。

3.收集上清(约30 ml)并加入30μg的适当抗体,4℃摇动免疫沉淀物1 h。

4.加入0.9 ml的蛋白质A-Sepharose 悬液,4℃摇动免疫沉淀物30 min。

5.用含900 mmol/L NaCl的NETN洗蛋白A-Sepharose混合物,再重复洗5次。最后,用NETN洗一次。

6.吸出混合物的液体部分。加入800μl的1×SDS胶加样缓冲液到球珠中,煮沸4 min。

7.将样品加入到大孔的不连续SDS-PAGE梯度胶中,在10 mA的恒定电流下电泳过夜。

8.通过考马斯蓝染色观察蛋白质泳带。

9.从胶上切下目标带,将其放到微量离心管中,用1ml 50%乙腈洗两次,每次3 min。

10. 用胰蛋白酶消化胶中的蛋白质,再将肽电洗脱。

11. 通过窄孔高效液相色谱分离肽。将收集的肽在ABI 477A或494A机器上进行自动Edman降解测序。

四、注意的问题:

(1)细胞裂解采用温和的裂解条件,不能破坏细胞内存在的所有蛋白质-蛋白质相互作用,多采用非离子变性剂(NP40 或Triton X-100)。每种细胞的裂解条件是不一样的,通过经验确定。不能用高浓度的变性剂(0.2%SDS),细胞裂解液中要加各种酶抑制剂,如商品化的 cocktailer。

(2)使用明确的抗体,可以将几种抗体共同使用

(3)使用对照抗体:

单克隆抗体:正常小鼠的IgG或另一类单抗

兔多克隆抗体:正常兔IgG

在免疫共沉淀实验中要保证实验结果的真实性,应注意以下几点:

(1) 确保共沉淀的蛋白是由所加入的抗体沉淀得到的,而并非外源非特异蛋白,单克隆抗体的使用有助于避免污染的发生;

(2) 要确保抗体的特异性,即在不表达抗原的细胞溶解物中添加抗体后不会引起共沉淀;

(3) 确定蛋白间的相互作用是发生在细胞中,而不是由于细胞的溶解才发生的,这需要进行蛋白质的定位来确定

范文九:免疫共沉淀原理及实验方法

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免疫共沉淀原理及实验方法

2007-03-22 16:07:46 大 中 小

免疫共沉淀

一 原理:

IP是利用抗原蛋白质和抗体的特异性结合以及细菌蛋白质的“prorein A"特异性地结合到免疫球蛋白的FC片段的现象活用开发出来的方法。目前多用精制的prorein A预先结合固化在argarose的beads上,使之与含有抗原的溶液及抗体反应后,beads上的prorein A就能吸附抗原达到精制的目的。

实验最需要注意点就是抗体的性质。抗体不同和抗原结合能力也不同,免染能结合未必能用在IP反应。建议仔细检查抗体的说明书。特别是多抗的特异性是问题。

其次,要注意溶解抗原的缓冲液的性质。多数的抗原是细胞构成的蛋白,特别是骨架蛋白,缓冲液必须要使其溶解。为此,必须使用含有强界面活性剂的缓冲液,尽管它有可能影响一部分抗原抗体的结合。另一面,如用弱界面活性剂溶解细胞,就不能充分溶解细胞蛋白。即便溶解也产生与其它的蛋白结合的结果,抗原决定族被封闭,影响与抗体的结合,即使IP成功,也是很多蛋白与抗体共沉的悲惨结果。

再次,为防止蛋白的分解,修饰,溶解抗原的缓冲液必须加蛋白每抑制剂,低温下进行实验。

每次实验之前,首先考虑抗体/缓冲液的比例。抗体过少就不能检出抗原,过多则就不能沉降在beads上,残存在上清。缓冲剂太少则不能溶解抗原,过多则抗原被稀释。欲速则不达,确定好比例很必要。(待续)

二 准备:

器械

#微量高速冷冻离心机

#移液枪

#旋转盘

#电泳设备

#vortex震荡器

#液氮及组织粉碎器

#eppentube

试剂

#细胞或组织

#蛋白定量kit

#SDS电泳试剂

#抗体(单抗时选择protein G,二抗选择抗鼠Ig兔血清)

#PBS

#NaN3

#proteinA sapharose

试剂配制

抗原蛋白溶解缓冲液

1.RIPA缓冲液 (最终浓度)

