免疫共沉淀实验步骤

范文一:免疫共沉淀Co-IP实验操作步骤

免疫共沉淀Co-IP实验操作步骤

一、原理:

免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation)是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。其原理是:当细胞在非变性条件下被裂解时,完整细胞内存在的许多蛋白质-蛋白质间的相互作用被保留了下来。如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X,那么与X在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。目前多用精制的prorein A预先结合固化在argarose的beads上,使之与含有抗原的溶液及抗体反应后,beads上的prorein A就能吸附抗原达到精制的目的。这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合;也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档。

其优点为:(1)相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的,处于天然状态;(2)蛋白的相互作用是在自然状态下进行的,可以避免人为的影响;(3)可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物。缺点为:(1)可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质-蛋白质相互作用;(2)两种蛋白质的结合可能不是直接结合,而可能有第三者在中间起桥梁作用;

(3)必须在实验前预测目的蛋白是什么,以选择最后检测的抗体,所以,若预测不正确,实验就得不到结果,方法本身具有冒险性。

二、准备工作:

预冷PBS,RIPA Buffer,细胞刮子(用保鲜膜包好后,埋冰下),离心机

1. 用预冷的PBS洗涤细胞两次,最后一次吸干PBS;

2. 加入预冷的RIPA Buffer(1ml/107个细胞、10cm培养皿或150cm2培养瓶,

0.5ml/5×106个细胞、6cm培养皿、75cm2培养瓶)

3. 用预冷的细胞刮子将细胞从培养皿或培养瓶上刮下,把悬液转到1.5EP管中,4℃,缓慢晃动15min(EP管插冰上,置水平摇床上)

4. 4℃,14000g离心15min,立即将上清转移到一个新的离心管中

5. 准备Protein A agarose,用PBS 洗两遍珠子,然后用PBS配制成50%浓度,建议减掉枪尖部分,避免在涉及琼脂糖珠的操作中破坏琼脂糖珠

6. 每1ml总蛋白中加入100μl Protein A琼脂糖珠(50%),4℃摇晃10min(EP管插冰上,置水平摇床上),以去除非特异性杂蛋白,降低背景

7. 4℃,14000g离心15min,将上清转移到一个新的离心管中,去除Protein A珠子

8. (Bradford 法)做蛋白标准曲线,测定蛋白浓度,测前将总蛋白至少稀释1:10倍以上,以减少细胞裂解液中去垢剂的影响(定量,分装后,可以在-20℃保存一个月)

9. 用PBS将总蛋白稀释到约1 μg/μl,以降低裂解液中去垢剂的浓度,如果兴趣蛋白在细胞中含量较低,则总蛋白浓度应该稍高(如10 μg/μl)

10. 加入一定体积的兔抗到500μl总蛋白中,抗体的稀释比例因兴趣蛋白在不同细胞系中的多少而异

11. 4℃缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或室温2h,激酶或磷酸酯酶活性分析建议用2 h室温孵育

12. 加入100μl Protein A琼脂糖珠来捕捉抗原抗体复合物,4℃缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或室温1h,如果所用抗体为鼠抗或鸡抗,建议加2 μl

13. 14000rpm瞬时离心5s,收集琼脂糖珠-抗原抗体复合物,去上清,用预冷的RIPA buffer洗3遍,800μl/遍,RIPA buffer有时候会破坏琼脂糖珠-抗原抗体复合物内部的结合,可以使用PBS

14. 用60μl 2×上样缓冲液将琼脂糖珠-抗原抗体复合物悬起,轻轻混匀,缓冲液的量依据上样多少的需要而定(60 μl足够上三道)

15. 将上样样品煮5min,以游离抗原,抗体,珠子,离心,将上清电泳,收集剩余琼脂糖珠,上清也可以暂时冻-20℃,留待以后电泳,电泳前应再次煮5min变性。

RIPA Buffer配制:

基础成分:

Tris-HCl(缓冲液成分,防止蛋白变性)

NaCl(盐份,防止非特异蛋白聚集)

NP-40(非离子去污剂,提取蛋白;用H2O配制成10%储存液)

去氧胆酸钠(离子去污剂,提取蛋白;用H2O配制成10%储存液;避光保存)

注意:准备激酶(致活酶)实验时,不要加去氧胆酸钠,因为离子型去污剂能够使酶变性,导致活性丧失。

RIPA蛋白酶抑制剂

苯甲基磺酰氟(PMSF)(用异丙醇配制成200mM的储存液,室温保存) EDTA(钙螯合剂;用H2O配制成100mM的储存液,PH 7.4)

亮抑酶肽(Leupeptin)(用H2O配制成1mg/ml的储存液,分装,-20℃保存) 抑蛋白酶肽(Aprotinin)(用H2O配制成1mg/ml的储存液,分装,-20℃保存) 胃蛋白酶抑制剂(Pepstatin)(用甲醇配制成1mg/ml的储存液,分装,-20℃保存) RIPA磷酸(酯)酶抑制剂

激活的Na3VO4(用H2O配制成200mM的储存液,见Sodium Orthovanadate Activation Protoco)

NaF(200mM的储存液,室温保存)

范文二:免疫共沉淀原理及步骤

免疫共沉淀原理及步骤

免疫沉淀(Immunoprecipitation, IP)原理

IP是利用抗原蛋白质和抗体的特异性结合以及细菌蛋白质的“protein A/G"特异性地结合到抗体(免疫球蛋白)的FC片段的现象开发出来的方法。目前多用protein A/G预先结合在argarose beads上,使之与含有抗原的溶液及抗体反应后,beads上的prorein A/G就能达到吸附抗原的目的。通过低速离心,可以从含有目的抗原的溶液中将目的抗原与其它抗原分离。

免疫沉淀实验的操作步骤比较多,同时由于在非变性条件下进行实验,所以要得到一个完美的实验结果,不仅需要高质量的抗体,同时对免疫沉淀体系也需要有严格的控制指标。免疫沉淀实验从:蛋白样品处理;抗体-agarose beads孵育;抗体-agarose beads复合物洗涤到最后的鉴定,每步都非常关键,需要严格控制实验流程中每个关键步骤的质量,才能最终达到你的实验目的。

IP实验步骤

基本实验步骤

(1)收获细胞,加入适量细胞IP裂解缓冲液(含蛋白酶抑制剂),冰上或者4℃裂解30min, 12,000g离心30 min后取上清;

(2) 取少量裂解液以备Western blot分析,剩余裂解液将1μg相应的抗体和10-50 μl protein A/G-beads加入到细胞裂解液,4°C缓慢摇晃孵育过夜;

(3)免疫沉淀反应后,在4°C 以3,000 g速度离心5 min,将protein A/G-beads离心至管底;将上清小心吸去,protein A/G-beads用1ml裂解缓冲液洗3-4次;最后加入15μl的2×SDS 加样缓冲液,沸水煮10分钟;

(4)SDS-PAGE, Western blotting或进行质谱分析。一、 样品处理:

免疫沉淀实验成功与否,第一步处理样品非常关键。免疫沉淀实验本质上是处于天然构象状态的抗原和抗体之间的反应,而样品处理的质量决定了抗原抗体反应中的抗原的质量,

浓度以及抗原

是否处于天然构象状态。所以制备高质量的样品以用于后续的抗体-agarose beads孵育对免疫沉淀实验是否成功非常关键。在这个环节中,除了要控制所有操作尽量在冰上或者4°完成外,最为关键的是裂解液的成份。