1MTris-HCL(PH7.4) 5ml (10mM)

5MNacl 15ml (150mM)

0.5M EDTA(PH7.4) 5ml (5mM)

20%TritonX-100 25ml (1%)

10% DOC 50ml (1%)

10%SDS 5ml ( o.1%)

TLCK 18.5mg (0.1mM)

TPCK 35mg (0.2mM)

DDW 395ml

toal 500ml

另外,使用之前加1mMPMSF(PMSF溶在酒精,浓度100mM,-20度遮光保存。注意不易溶于水)

2.NP40 lysis 缓冲液

1MTris-HCL(PH7.4) 5ml (10mM)

5MNacl 15ml (150mM)

0.5M EDTA(PH7.4) 5ml (5mM)

20%NP40 25ml (1%)

TLCK 18.5mg (0.1mM)

TPCK 35mg (0.2mM)

DDW 450ml

toal 500ml

使用前加1mM的PMSF

注意点:

*Tris缓冲剂PH随温度变化,高浓度盐酸滴定时发热,冷却后PH增高。 *反复使用PMSF要注意保管方法。

*1和2的缓冲剂的区别在于界面活性剂。TritonX-100,NP40是非离子界面活性剂,作用温和,,DOC

*两方都有EDTA,对抗原而言,二价离子Mg,Ca等是必要的。根据自己需要调节。EDTA用NaOH滴定。

Protocol

1 调制protein A sapharose

protein A sapharose 5ml 溶于20ml含0.02%NaN3的PBS

离心2000转2分,去上清,在沉淀加0.02%NaN3的PBS,离心后去上清,重复2次,最后沉淀加20ml含0.02%NaN3的PBS,冷藏保存

用单抗做一抗时,把protein A sapharose先用抗鼠Ig兔血清处理(每

50ulprotein A sapharose用1-5ul血清)。旋转1-2h,混匀后,再离心1-2s

去上清后,加PBS,vortex混合,离心去上清,重复二次

加含0.02%NaN3的PBS到原来体积,冷存。避免长期保存。

2.抗原的检出

以下操作全在冰面或4度进行

去除细胞培养液,用冷PBS洗一次。加RIPA,溶解后,转移到eppentube中用vortex混匀。RIPA的量:6cm的培养皿加1 ml(蛋白质的量为500mg/ml),组织块用液氮粉碎,在缓冲剂中捣匀,蛋白定量。

30m,15000rpm离心,上清转移到新tube 。不用移液枪,直接从tube倒进另一个tube

往上清加抗体,1ml加2-5ul抗体,冷室内旋转混匀1h

加protein A sapharose50ul,再混匀1h

5000rpm离心1s,使sapharose沉淀,去上清。往sapharose加RIPA,vortex 混匀,离心,去上清。重复4次洗净。

加电泳用 sample 缓冲液40ul,2m煮沸,泳动后,固定/干燥胶,现像。

3.注意点

A:不熟练使用移液枪,会混入沉淀的不溶性蛋白,使实验失败。对无论怎么也除不去的混入蛋白,只使用上清的上半部,或用超速离心机。

B:对电泳的非特异条带,最后可依次用含300mM,1omMNaCl的RIPA洗净各一次。(完)

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免疫共沉淀原理及实验方法

[SPAN class=java id=text9766]免疫共沉淀[BR]一 原理:[BR]IP是利用抗原蛋白质和抗体的特异性结合

以及细菌蛋白质的“prorein A"特异性地结合到免疫球蛋白的FC片段的现象活用开发出来的方法。目前多用精制的prorein A预先结合固化在argarose的beads上,使之与含有抗原的溶液及抗体反应后,beads上的prorein A就能吸附抗原达到精制的目的。[BR][BR]实验最需要注意点就是抗体的性质。抗体不同和抗原结合能力也不同,免染能结合未必能用在IP反应。建议仔细检查抗体的说明书。特别是多抗的特异性是问题。[BR][BR]其次,要注意溶解抗原的缓冲液的性质。多数的抗原是细胞构成的蛋白,特别是骨架蛋白,缓冲液必须要使其溶解。为此,必须使用含有强界面活性剂的缓冲液,尽管它有可能影响一部分抗原抗体的结合。另一面,如用弱界面活性剂溶解细胞,就不能充分溶解细胞蛋白。即便溶解也产生与其它的蛋白结合的结果,抗原决定族被封闭,影响与抗体的结合,即使IP成功,也是很多蛋白与抗体共沉的悲惨结果。[BR][BR]再次,为防止蛋白的分解,修饰,溶解抗原的缓冲液必须加蛋白每抑制剂,低温下进行实验。[BR][BR]每次实验之前,首先考虑抗体/缓冲液的比例。抗体过少就不能检出抗原,过多则就不能沉降在beads上,残存在上清。缓冲剂太少则不能溶解抗原,过多则抗原被稀释。欲速则不达,确定好比例很必要。(待续)[BR]二 准备:[BR]器械[BR]#微量高速冷冻离心机[BR]#移液枪[BR]#旋转盘[BR]#电泳设备

[BR]#vortex震荡器[BR]#液氮及组织粉碎器[BR]#eppentube[BR]试剂[BR]#细胞或组织[BR]#蛋白定量kit[BR]#SDS电泳试剂[BR]#抗体(单抗时选择protein G,二抗选择抗鼠Ig兔血清)[BR]#PBS[BR]#NaN3[BR]#proteinA sapharose[BR]试剂配制[BR]抗原蛋白溶解缓冲液[BR]1.RIPA缓冲液 (最终浓度)[BR]1MTris-HCL(PH7.4) 5ml (10mM)[BR]5MNacl 15ml (150mM)[BR]0.5M EDTA(PH7.4) 5ml (5mM)[BR]20%TritonX-100 25ml (1%)[BR]10% DOC 50ml (1%)[BR]10%SDS 5ml ( o.1%)[BR]TLCK 18.5mg (0.1mM)[BR]TPCK 35mg (0.2mM)[BR]DDW 395ml[BR]toal 500ml[BR]另外,使用之前加1mMPMSF(PMSF溶在酒精,浓度100mM,-20度遮光保存。注意不易溶于水)[BR]2.NP40 lysis 缓冲液[BR]1MTris-HCL(PH7.4) 5ml (10mM)[BR]5MNacl 15ml (150mM)[BR]0.5M EDTA(PH7.4) 5ml (5mM)[BR]20%NP40 25ml (1%)[BR]TLCK 18.5mg (0.1mM)[BR]TPCK 35mg (0.2mM)[BR]DDW 450ml[BR]toal 500ml[BR]使用前加1mM的PMSF[BR]注意点:

[BR]*Tris缓冲剂PH随温度变化,高浓度盐酸滴定时发热,冷却后PH增高。[BR]*反复使用PMSF要注意保管方法。[BR]*1和2的缓冲剂的区别在于界面活性剂。TritonX-100,NP40是非离子界面活性剂,作用温和,,DOC<SDS是离子性的强活性剂。注意忘记加TritonX-100,只加DOC,SDS,可能使抗体完全失去活性。1的蛋白变性效果强,可能损害抗原/抗体结合,2的作用温和,却可能造成抗原溶解不全。[BR]*两方都有EDTA,对抗原而言,二价离子Mg,Ca等是必要的。根据自己需要调节。EDTA用NaOH滴定。

[BR]Protocol[BR][BR]1 调制protein A sapharose[BR][BR]protein A sapharose 5ml 溶于20ml含0.02%NaN3的PBS[BR][BR]离心2000转2分,去上清,在沉淀加0.02%NaN3的PBS,离心后去上清,重复2次,最后沉淀加20ml含0.02%NaN3的PBS,冷藏保存[BR][BR]用单抗做一抗时,把protein A sapharose先用抗鼠Ig兔血清处理(每50ulprotein A sapharose用1-5ul血清)。旋转1-2h,混匀后,再离心1-2s[BR][BR]去上清后,加PBS,vortex混合,离心去上清,重复二次[BR][BR]加含0.02%NaN3的PBS到原来体积,冷存。避免长期保存。[BR][BR]2.抗原的检出[BR]以下操作全在冰面或4度进行[BR][BR]去除细胞培养液,用冷PBS洗一次。加RIPA,溶解后,转移到eppentube中用vortex混匀。RIPA的量:6cm的培养皿加1 ml(蛋白质的量为500mg/ml),组织块用液氮粉碎,在缓冲剂中捣匀,蛋白定量。[BR][BR]30m,15000rpm离心,上清转移到新tube 。不用移液枪,直接从tube倒进另一个tube[BR][BR]往上清加抗体,1ml加2-5ul抗体,冷室内旋转混匀1h[BR][BR]加protein A sapharose50ul,再混匀1h[BR][BR]5000rpm离心1s,使sapharose沉淀,去上清。往sapharose加RIPA,vortex 混匀,离心,去上清。重复4次洗净。