用于免疫沉淀实验的样品一般是原代培养细胞裂解液或者细胞系裂解液。我们以常用的RIPA裂解液为例(主要含有pH7.4左右的离子缓冲液,接近生理浓度下的NaCl,一定比例的去垢剂和甘油以及各类蛋白酶抑制剂等)来说明其各主要成份的用途,进而帮助我们如何针对不同的实验目的和不同的蛋白质特性来选择最佳的裂解液。

a. 缓冲液:离子缓冲液常采用pH7.4的Hepes或者Tris-Cl。

b. NaCl浓度一般习惯用150 mM,这主要是因为150 mM接近生理浓度,不会破坏蛋白质之间的相互作用。然而细胞内部的NaCl浓度并不是均一的,局部NaCl的浓度可以低到50 mM,150 mM的NaCl有可能会破坏这个区域的蛋白质相互作用。因此裂解液配方最佳的NaCl浓度要视所分析的蛋白的亚细胞定位而定。

c. 甘油由于其粘性,可以对蛋白质之间的相互作用起到一个很好的保护作用。一般添加10%的甘油有助于稳定蛋白质之间的相互作用。

d. 裂解液中的去垢剂可以裂解细胞质膜,也同时破坏了许多细胞器的膜,从而释放了其中储存的许多蛋白酶。而由于用于免疫沉淀实验的去垢剂作用比较温和,因此蛋白酶的活性大部分得以保存。还有一部分蛋白酶来自胞质中,主要由于其抑制蛋白或者其活性抑制环境受到改变后从而恢复了蛋白酶活性。因此,添加蛋白酶抑制剂对于防止目的蛋白的降解从而完成免疫沉淀实验非常关键。一般主要通过添加EDTA抑制金属蛋白酶,通过Protease Cocktail(多种蛋白酶抑制剂混合物)可以抑制蛋白酶。

e. 去垢剂对于免疫沉淀实验尤其是免疫共沉淀实验是一个非常关键的因素。不同的去垢剂种类和不同的去垢剂浓度主要通过影响以下三个因素来影响免疫沉淀效果:

- 细胞质/器膜的通透性:因为许多目的蛋白都定位在细胞器中,所以必须先将这些蛋白释放出来,抗体才能与之反应。

- 膜蛋白的释放:许多膜蛋白的构象对去垢剂种类和浓度非常敏感,因此针对这类蛋白的免疫沉淀实验,需要谨慎地尝试多种去垢剂以及不同浓度。

- 蛋白相互作用:不同去垢剂对不同性质的蛋白质的相互作用影响程度不一样,需要根据具体蛋白的特性进行分析选择去垢剂种类和浓度。而由于何种去垢剂适应作用于何种蛋白质现在很难精准预测,所以一个更为切实可行的办法就是通过具体实验筛选合适的去垢剂种类和浓度。

二、 抗体-agarose beads孵育

裂解细胞,离心并去除不可溶的膜组份后,上清可以储存在-80°保存3个月,但最好能够使用新鲜制备的细胞裂解液上清去进行抗体-agarose beads孵育实验。抗体可以先加入上清中与样品孵育数小时后再加入Protein A或者G beads孵育过夜,也可以同时加入抗体和Protein A或者G beads孵育过夜。一般选择1mg总蛋白(1mg/ml)对应添加1 ug抗体,最高可以添加至5 ug抗体,过多的抗体会产生假阳性。这个步骤中关键因素在于选择合适的阴性对照。一般选用加同样量的IgG,但更为妥当的方法是选择针对胞内其它无关目的蛋白的一抗做对照。例如,做膜蛋白A的免疫沉淀,选择膜蛋白B来做阴性对照,只要确认二者之间没有相互作用;而做胞质可溶性蛋白C的免疫沉淀,则选择另外一个可溶性蛋白D来做阴性对照。同时,为避免Protein A或者G beads有(非)特异性吸附从而造成免疫沉淀实验结果的假阳性,一般在加入目的蛋白抗体之前,预先将Protein A或者G beads与细胞裂解液孵育数小时,然后取上清用于后续的抗体-agarose beads孵育。

同时,Protein A或者G beads对不同类型的抗体亲和力不同,结合一抗的种属和Ig亚型,选择合适的Protein A或者G beads也是决定免疫沉淀实验成功与否的一个重要因素。一般推荐使用Protein A和Protein G beads的混合物,这样可以达到最佳实验效果,而且省去了许多选择的烦恼。三、 抗体-agarose beads复合物洗涤:

除了选择特异性好的抗体以及选择合适的阴性对照外,去除免疫沉淀实验非特异性的一个办法是对抗体-agarose beads复合物进行多次洗涤。一般洗涤缓冲液使用和裂解液一样的配方,但去除甘油,以减少由于甘油的粘性带来的非特异性吸附。针对不同的实验要求,还可以通过更改NaCl的浓度以及去垢剂的比例,种类来达到去除非特异性吸附的效果。例如,针对单纯的免疫沉淀而非免疫共沉淀实验或者虽然是进行免疫共沉淀实验,但蛋白质之间的结合比较牢靠,可以考虑使用低浓度(0.2-0.5%)的SDS洗涤抗体-agarose beads复合物,这样可以去除绝大部分非特异性相互作用。四、 鉴定

免疫沉淀实验用途非常广泛(见IP: Q&A),而且基于最基本的免疫沉淀实验衍生出了许多免疫沉淀相关实验手段(比如免疫共沉淀,染色质免疫沉淀和RNA-蛋白免疫沉淀),因此,免疫沉淀实验的鉴定方法主要视实验目的而定。

我们在本手册中主要简单概述常见的免疫沉淀之后的WB检测需要注意的实验环节。由于免疫沉淀实验使用目的蛋白抗体加Protein A/G beads与样品孵育,因此在最后离心获得抗体-agarose beads复合物后,eppendorf管中主要含有抗体,目的蛋白,Protein A/G beads以及一些其它非特异性作用蛋白。其中,抗体和目的蛋白以及Protein A/G beads三者之间是以非共价健结合在一起,只有Protein A/G与agarose beads是共价结合在一起的。因此,最后经过添加含巯基乙醇的加样缓冲液以及煮沸变性并离心出去Protein A/G beads后,eppendorf管只有抗体和目的蛋白以及少量非特异性吸附蛋白。这样SDS-PAGE中就含有目的蛋白和抗体二种蛋白,由于加样缓冲液中含有巯基乙醇从而导致抗体的重链与轻链之间的二硫键被破坏从而使得抗体分子变成重链分子(55KD)和轻链分子(25KD)。因此,WB显色反应中除了能检测到目的蛋白外,如果所使用的二抗与用于免疫沉淀实验的抗体分子属于同一种属的话,还能检测到重链和轻链分子。通常用于免疫沉淀的抗体量非常大(1ug),所以当目的蛋白的大小接近重链或者轻链分子时,重链或者轻链分子的WB信号常常由于信号过强而导致影响对目的蛋白的WB结果判断。

针对上述情况,通常有二种解决办法:

a. 选择不同种属的抗体分别进行免疫沉淀实验和WB实验,这样再选择一个种属交叉反应比较弱或者无种属交叉反应的二抗进行WB实验,就可以大大减弱重链和轻链分子的WB信号。

b. 使用交联剂将抗体和Protein A/G beads交联,然后通过添加不含巯基乙醇的加样缓冲液处理目的蛋白-抗体-agarose beads复合物,最后离心去除抗体-agarose beads复合物,上清中只留下目的蛋白。

免疫共沉淀 免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation)是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。 其原理是:当细胞在非变性条件下被裂解时,完整细胞内存在的许多蛋白质-蛋白质间的相互作用被保留了下来。如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X,那么与X在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合;也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档。