[BR][BR]加电泳用 sample 缓冲液40ul,2m煮沸,泳动后,固定/干燥胶,现像。[BR][BR]3.注意点[BR]A:不熟练使用移液枪,会混入沉淀的不溶性蛋白,使实验失败。对无论怎么也除不去的混入蛋白,只使用上清的上半部,或用超速离心机。[BR]B:对电泳的非特异条带,最后可依次用含300mM,1omMNaCl的RIPA洗净各一次。(完) [/SPAN][BR]

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4. 免疫共沉淀技术路线(CoIP)

2007-05-07 09:14

准备工作:

预冷PBS,RIPA Buffer,细胞刮子(用保鲜膜包好后,埋冰下),离心机

1. 用预冷的PBS洗涤细胞两次,最后一次吸干PBS;

2. 加入预冷的RIPA Buffer(1ml/107个细胞、10cm培养皿或150cm2培养瓶,0.5ml/5×106个细胞、6cm培养皿、75cm2培养瓶)

3. 用预冷的细胞刮子将细胞从培养皿或培养瓶上刮下,把悬液转到1.5EP管中,4℃,缓慢晃动15min(EP管插冰上,置水平摇床上)

4. 4℃,14000g离心15min,立即将上清转移到一个新的离心管中

5. 准备Protein A agarose,用PBS 洗两遍珠子,然后用PBS配制成50%浓度,建议减掉枪尖部分,避免在涉及琼脂糖珠的操作中破坏琼脂糖珠

6. 每1ml总蛋白中加入100μl Protein A琼脂糖珠(50%),4℃摇晃10min(EP管插冰上,置水平摇床上),以去除非特异性杂蛋白,降低背景

7. 4℃,14000g离心15min,将上清转移到一个新的离心管中,去除Protein A珠子

8. (Bradford 法)做蛋白标准曲线,测定蛋白浓度,测前将总蛋白至少稀释1:10倍以上,以减少细胞裂解液中去垢剂的影响(定量,分装后,可以在-20℃保存一个月)

9. 用PBS将总蛋白稀释到约1 μg/μl,以降低裂解液中去垢剂的浓度,如果兴趣蛋白在细胞中含量较低,则总蛋白浓度应该稍高(如10 μg/μl)

10. 加入一定体积的兔抗到500μl总蛋白中,抗体的稀释比例因兴趣蛋白在不同细胞系中的多少而异

11. 4℃缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或室温2h,激酶或磷酸酯酶活性分析建议用2 h室温孵育

12. 加入100μl Protein A琼脂糖珠来捕捉抗原抗体复合物,4℃缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或室温1h,如果所用抗体为鼠抗或鸡抗,建议加2 μl“过渡抗体”(兔抗鼠IgG,兔抗鸡IgG)

13. 14000rpm瞬时离心5s,收集琼脂糖珠-抗原抗体复合物,去上清,用预冷的RIPA buffer洗3遍,800μl/遍,RIPA buffer有时候会破坏琼脂糖珠-抗原抗体复合物内部的结合,可以使用PBS

14. 用60μl 2×上样缓冲液将琼脂糖珠-抗原抗体复合物悬起,轻轻混匀,缓冲液的量依据上样多少的需要而定(60 μl足够上三道)

15. 将上样样品煮5min,以游离抗原,抗体,珠子,离心,将上清电泳,收集剩余琼脂糖珠,上清也可以暂时冻-20℃,留待以后电泳,电泳前应再次煮5min变性。

RIPA Buffer配制:

基础成分:

Tris-HCl(缓冲液成分,防止蛋白变性)

NaCl(盐份,防止非特异蛋白聚集)

NP-40(非离子去污剂,提取蛋白;用H2O配制成10%储存液)

去氧胆酸钠(离子去污剂,提取蛋白;用H2O配制成10%储存液;避光保存) 注意:准备激酶(致活酶)实验时,不要加去氧胆酸钠,因为离子型去污剂能够使酶变性,导致活性丧失。