其优点为:(1)相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的,处于天然状态;(2)蛋白的相互作用是在自然状态下进行的,可以避免人为的影响;(3)可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物。缺点为:(1)可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质-蛋白质相互作用;(2)两种蛋白质的结合可能不是直接结合,而可能有第三者在中间起桥梁作用; (3)必须在实验前预测目的蛋白是什么,以选择最后检测的抗体,所以,若预测不正确,实验就得不到结果,方法本身具有冒险性。

实验流程为:

(1)转染后24-48 h 可收获细胞,加入适量细胞裂解缓冲液(含蛋白酶抑制剂),冰上裂解30min, 细胞裂解液于4°C, 最大转速离心30 min后取上清;

(2)取少量裂解液以备Western blot分析,剩余裂解液加1μg相应的抗体加入到细胞裂解液,4°C缓慢摇晃孵育过夜;

(3)取10μl protein A 琼脂糖珠,用适量裂解缓冲液洗3 次,每次3,000 rpm离心3 min;

(4)将预处理过的10μl protein A 琼脂糖珠加入到和抗体孵育过夜的细胞裂解液中4°C缓慢摇晃孵育2-4h,使抗体与protein A琼脂糖珠偶连;

(5)免疫沉淀反应后,在4°C 以3,000 rpm 速度离心3 min,将琼脂糖珠离心至管底;将上清小心吸去,琼脂糖珠用1ml裂解缓冲液洗3-4次;最后加入15μl的2×SDS 上样缓冲液,沸水煮5分钟;

(6)SDS-PAGE, Western blotting或质谱仪分析。

注意的问题:

(1)细胞裂解采用温和的裂解条件,不能破坏细胞内存在的所有蛋白质-蛋白质相互作用,多采用非离子变性剂(NP40或Triton X-100)。每种细胞的裂解条件是不一样的,通过经验确定。不能用高浓度的变性剂(0.2%SDS),细胞裂解液中要加各种酶抑制剂,如商品化的cocktailer。

(2)使用明确的抗体,可以将几种抗体共同使用

(3)使用对照抗体:

单克隆抗体:正常小鼠的IgG或另一类单抗

兔多克隆抗体:正常兔IgG

在免疫共沉淀实验中要保证实验结果的真实性,应注意以下几点:

(1) 确保共沉淀的蛋白是由所加入的抗体沉淀得到的,而并非外源非特异蛋白,单克隆抗体的使用有助于避免污染的发生;

(2) 要确保抗体的特异性,即在不表达抗原的细胞溶解物中添加抗体后不会引起共沉淀;

(3) 确定蛋白间的相互作用是发生在细胞中,而不是由于细胞的溶解才发生的,这需要进行蛋白质的定位来确定。

ChIP是个很郁闷的实验,时间花费N长,如果做的不好非常打击人,我也谈不上什么成功经验呢

1)显然抗体来源要可靠,很多在WB上很好的商业化抗体并不能成功使用到ChIP上。

2)超声处理要充分,处理完呢以后DNA一定要跑胶检测看看,如果片段都很大,结果受到的影响很大,特别是如果ChIP组蛋白

范文三:免疫共沉淀步骤-磁珠

一、细胞裂解

1、转染后24-48 h收获细胞,用冷的PBS(4°C)洗细胞三次,最后一次吸干PBS;

2、加入适量(500μl)预冷的细胞裂解缓冲液(含蛋白酶抑制剂),冰上裂解30min;

3、用预冷的细胞刮将细胞从培养瓶上刮下,将裂解液收集到1.5mlEP管中,4°C、最大转速(14000rpm)离心30 min后取上清;

4、取少量(20μl)裂解液以备western blotting分析;

二、准备磁珠

5、将Dynabeads完全重悬;

6、吸取50μl(1.5mg)Dynabeads到一个EP管中;(准备两份,一份结合抗体,一份去除非特异性蛋白)

7、将EP管放在磁力架上,将Dynabeads从溶液中分离出来,吸去上清;

8、再用预冷的lysis buffer 500μl洗三次,每次都用磁力架将Dynabeads分离出来,最后将EP管从磁力架上取下来;

三、结合抗体

9、取10μl的Antibody(Ab),加入到准备好Dynabeads的EP管中; 10、4°C旋转、孵育5h;

11、将EP管放在磁力架上,把Dynabeads-Ab复合物从溶液中分离出来,吸去上清;

12、用冷的lysis buffer 1000μl洗三次,最后一次尽量吸尽上清,再加入25μl的lysis buffer和0.2μl的10%叠氮化钠;

四、免疫共沉淀

13、在裂解好的细胞样品500μl(步骤3)中加入Dynabeads(步骤6)25μl中,4°C旋转2h(去除非特异性蛋白);

14、将EP管放在磁力架上,收集上清;

15、将上清加入预处理的Dynabeads-Ab复合物中,轻轻重悬Dynabeads-Abs复合物;

16、4°C旋转、孵育2h,让Ag与Dynabeads-Abs复合物结合;

17、将EP管置于磁力架上,转移上清到一个新的EP管中,以备需要时进一步分析;

18、用1000μl的lysis buffer洗Dynabeads-Ab-Ag复合物三次,每次清洗后在磁力架上分离,移去上清,再温柔地重悬复合物;(Avoid co-elution of proteins bound to the tube wall)

四、洗脱目标蛋白

19、将EP管放在磁力架上,吸去上清;

20、加入20μl的2×SDS 上样缓冲液,轻轻重悬Dynabeads-Ab-Ag复合物; 21、50°C加热10min;

22、将EP管放在磁力架上,取上清作为样品,SDS-PAGE电泳。

范文四:生物实验免疫共沉淀

完成《WB实战指南》后,朋友曾央分享点免疫共沉淀方面的咚咚;当时不得不回绝。因为,WB指南是基于这些年的回复的汇总,基本上方方面面的问题都有提及,只需要做些串联;而论及coIP,目前在国内还不太普及,尽管它已经是生化领域最基本的技术之一。因此,再想写这么个长篇颇耗时间,于我的时间和精力太为难;不过,今天是个特殊的日子,凑凑热闹吧。——人,如果在某些方面成功了,必然在另外一面有亏欠,也许这就是上帝的公允吧。——在自己最擅长的地方找点成功的感觉吧,当然我的失败也只是因为没有更多的时间。。。哎!扯远了

玩coIP也玩了5年多了,因为上手就是最难的B蛋白结合量多少的变化(假定IP A蛋白)而非检测B蛋白的有无,说句吹牛皮的话,在我们这个小领域三家最强的lab唯有我们敢于通篇基于这种检测手段,所以,对于coIP算是非常得有心得了。以下论述基于最难的B蛋白结合水平变化的检测,所以部分实验操作非常苛求;学会这个,其他就是小菜了;所以,这也算一个进阶篇。

一.样品的制备。

如《WB指南》,在这里我最强调从制备样品开始的一致性。如果不触及细胞的凋亡或死亡,那么任何处理组样品和ctrl最后的终体积应该保持一致;如果细胞有大量凋亡或死亡,可以通过比对标准体积对样品的体积粗略定量后再加裂解液,一般可以把误差控制在WB的检出范围以下,基本保持样品的均一;组织样品可以通过称重添加相应体积比的裂解液。 裂解液的配方可以采用《WB指南》里给出的,原配方如下:20mM Tris/HCl, pH7.6, 100mM NaCl, 20mM KCl, 1.5mM MgCl2, 0.5% NP-40 and protease inhibitors(0.5M PMSF) 此裂解缓冲液裂解条件相对温和,适合后续的coIP分析。

“不过”用它做coIP有明显的缺陷;

要理解此配方的缺陷,我们先聊聊如何在coIP实验中“作伪”。

伪造结果,也分为单纯性造假和技术型伪造。撇去前者,从技巧上来讲,如果要想获得设定、预想的相互作用结果,可以从几个角度着手——此类结果可重复。

a.在低盐离子裂解液中进行IP。

很多蛋白复合体对盐浓度敏感,但敏感性有强弱之别。通常来说,真实存在着的蛋白复合体能耐受生理盐(0.15M)或更高浓度,即在生理盐浓度下不会解体。具体如,某种CDK和Cyclin其牢固程度能耐受0.8-1.0M以上的高盐而不解体,即使其抑制蛋白CKI能耐受0.6M以上高盐。因此,了解一个蛋白复合体对盐浓度的耐受,既是一个帮助判断蛋白复合体是否真实存在的一个重要依据,更是一个非常重要的生化数据;对某些体外生化反应的蛋白原料的纯化制备也是很重要的辅助依据。例如,纯化有生物活性的CDK和Cyclin,如果采用盐浓度漂洗,则最低需0.6M以上以解离CKI。所以,在生化领域的coIP分析中,很多实验体系的盐浓度是比生理盐浓度更高的。当然,不排除某些弱相互作用需要生理盐浓度,但这种情况不多见;也容易跟瞬时的相互作用混淆,某些实验中的弱相互作用实际是由于生化反应的瞬时性,且缺乏有效的截留、富集手段,诸如酶和底物。

很多非生化领域的,喜欢在生理盐或更低盐浓度下进行coIP,这大大增加了假阳性的几率——很多蛋白间非特异性的黏粘被记录下来。这也成为了获得“设定的”相互作用的有效手段。 b.过表达。

现在已经存世的相当多的实验论文和数据,其蛋白复合体相互作用的数据是通过过表达,甚至原核GST pulldown获得的;笔者认为,在阅读这类文献时,大家要特别小心,多长一个心眼——即始终抱怀疑的态度。并非说一定不可取,但是有一点很明确,这样的数据送到我们手里,首先我们会要求对方补充内源性蛋白相互作用的证据,否则该结果一律不采信。 在《WB指南》里面我提过,血清中丰富的BSA可以被任意抗体识别(其实也是一种相互作用),那么同理高丰度的两种或多种蛋白人为拼凑到一起,为什么不可以非特异性的黏粘

或者发生弱的相互作用呢?

因此,如果想要“特定”的相互作用,可以考虑过表达所有的蛋白,就是核蛋白结合胞浆蛋白甚至膜表面受体也不稀奇。

c.不添加NP40一类表面活性剂,削弱对非特异性结合的拮抗。

NP40除可以在膜上穿孔外,也可以有效的拮抗非特异性的蛋白相互作用,提高coIP的特异性。因此,减少或不添加NP40也可以辅助“预期”目的。

实际上,掌握a、b两点技巧,基本上可以“无往而不胜”——彻底搞定一切“想要的”相互作用。 基于以上的原因,如果想获得切实可靠的相互作用数据,那么裂解液的选取相当讲究。

1.首先盐浓度至少0.15M或以上。

盐浓度主要指Na盐浓度。有人会问为什么不是钾盐?因为钾盐会更容易跟某些试剂(或离子)形成沉淀,诸如SDS,因此在某些情况下,钾盐会对后续的某些实验带来未知的麻烦,所以一般盐浓度指Na盐。盐浓度过低对某些与染色体结合较牢的蛋白的抽提(非破膜的温和裂解)效率也较差,可能会丢失部分信息;而盐浓度过高又会造成某些相互作用较弱的复合体解体,因此,通常选择0.15——0.3M做细胞裂解。纯化蛋白通常选取0.6M以上进行IP。

小技巧:最初几遍的漂洗buff要和IP时的盐浓度相同。经验上,纯化蛋白时,若用低盐裂解细胞、高盐漂洗去杂质,蛋白丢失较多;所以,一般如前所述。当然,也可以高盐裂解低盐漂洗,但是对除杂质不利。

2.通常IP体系中NP40含量0.2——0.5%。NP40在0.5——1.0%时,染色体很容易析出(很黏,成胶状会裹住beads,同时粘下很多蛋白),用这样的裂解液破碎细胞则可能需要超声。通常由于习惯上避免增加不必要的操作,所以在非必要的情况下,选择前述的浓度区间。

3.可适当添加EDTA,螯合金属离子保护DNA和蛋白。特殊情况下还可选择添加EGTA,螯合Ca2+研究钙相关蛋白。此外,裂解液中甘油浓度一般介于15%-20%之间。

4.很多市售或自制的裂解液过于温和,需要考虑采用机械或者超声等手段提高裂解效率(超声要慎用,可能破坏弱的相互作用)。但是,有些时候裂解液的冻融又可能影响某些弱的相互作用,所以不太建议冻融裂解液——即最好裂解液制备好后立即进行coIP。当然,如果证实冻融无影响可考虑将蛋白样品保存-80度待用,这对实验日程的安排会更平易。

5.裂解产物的蛋白浓度越高越好。前几日回复一贴子,不知道出于什么动因该LZ主动稀释裂解样品的蛋白浓度再IP,所幸不是做coIP。上面提到过表达会制造相互作用的假象,反过来说蛋白浓度过稀,某些相互作用就测不到(不一定是弱的相互作用)。因此,细胞的裂解效率会直接影响实验的结果。通常细胞裂解产物的蛋白浓度可达7-8mg/ml左右,但是更常规的现象是达不到这种浓度;当然不是说低于7-8mg/ml就不能进行coIP,只是需要考虑这一因素。因此,在多数情况下要尽可能避免稀释你的细胞裂解液。

【补充1】:

切记!实验要先有结果再来挑战极限!

在不少人的提问给出的流程中,其开始的样品量往往是以6 well或者60mm dish为单位的;不否认某些蛋白或复合体确实可以在如此苛刻的条件下完成coIP。但是,更多的时候不是这样子的。以我自己研究的复合体为例,其内源性IP最低起始细胞数是40-50% confluence的145mm dish;比这个数目更低,实验结果就很不稳定甚至无信号。当某些药品、试剂非常昂贵时,鄙人才会勉为其难。否则,一律2 dishes 100% confluence,可以elute成30ul跑两次;相互作用微弱时,15ul仅跑一次;再弱,多养几块板(CE增加抗体和beads仍可保持不变,因此只浪费培养基总比浪费一个冗长的时间走麦城要好)。后续若为质谱分析,需考虑小规模量产。

二、IP前的准备工作:

coIP:分为内源性蛋白的相互作用和非内源性蛋白相互作用(后者包括外源蛋白之间以及外源拖内源蛋白)。

非内源性蛋白的相互作用,主要是通过过表达来实现,通常为简化实验、提高IP效率会让外源蛋白带上标签(tagged;这也是没有相应的可用于IP的内源蛋白抗体之前唯一可行的方案),因此就tag的使用而言存在很多小技巧。

a.His-tagged主要用于纯化蛋白。有些人喜欢用His-tagged蛋白然后进行coIP,实际上它存在潜在的隐患。当初鄙人用Sigma a-His(鼠单抗;免费广告)WB外源蛋白发现CE里面一塌糊涂(带型漂亮就是非常多的带),那时候还抱怨这个抗体特异性不好。后来,当了解到很多蛋白会有富含histidine的domain以后,恍然大悟,恰恰是因为效价非常好,所以很多内源性的蛋白都被该抗体识别。同理,如果用Ni-NTA beads去PD His-tagged的蛋白,完全有可能PD那些内源性的富含histidine domain的蛋白,造成coIP的假象,而这样的蛋白还非常多。