RIPA蛋白酶抑制剂

苯甲基磺酰氟(PMSF)(用异丙醇配制成200mM的储存液,室温保存) EDTA(钙螯合剂;用H2O配制成100mM的储存液,PH 7.4)

亮抑酶肽(Leupeptin)(用H2O配制成1mg/ml的储存液,分装,-20℃保存) 抑蛋白酶肽(Aprotinin)(用H2O配制成1mg/ml的储存液,分装,-20℃保存) 胃蛋白酶抑制剂(Pepstatin)(用甲醇配制成1mg/ml的储存液,分装,-20℃保存)

RIPA磷酸(酯)酶抑制剂

激活的Na3VO4(用H2O配制成200mM的储存液,见Sodium Orthovanadate Activation Protoco)

NaF(200mM的储存液,室温保存)

注意:在准备做磷酸(酯)酶实验的时候,不加磷酸酯酶抑制剂

工作液配制:

配制100ml的modified RIPA buffe:

1. 称取790mg 的Tris-Base,加到75ml 去离子水中,加入900mg的NaCl,搅拌,直到全部溶解,用HCl调节PH值到7.4

2. 加10 ml 10%的NP-40

3. 加2.5 ml 10%的去氧胆酸钠,搅拌,直到溶液澄清

4. 加1 ml 100mM的EDTA,用量筒定容到100ml,2-8℃保存

5. 理论上,蛋白酶和磷酸酯酶抑制剂应该在使用当天同时加入(抑蛋白酶肽,亮抑酶肽,胃蛋白酶抑制剂各100 µl; PMSF, Na3VO4, NaF各500 µl),但是PMSF在水溶液中很不稳定,30分钟就会降解一半,所以PMSF应该在使用前现加,其他抑制剂成分可以在水溶液中稳定5天。

各种成分在工作液中的终浓度:

• Tris-HCl: 50 mM, pH 7.4

• NP-40: 1%

• 去氧胆酸钠:0.25%

• NaCl: 150 mM

• EDTA: 1 mM

• PMSF: 1 mM

• 抑蛋白酶肽,亮抑酶肽,胃蛋白酶抑制剂: 各1 µg/ml

• Na3VO4: 1 mM

• NaF: 1 mM

通过免疫共沉淀确定结合蛋白

1.用磷酸盐缓冲液洗30块10 cm培养板上的适宜细胞。刮去每块板上的细胞到1 ml冰冷的EBC裂解缓冲液中。

2.将每毫升细胞悬液转移到微量离心管中,在微量离心机上4℃以最大速度离心15 min。

3.收集上清(约30 ml)并加入30μg的适当抗体,4℃摇动免疫沉淀物1 h。

4.加入0.9 ml的蛋白质A-Sepharose 悬液,4℃摇动免疫沉淀物30 min。

5.用含900 mmol/L NaCl的NETN洗蛋白A-Sepharose混合物,再重复洗5次。最后,用NETN洗一次。

6.吸出混合物的液体部分。加入800μl的1×SDS胶加样缓冲液到球珠中,煮沸4 min。

7.将样品加入到大孔的不连续SDS-PAGE梯度胶中,在10 mA的恒定电流下电泳过夜。

8.通过考马斯蓝染色观察蛋白质泳带。

9.从胶上切下目标带,将其放到微量离心管中,用1ml 50%乙腈洗两次,每次3 min。

10. 用胰蛋白酶消化胶中的蛋白质,再将肽电洗脱。

11. 通过窄孔高效液相色谱分离肽。将收集的肽在ABI 477A或494A机器上进行自动Edman降解测序。

范文十:免疫沉淀原理

免疫沉淀(Immunoprecipitation, IP)原理

IP是利用抗原蛋白质和抗体的特异性结合以及细菌蛋白质的“protein A/G

免疫沉淀实验的操作步骤比较多,同时由于在非变性条件下进行实验,所以要得到一个完美的实验结果,不仅需要高质量的抗体,同时对免疫沉淀体系也需要有严格的控制指标。免疫沉淀实验从:蛋白样品处理;抗体-agarose beads孵育;抗体-agarose beads复合物洗涤到最后的鉴定,每步都非常关键,需要严格控制实验流程中每个关键步骤的质量,才能最终达到你的实验目的。

IP实验步骤

基本实验步骤

(1)收获细胞,加入适量细胞IP裂解缓冲液(含蛋白酶抑制剂),冰上或者4℃裂解30min, 12,000g离心30 min后取上清;