那么,当初开发His tag的主要目的,个人认为主要是可以用廉价的化学试剂洗脱,且Ni-NTA beads这类非抗体类的beads成本低廉,可大量工业生产。因此,用这个tag去生产有活性的蛋白是首选。

b.tandem-tagged不能用于分析钙调信号通路。tandem tag实际上从成本角度和His tag差不多,洗脱试剂价格低廉,因此可用于大规模PD之后的质谱分析,能获取最全面的相互作用的信息。然后由于其中包含钙调蛋白相互作用domain,天然会结合钙信号相关蛋白,从而干扰或掩盖靶蛋白与钙信号蛋白之间的相互作用,有一定的应用局限。当然,笔者不太清楚近年来该方法有无改进,但正是由于引入钙调domain才实现了降低成本的目的,因此猜测可能性不大。

c.Myc、HA、Flag-tagged:

Myc仍然会有天然的干扰,应用略有局限;相较后两者是人工合成专门用于tagged蛋白(有相应的专利,因此目前无论抗体或交联好的beads价格都非常昂贵),因此干扰最小、最常用。如需进一步细致区分,a-Flag效价比a-HA略高,因此更适合IP。当然,公司仍在努力寻找效价更好的a-HA以及IP HA的抗体(Flag系Sigma专利,因此目前只能忍受其过高的定价)。那么,之前颇流行的a-HA鼠源单抗(其clone名称为12CA5)为何被潜在地摒弃了?

原因大概是:该克隆株可以轻易获取,流传甚广,因此可以取腹水自制;效价不高,特异性很差。尤其是特异性的问题,用该抗体去交联的beads做coIP,隐患很大(可以轻易PD非常浓的非特异性蛋白)——因此,购买商品化a-HA beads时,请仔细阅读产品说明(避开12CA5系列)。

还有GST等等,不一一列举了。

d.tag的位置。将tag构建到蛋白的N端还是C端,也是一个潜在的能够影响coIP结果的因素。比如,分泌蛋白的N端通常有分泌信号肽,如果将tag构建到N端,则外泌时会被信号肽酶连同信号肽一起切除;所以这时必须构建在C端。再如,多数蛋白的C端是疏水区,有的时候将tag构建在C端会影响蛋白原来的空间结构,如恰好C端同时是相互作用的结构域,某些时候还可能被遮蔽,从而干扰相互作用。因此,通常构建质粒的时候是N端、C端tagged同时分别构建,以备万一。

内源性蛋白的相互作用,主要依靠抗体IP,WB或者质谱分析。另外一条途径,是用外源性蛋白的coIP指代内源性蛋白,上文提到的tandem-tag技术的目的就是为了实现这种可

能。它的核心是将外源性蛋白的过表达降低极低水平用于模拟体内环境。实际上,在构建外源过表达体系的时候,通常可以得到一系列表达水平差异的稳定单克隆,可以通过进一步筛选获得外源与内源相加与原内源蛋白水平相当的细胞株(在细胞调控承受的范围以内,内源性蛋白水平会因为相应的外源蛋白表达而适当下调),这样的细胞株可以用于模拟内源性蛋白的相互作用;因为理论上未改变细胞的生理特异,相应的生命过程仍受内源因素调控。 当然构建相应的细胞株需要转染并筛选,又因为要控制表达量水平,筛选工作耗时更长;并且细胞状态会因为传代过多而有些改变。因此,绝对的内源性蛋白的相互作用仍是一个不可或缺的数据,尤其对一个新发现的蛋白复合体。

IP内源性蛋白首先要确认相应的抗体是否能够用于IP。能够用于IP的抗体,通常其识别区域恰是天然状态下靶蛋白暴露于外的区段,常为疏水性结构域;因此在自己制备抗体的时候要更多考虑这个因素,至于商品化的要仔细阅读说明。

在确定抗体可以用于IP A蛋白以后,抗体投入量如何掌握呢?通常情况下0.1ug-3ug较常用(纯化的抗体),其变化取决于抗体的效价,但通常未知情况下0.5ug或1ug是最常用。一般如果样品易制备则尽量用样品过饱和抗体,让投入抗体能物尽其用;相反,通常1ug抗体已经是过量的。

另外一个需要考虑的因素是B蛋白的大小,尤其B蛋白已知。当B蛋白分子量接近55KDa或24KDa附近的时候,问题会比较复杂。因为在最后一步洗脱的过程,很容易将轻链和重链带入到IP终产物,它将严重干扰实验结果。

解决方案:

1. IP外源tagged-A蛋白,洗脱尽量用相应的peptide,一方面提高特异性,另一方面由于洗脱条件温和,重链和轻链脱落也会较少;在IP前,尤其对于新Flag、HA beads可以用washing buffer或者低pH Glycine-HCl漂洗一下beads,把结合不牢的重链和轻链先洗掉。此外,Flag、HA-beads通常是鼠抗,那么IB B蛋白的抗体应该选用兔抗。

针对beads的新旧,反过来说,采用再生的旧beads有利于避免轻重链的干扰,且IP前的封闭可以省去——不要指望高盐、酸洗能彻底去除已经非特异结合到beads上的杂质,通常这些蛋白都比较黏。高盐、大量纯化蛋白时,采用再生的beads可以获取即便银染,背景仍非常干净的高纯度蛋白样品。

2. IP内源性蛋白,尤其最后涉及低pH Glycine-HCl洗脱或者SDS LB煮beads(后者重、轻链更严重),如B蛋白为60KDa即能与55KDa重链分开时,且抗体效价许可的前提下,降低抗体投入量会显著减弱重、轻链信号,从而不会使得B蛋白信号不致被重链信号吞没;若有条件再配合交错抗体种属来源,即IP A蛋白的抗体为兔抗,IB B蛋白用兔抗以外任何一种诸如鼠抗、羊抗;反之亦然。即使交错抗体的种属,实际上当重轻链脱落过多时(尤其是重链),在IB的时候它符合《WB实战指南》提到的杂蛋白过浓会非特异结合任意抗体,这在coIP的实验结果分析中要格外小心。有人会说可以用未免疫的IgG做阴性对照,但是偶尔会发生一些未知意外,恰好IgG的重链没有显影(毕竟这不是抗原抗体特异性结合)。

【BTW:偶尔这样的结果还能重复出来,但是反过来IP B蛋白,IB A蛋白可能就100%失败。所以,当蛋白分子量接近重、轻链的时候,下结论要格外小心,除严格阴性、阳性对照外,reverse IP的结果也很重要。最好加一个不相干的蛋白的同种属的抗体做阴性对照】

beads封闭和样品的preclear:

如果采用新beads,beads的封闭就显得非常必要。封闭用1-5mg/ml BSA(ChIP还要加鱼精DNA)扔buffer里一直静置就好了;若临时添加可考虑翻转半小时;样品preclear用protein A beads翻转半小时。实际经验,杂蛋白若是很黏怎么处理都只是相对好一些。所以,IP、漂洗的盐浓度影响更大。

coIP: 抗体剂量上文提过了;其他flag、protein A等等beads一般用10ul足够了,偶尔根据需要微调,诸如过表达纯化蛋白。总之,一般CE的成本较低,若用CE饱和抗体、beads,只要你抗体、beads和操作始终一致,最后IP的A蛋白能保证一致,结果有效。

干粉状的beads用IP buffer充分溶胀后离心去beads的碎片;其他液态的不需要此过程。现在市售的商品化beads如sigma flag可不需要IP buffer漂洗直接IP,未发现对coIP结果的明显干扰。通常,再生的beads由于放置-20度延长保存期需要加入大量甘油,不漂洗直接使用不容易把beads分匀,从而造成不同tube间初始差异,这时候会对IP结果影响很大。

用抗体做内源性IP时,个人喜欢抗体2hr+beads 1hr,抗体孵育可过夜;beads不超过3hrs(含flag等等标签蛋白IP情况)。这里面提到一个细节,就是先加beads还是先加抗体。在某些情况下,CE离心去除细胞碎片后的上清是一个刚好的溶解平衡体系,添加其他物质如beads这类可作为沉淀凝结核的物质会破坏原本的溶解平衡;它可能类似水蒸气凝结成雨水或雪花需要灰尘作为凝结核,其结果就是让一些原本溶解完全的蛋白发生沉淀。那么,beads翻转越久蛋白会沉淀越多,而这种沉淀无法靠漂洗去除干净,最终进入sample从而可以检测到任意蛋白的结合。因此,限制beads翻转孵育时间非常关键;通常beads孵育1-2hr已经充分结合了。

做IP的beads其物理性质跟吸附DNA的或诸如Ni-NTA之类的差异很大,不需要高速离心,通常台式小离心机4-5K、30sec就足够了;有时候忘记了,静置较久beads已自然沉降甚至不需要离心。在这种情况下,不必要的高速离心只会给beads施加巨大的离心力,次数多了beads通通碎裂,严重影响再生beads的质量——避免一些不必要的操作;当然不打算重复使用就无所谓了。

。。。

Beads再生:

商品化的beads尤其抗体交联的,因为抗体和专利的原因价格相对昂贵,那么回收beads并再生就显得非常必要。保管得好(防霉变),beads可以重复用20-30次。

再生beads没有什么特别的,常做生化柱层析的,那简直就是家常便饭。IP用beads的再生,也无非就是高盐接酸洗再高盐,最后用IP漂洗buffer复性,加甘油和NaN3扔-20度长期保存。

高盐即3M NaCl;酸洗,就是可用做elution buffer的0.1M pH3.0的Glycine-HCl。IP beads尤其抗体交联的,由于昂贵再加实验和回收过程的损失一般体积不大,所以Biorad公司一种小型塑料的柱层析管用来再生beads最合适(它是一次性的,但仅仅用于再生beads可以无限重复使用);而常规的玻璃生化层析柱即便最小号的也太大,黏壁损失会很大,beads再生几次可能就全损失了。

再生操作就类似做DNA大抽的KIT,加液体到层析柱、控制流速让其一滴滴流下;再生质量可以通过改变酸、盐的体积控制,希望干净点多加一些、多洗几遍。

唯一需要注意的,由于再生流程通常要耗费半天时间,beads太少不值得操作且再生次数越多黏壁损失也越多;所以,通常都是等回收的旧beads积攒到一定体积再一次性操作。前文提过,IP用的beads通常不需要离心就会自然沉降,而积攒旧beads通常是一个很漫长的过程,那么等到决定再生的时候,beads可能因为静置过久而已经压挤得非常结实;直接重悬beads转移到层析柱里,你会发现液体根本流不下来。因此,对于静置很久的旧beads通常在回收前一天高速翻转过夜,这时候再把beads转移到层析柱中就会相对疏松,酸、盐洗涤就会比较流畅。同样的原因,再生过程中通常就是流速越来越慢,再生次数多的旧beads其内含的灰尘、颗粒也较多,可能最后液体就不滴了;这时候只能用枪反复吹吸、松松beads。当然,这些问题都只在beads体积较大的时候时明显,如果本来就不足1ml,以上就全是废话。

PS:此篇更新会相当慢,尽量不太监,请见谅——先留个爪

有感于坛友对本文的关注:

【近况】:非常抱歉最近一直没更新,原因主要有二。

1. 思路中断。这篇要全新写,通盘的概念是有的,但对于每个细节以及内容的衔接很模糊,很难下笔;因为即使勉强著述,按个人行文的习惯,前后修改等于重写,时间需要很久。

2. 最近忙于结尾自己的手头课题,拼尽全力追求进度,连续多日工作14-16小时以上,身体已多次出现过劳体征;还要应付研究以外的工作,实在无暇顾及这边。

目前,我优先保证问题的回复。

exciting news: paper accepted!

BTW:个人还是喜欢先回复再写一个总结,因为接触到的问题会比较全面,诸如最近好几个人提问时,给出了详细的流程,这很好;可是当我看到第一步,就知道下面不用细看了。可能很多人都喜欢在刀尖上跳舞玩心跳,不过我个人还是喜欢稳稳当当先有结果再来跳舞——为什么很多人起始细胞量只有6孔板、60mm dish,大家都喜欢这么虐待自己嘛——让心灵承受一次次实验无信号的打击!?!?!?

因此,我也知道在制备CE那一部分需要补充强调的东西。

范文五:染色质免疫共沉淀实验

一、 染色质免疫共沉淀简介

真核生物的基因组DNA以染色质的形式存在。因此,研究蛋白质与DNA在染色质环境下的相互作用是阐明真核生物基因表达机制的基本途径。染色质免疫沉淀技术

(chromatin immunoprecipitation assay, CHIP)是目前唯一研究体内DNA与蛋白质相互作用的方法。它的基本原理是在活细胞状态下固定蛋白质-DNA复合物,并将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段,然后通过免疫学方法沉淀此复合体,特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段,通过对目的片断的纯化与检测,从而获得蛋白质与DNA相互作用的信息。CHIP不仅可以检测体内反式因子与DNA的动态作用,还可以用来研究组蛋白的各种共价修饰与基因表达的关系。而且,CHIP与其他方法的结合,扩大了其应用范围:CHIP与基因芯片相结合建立的CHIP-on-chip方法已广泛用于特定反式因子靶基因的高通量筛选;CHIP与体内足迹法相结合,用于寻找反式因子的体内结合位点;RNA-CHIP用于研究RNA在基因表达调控中的作用。由此可见,随着CHIP的进一步完善,它必将会在基因表达调控研究中发挥越来越重要的作用。

染色质免疫共沉淀可以:(1)组蛋白修饰酶的抗体作为“生物标记”;(2)转录调控分析;(3)药物开发研究;(4)DNA损失与凋亡分析。 二、ChIP的一般流程

甲醛处理细胞---收集细胞,超声破碎---加入目的蛋白的抗体,与靶蛋白-DNA复合物相互结合---加入ProteinA,结合抗体-靶蛋白-DNA复合物,并沉淀---对沉淀下来的复合物进行清洗,除去一些非特异性结合---洗脱,得到富集的靶蛋白-DNA复合物---解交联,纯化富集的DNA-片断---PCR分析。

三、PCR分析

ChIP-chip技术对于大规模挖掘顺式调控信息成绩卓著,同时它可以用于胚胎干细胞和一些疾病如癌症、心血管疾病和中央神经紊乱的发生的机制。研究人员还可以利用这项技术开发一些治疗方法。目前ChIP-chip技术研究主要集中于两个领域:及转录因子的结合和条件特异性;组蛋白的修饰,组蛋白修饰蛋白和染色体重建。

ChIP-chip在描述转录结合因子动力学中的研究、染色体结构组分的分布、在组蛋白的修饰、组蛋白修饰蛋白和染色体重建中的应用也十分广泛。ChIP-chip 技术的优点是,可以在体内进行反应;在给定的检验细胞环境的模式下得到DNA相互关系的简单影像;使用