(2) 取少量裂解液以备Western blot分析,剩余裂解液将1μg相应的抗体和10-50 μl protein A/G-beads加入到细胞裂解液,4°C缓慢摇晃孵育过夜;

(3)免疫沉淀反应后,在4°C 以3,000 g速度离心5 min,将protein A/G-beads离心至管底;将上清小心吸去,protein A/G-beads用1ml裂解缓冲液洗3-4次;最后加入15μl的2×SDS 加样缓冲液,沸水煮10分钟;

(4)SDS-PAGE, Western blotting或进行质谱分析。一、 样品处理:

免疫沉淀实验成功与否,第一步处理样品非常关键。免疫沉淀实验本质上是处于天然构象状态的抗原和抗体之间的反应,而样品处理的质量决定了抗原抗体反应中的抗原的质量,浓度以及抗原是否处于天然构象状态。所以制备高质量的样品以用于后续的抗体-agarose beads孵育对免疫沉淀实验是否成功非常关键。在这个环节中,除了要控制所有操作尽量在冰上或者4°完成外,最为关键的是裂解液的成份。

用于免疫沉淀实验的样品一般是原代培养细胞裂解液或者细胞系裂解液。我们以常用的RIPA裂解液为例(主要含有pH7.4左右的离子缓冲液,接近生理浓度下的NaCl,一定比例的去垢剂和甘油以及各类蛋白酶抑制剂等)来说明其各主要成份的用途,进而帮助我们如何针对不同的实验目的和不同的蛋白质特性来选择最佳的裂解液。

a. 缓冲液:离子缓冲液常采用pH7.4的Hepes或者Tris-Cl。

b. NaCl浓度一般习惯用150 mM,这主要是因为150 mM接近生理浓度,不会破坏蛋白质之间的相互作用。然而细胞内部的NaCl浓度并不是均一的,局部NaCl的浓度可以低到50 mM,150 mM的NaCl有可能会破坏这个区域的蛋白质相互作用。因此裂解液配方最佳的NaCl浓度要视所分析的蛋白的亚细胞定位而定。

c. 甘油由于其粘性,可以对蛋白质之间的相互作用起到一个很好的保护作用。一般添加10%的甘油有助于稳定蛋白质之间的相互作用。

d. 裂解液中的去垢剂可以裂解细胞质膜,也同时破坏了许多细胞器的膜,从而释放了其中储存的许多蛋白酶。而由于用于免疫沉淀实验的去垢剂作用比较温和,因此蛋白酶的活性大部分得以保存。还有一部分蛋白酶来自胞质中,主要由于其抑制蛋白或者其活性抑制环境受到改变后从而恢复了蛋白酶活性。因此,添加蛋白酶抑制剂对于防止目的蛋白的降解从而完成免疫沉淀实验非常关键。一般主要通过添加EDTA抑制金属蛋白酶,通过Protease Cocktail(多种蛋白酶抑制剂混合物)可以抑制蛋白酶。

e. 去垢剂对于免疫沉淀实验尤其是免疫共沉淀实验是一个非常关键的因素。不同的去垢剂种类和不同的去垢剂浓度主要通过影响以下三个因素来影响免疫沉淀效果:

- 细胞质/器膜的通透性:因为许多目的蛋白都定位在细胞器中,所以必须先将这些蛋白释放出来,抗体才能与之反应。

- 膜蛋白的释放:许多膜蛋白的构象对去垢剂种类和浓度非常敏感,因此针对这类蛋白的免疫沉淀实验,需要谨慎地尝试多种去垢剂以及不同浓度。

- 蛋白相互作用:不同去垢剂对不同性质的蛋白质的相互作用影响程度不一样,需要根据具体蛋白的特性进行分析选择去垢剂种类和浓度。而由于何种去垢剂适应作用于何种蛋白质现在很难精准预测,所以一个更为切实可行的办法就是通过具体实验筛选合适的去垢剂种类和浓度。