特异性修正抗体鉴定与包含有一个特异性后转录修正的蛋白质的相关位点;直接或者间接(通过蛋白质与蛋白质的相互作用)的鉴别基因组与蛋白质的相关位点。缺点是:需要一个特异性蛋白质抗体,有时难于获得;为了获得高丰度的结合片段,必须实验演示胞内条件下靶标蛋白质的表达情况;调控蛋白质的基因的获取可能需要限制在组织来源中。

总之,ChIP-chip 技术的发展为析活细胞或组织中DNA与蛋白质的相互关系提供了一个极为有力的工具。在未来的研究中,将对芯片的构建进行改进,提高其实用性。使用易于获得抗体,增加这种方法的可用性。

在PCR分析这一块,比较传统的做法是半定量-PCR。但是现在随着荧光定量PCR的普及,大家也越来越倾向于Q-PCR了。此外还有一些由ChIP衍生出来的方法。例如RIP(其实就是用ChIP的方法研究细胞内蛋白与RNA的相互结合,具体方法和ChIP差不多,只是实验过程中要注意防止RNase,最后分析的时候需要先将RNA逆转录成为cDNA);还有ChIP-chip(其实就是ChIP富集得到的DNA-片段,拿去做芯片分析,做法在ChIP的基础上有所改变,不同的公司有不同的做法,要根据公司的要求来准备样品)。

实验方法

原理 在保持组蛋白和DNA联合的同时,通过运用对应于一个特定组蛋白标记的生物抗体,染色质被切成很小的片断,并沉淀下来。

IP是利用抗原蛋白质和抗体的特异性结合以及细菌蛋白质的“prorein A”特异性地结合到免疫球蛋白的FC片段的现象活用开发出来的方法。

目前多用精制的prorein A预先结合固化在argarose的beads上,使之与含有抗原的溶液及抗体反应后,beads上的prorein A就能吸附抗原达到精制的目的。

实验材料 细胞样品

试剂、试

剂盒 甲醛甘氨酸PBSSDS Lysis Buffer洗脱液RNaseA蛋白酶Komega胶回收试剂盒

仪器、耗

材 离心管超声仪电泳仪离心机

实验步骤 一、细胞的甲醛交联与超声破碎( 第一天)

1. 取出1平皿细胞(10 cm平皿),加入243 ul 37%甲醛,使得甲醛的终浓度为1%(培养基共有9 ml)。

5. 细胞刮刀收集细胞于15 ml离心管中(PBS依次为5 ml,3 ml和3 ml)。预冷后2 000 rpm 5 min收集细胞。

6. 倒去上清。按照细胞量,加入SDS Lysis Buffer。使得细胞终浓度为每200ul含2×106个细胞。这样每100 ul溶液含1×106个细胞。再加入蛋白酶抑制剂复合物。假设MCF7长满板为5×106个细胞。本次细胞长得约为80%。即为4×106个细胞。因此每管加入400 ul SDS Lysis Buffer。将2管混在一起,共800 ul。

7. 超声破碎:VCX750,25%功率,4.5 s冲击,9 s间隙。共14次。

二、除杂及抗体哺育 ( 第一天)

1. 超声破碎结束后,10 000 g 4℃离心10 min。去除不溶物质。

2. 留取300ul做实验,其余保存于-80℃。

3. 300 ul中,100 ul加抗体做为实验组;100 ul不加抗体做为对照组;100 ul加入4 ul 5 M NaCl(NaCl终浓度为0.2 M),65℃处理3 h解交联,跑电泳,检测超声破碎的效果。

4. 在100 ul的超声破碎产物中,加入900 ul ChIP DilutionBuffer和20 ul的50×PIC。

再各加入60 ul ProteinA Agarose/SalmonSpermDNA。4℃颠转混匀1 h。

5. 1 h后,在4℃静置10 min沉淀,700 rpm离心1 min。

6. 取上清。各留取20 ul做为input。一管中加入1 ul抗体,另一管中则不加抗体。4℃颠转过夜。

三、检验超声破碎的效果 ( 第一天)

1. 取100 ul超声破碎后产物,加入4 ul 5M NaCl,65℃处理2 h解交联。

2. 分出一半用酚/氯仿抽提。电泳检测超声效果。

四、免疫复合物的沉淀及清洗( 第二天)

1. 孵育过夜后,每管中加入60 ul ProteinA Agarose/SalmonSperm DNA。4℃颠转2 h。

2. 4℃静置10 min后,700 rpm离心1 min。除去上清。

3. 依次用下列溶液清洗沉淀复合物。清洗的步骤:加入溶液,在4℃颠转10 min,4℃静置10 min沉淀,700 rpm离心1 min,除去上清。

洗涤溶液:

(1)low salt wash buffer-one wash

(2)highsalt wash buffer-one wash

(3)LiCl wash buffer-one wash

(4)TE buffer-two wash

4. 清洗完毕后,开始洗脱。

洗脱液的配方:100 ul 10%SDS,100 ul1M NaHCO3,800 ul ddH2O,共1 ml。

每管加入250 ul洗脱buffer,室温下颠转15 min,静置离心后,收集上清。重复洗涤一次。最终的洗脱液为每管500 ul。

5. 解交联:每管中加入20 ul 5M NaCl(NaCl终浓度为0.2 M)。

6. 混匀,65℃解交联过夜。

五、DNA样品的回收(第三天)

1. 解交联结束后,每管加入1 ul RNaseA(MBI),37℃孵育1 h。

2. 每管加入10 ul 0.5 M EDTA,20 ul1M Tris.HCl(PH6.5),2 ul 10 mg/ml蛋白酶K。45℃处理2 h。

3. DNA片段的回收----omega胶回收试剂盒。最终的样品溶于100 ul ddH2O。

六、PCR分析(第三天)

注意事项 1. 注意抗体的性质。抗体不同和抗原结合能力也不同,免染能结合未必能用在IP反

应。建议仔细检查抗体的说明书。特别是多抗的特异性是问题。

2. 注意溶解抗原的缓冲液的性质。多数的抗原是细胞构成的蛋白,特别是骨架蛋白,缓冲液必须要使其溶解。为此,必须使用含有强界面活性剂的缓冲液,尽管它有可能影响一部分抗原抗体的结合。另一面,如用弱界面活性剂溶解细胞,就不能充分溶解细胞蛋白。即便溶解也产生与其它的蛋白结合的结果,抗原决定族被封闭,影响与抗体的结合,即使IP成功,也是很多蛋白与抗体共沉的悲惨结果。

3. 为防止蛋白的分解,修饰,溶解抗原的缓冲液必须加蛋白每抑制剂,低温下进行实验。每次实验之前,首先考虑抗体/缓冲液的比例。抗体过少就不能检出抗原,过多则就不能沉降在beads上,残存在上清。缓冲剂太少则不能溶解抗原,过多则抗原被稀释。

范文六:免疫共沉淀(Co-IP)详细步骤教程(

免疫共沉淀(Co-IP)详细步骤教程(转)------http://blog.163.com/shangjing_wawa/blog/static/92260241201021634650139/

一原理:免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation)是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。其原理是:当细胞在非变性条件下被裂解时,完整细胞内存在的许多蛋白质-蛋白质间的相互作用被保留了下来。如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X,那么与X在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。目前多用精制的prorein A预先结合固化在argarose的beads上,使之与含有抗原的溶液及抗体反应后,beads上的prorein A就能吸附抗原达到精制的目的。这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合;也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档。