二、 抗体-agarose beads孵育

裂解细胞,离心并去除不可溶的膜组份后,上清可以储存在-80°保存3个月,但最好能够使用新鲜制备的细胞裂解液上清去进行抗体-agarose beads孵育实验。抗体可以先加入上清中与样品孵育数小时后再加入Protein A或者G beads孵育过夜,也可以同时加入抗体和Protein A或者G beads孵育过夜。一般选择1mg总蛋白(1mg/ml)对应添加1 ug抗体,最高可以添加至5 ug抗体,过多的抗体会产生假阳性。这个步骤中关键因素在于选择合适的阴性对照。一般选用加同样量的IgG,但更为妥当的方法是选择针对胞内其它无关目的蛋白的一抗做对照。例如,做膜蛋白A的免疫沉淀,选择膜蛋白B来做阴性对照,只要确认二者之间没有相互作用;而做胞质可溶性蛋白C的免疫沉淀,则选择另外一个可溶性蛋白D来做阴性对照。同时,为避免Protein A或者G beads有(非)特异性吸附从而造成免疫沉淀实验结果的假阳性,一般在加入目的蛋白抗体之前,预先将Protein A或者G beads与细胞裂解液孵育数小时,然后取上清用于后续的抗体-agarose beads孵育。

同时,Protein A或者G beads对不同类型的抗体亲和力不同,结合一抗的种属和Ig亚型,选择合适的Protein A或者G beads也是决定免疫沉淀实验成功与否的一个重要因素。一般推荐使用Protein A和Protein G beads的混合物,这样可以达到最佳实验效果,而且省去了许多选择

的烦恼。三、 抗体-agarose beads复合物洗涤:

除了选择特异性好的抗体以及选择合适的阴性对照外,去除免疫沉淀实验非特异性的一个办法是对抗体-agarose beads复合物进行多次洗涤。一般洗涤缓冲液使用和裂解液一样的配方,但去除甘油,以减少由于甘油的粘性带来的非特异性吸附。针对不同的实验要求,还可以通过更改NaCl的浓度以及去垢剂的比例,种类来达到去除非特异性吸附的效果。例如,针对单纯的免疫沉淀而非免疫共沉淀实验或者虽然是进行免疫共沉淀实验,但蛋白质之间的结合比较牢靠,可以考虑使用低浓度(0.2-0.5%)的SDS洗涤抗体-agarose beads复合物,这样可以去除绝大部分非特异性相互作用。四、 鉴定

免疫沉淀实验用途非常广泛(见IP: Q&A),而且基于最基本的免疫沉淀实验衍生出了许多免疫沉淀相关实验手段(比如免疫共沉淀,染色质免疫沉淀和RNA-蛋白免疫沉淀),因此,免疫沉淀实验的鉴定方法主要视实验目的而定。

我们在本手册中主要简单概述常见的免疫沉淀之后的WB检测需要注意的实验环节。由于免疫沉淀实验使用目的蛋白抗体加Protein A/G beads与样品孵育,因此在最后离心获得抗体-agarose beads复合物后,eppendorf管中主要含有抗体,目的蛋白,Protein A/G beads以及一些其它非特异性作用蛋白。其中,抗体和目的蛋白以及Protein A/G beads三者之间是以非共价健结合在一起,只有Protein A/G与agarose beads是共价结合在一起的。因此,最后经过添加含巯基乙醇的加样缓冲液以及煮沸变性并离心出去Protein A/G beads后,eppendorf管只有抗体和目的蛋白以及少量非特异性吸附蛋白。这样SDS-PAGE中就含有目的蛋白和抗体二种蛋白,由于加样缓冲液中含有巯基乙醇从而导致抗体的重链与轻链之间的二硫键被破坏从而使得抗体分子变成重链分子(55KD)和轻链分子(25KD)。因此,WB显色反应中除了能检测到目的蛋白外,如果所使用的二抗与用于免疫沉淀实验的抗体分子属于同一种属的话,还能检测到重链和轻链分子。通常用于免疫沉淀的抗体量非常大(1ug),所以当目的蛋白的大小接近重链或者轻链分子时,重链或者轻链分子的WB信号常常由于信号过强而导致影响对目的蛋白的WB结果判断。 针对上述情况,通常有二种解决办法:

a. 选择不同种属的抗体分别进行免疫沉淀实验和WB实验,这样再选择一个种属交叉反应比较弱或者无种属交叉反应的二抗进行WB实验,就可以大大减弱重链和轻链分子的WB信号。

b. 使用交联剂将抗体和Protein A/G beads交联,然后通过添加不含巯基乙醇的加样缓冲液处理目的蛋白-抗体-agarose beads复合物,最后离心去除抗体-agarose beads复合物,上清中只留下目的蛋白。

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