其优点为:(1)相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的,处于天然状态;(2)蛋白的相互作用是在自然状态下进行的,可以避免人为的影响;(3)可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物。缺点为:(1)可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质-蛋白质相互作用;(2)两种蛋白质的结合可能不是直接结合,而可能有第三者在中间起桥梁作用;(3)必须在实验前预测目的蛋白是什么,以选择最后检测的抗体,所以,若预测不正确,实验就得不到结果,方法本身具有冒险性。

二、准备工作:

预冷PBS,RIPA Buffer,细胞刮子(用保鲜膜包好后,埋冰下),离心机

1. 用预冷的PBS洗涤细胞两次,最后一次吸干PBS;

2. 加入预冷的RIPA Buffer(1ml/107个细胞、10cm培养皿或150cm2培养瓶,0.5ml/5×106个细胞、6cm培养皿、75cm2培养瓶)

3. 用预冷的细胞刮子将细胞从培养皿或培养瓶上刮下,把悬液转到1.5EP管中,4℃,缓慢晃动15min(EP管插冰上,置水平摇床上)

4. 4℃,14000g离心15min,立即将上清转移到一个新的离心管中

5. 准备Protein A agarose,用PBS 洗两遍珠子,然后用PBS配制成50%浓度,建议减掉枪尖部分,避免在涉及琼脂糖珠的操作中破坏琼脂糖珠

6. 每1ml总蛋白中加入100μl Protein A琼脂糖珠(50%),4℃摇晃10min(EP管插冰上,置水平摇床上),以去除非特异性杂蛋白,降低背景

7. 4℃,14000g离心15min,将上清转移到一个新的离心管中,去除Protein A珠子

8. (Bradford 法)做蛋白标准曲线,测定蛋白浓度,测前将总蛋白至少稀释1:10倍以上,以减少细胞裂解液中去垢剂的影响(定量,分装后,可以在-20℃保存一个月)

9. 用PBS将总蛋白稀释到约1 μg/μl,以降低裂解液中去垢剂的浓度,如果兴趣蛋白在细胞中含量较低,则总蛋白浓度应该稍高(如10 μg/μl)

10. 加入一定体积的兔抗到500μl总蛋白中,抗体的稀释比例因兴趣蛋白在不同细胞系中的多少而异

11. 4℃缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或室温2h,激酶或磷酸酯酶活性分析建议用2 h室温孵育

12. 加入100μl Protein A琼脂糖珠来捕捉抗原抗体复合物,4℃缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或室温1h,如果所用抗体为鼠抗或鸡抗,建议加2 μl"过渡抗体"(兔抗鼠IgG,兔抗鸡IgG)

13. 14000rpm瞬时离心5s,收集琼脂糖珠-抗原抗体复合物,去上清,用预冷的RIPA buffer洗3遍,800μl/遍,RIPA buffer有时候会破坏琼脂糖珠-抗原抗体复合物内部的结合,可以使用PBS

14. 用60μl 2×上样缓冲液将琼脂糖珠-抗原抗体复合物悬起,轻轻混匀,缓冲液的量依据上样多少的需要而定(60 μl足够上三道)

15. 将上样样品煮5min,以游离抗原,抗体,珠子,离心,将上清电泳,收集剩余琼脂糖珠,上清也可以暂时冻-20℃,留待以后电泳,电泳前应再次煮5min变性。

RIPA Buffer配制:

基础成分:

Tris-HCl(缓冲液成分,防止蛋白变性)

NaCl(盐份,防止非特异蛋白聚集)

NP-40(非离子去污剂,提取蛋白;用H2O配制成10%储存液)

去氧胆酸钠(离子去污剂,提取蛋白;用H2O配制成10%储存液;避光保存)

注意:准备激酶(致活酶)实验时,不要加去氧胆酸钠,因为离子型去污剂能够使酶变性,导致活性丧失。

RIPA蛋白酶抑制剂

苯甲基磺酰氟(PMSF)(用异丙醇配制成200mM的储存液,室温保存)

EDTA(钙螯合剂;用H2O配制成100mM的储存液,PH 7.4)

亮抑酶肽(Leupeptin)(用H2O配制成1mg/ml的储存液,分装,-20℃保存)

抑蛋白酶肽(Aprotinin)(用H2O配制成1mg/ml的储存液,分装,-20℃保存)

胃蛋白酶抑制剂(Pepstatin)(用甲醇配制成1mg/ml的储存液,分装,-20℃保存) RIPA磷酸(酯)酶抑制剂

激活的Na3VO4(用H2O配制成200mM的储存液,见Sodium Orthovanadate Activation Protoco)

NaF(200mM的储存液,室温保存)

注意:在准备做磷酸(酯)酶实验的时候,不加磷酸酯酶抑制剂

工作液配制:

配制100ml的modified RIPA buffe:

1. 称取790mg 的Tris-Base,加到75ml 去离子水中,加入900mg的NaCl,搅拌,直到全部溶解,用HCl调节PH值到7.4

2. 加10 ml 10%的NP-40

3. 加2.5 ml 10%的去氧胆酸钠,搅拌,直到溶液澄清

4. 加1 ml 100mM的EDTA,用量筒定容到100ml,2-8℃保存

5. 理论上,蛋白酶和磷酸酯酶抑制剂应该在使用当天同时加入(抑蛋白酶肽,亮抑酶肽,胃蛋白酶抑制剂各100 μl; PMSF, Na3VO4, NaF各500 μl),但是PMSF在水溶液中很不稳定,30分钟就会降解一半,所以PMSF应该在使用前现加,其他抑制剂成分可以在水溶液中稳定5天。

各种成分在工作液中的终浓度:

* Tris-HCl: 50 mM, pH 7.4

* NP-40: 1%

* 去氧胆酸钠:0.25%

* NaCl: 150 mM

* EDTA: 1 mM

* PMSF: 1 mM

* 抑蛋白酶肽,亮抑酶肽,胃蛋白酶抑制剂: 各1 μg/ml

* Na3VO4: 1 mM

* NaF: 1 mM

三、实验流程为:

(1)转染后24-48 h 可收获细胞,加入适量细胞裂解缓冲液(含蛋白酶抑制剂),冰上裂解30min, 细胞裂解液于4°C,最大转速离心30 min后取上清;

(2)取少量裂解液以备Western blot分析,剩余裂解液加1μg相应的抗体加入到细胞裂解液,4°C缓慢摇晃孵育过夜;

(3)取10μl protein A 琼脂糖珠,用适量裂解缓冲液洗3 次,每次3,000 rpm离心3 min;

(4)将预处理过的10μl protein A 琼脂糖珠加入到和抗体孵育过夜的细胞裂解液中4°C缓慢摇晃孵育2-4h,使抗体与protein A琼脂糖珠偶连;

(5)免疫沉淀反应后,在4°C 以3,000 rpm 速度离心3 min,将琼脂糖珠离心至管底;将上清小心吸去,琼脂糖珠用1ml裂解缓冲液洗3-4次;最后加入15μl的2×SDS 上样缓冲液,沸水煮5分钟;

(6)SDS-PAGE, Western blotting或质谱仪分析。通过免疫共沉淀确定结合蛋白

1.用磷酸盐缓冲液洗30块10 cm培养板上的适宜细胞。刮去每块板上的细胞到1 ml冰冷的EBC裂解缓冲液中。

2.将每毫升细胞悬液转移到微量离心管中,在微量离心机上4℃以最大速度离心15 min。

3.收集上清(约30 ml)并加入30μg的适当抗体,4℃摇动免疫沉淀物1 h。

4.加入0.9 ml的蛋白质A-Sepharose 悬液,4℃摇动免疫沉淀物30 min。

5.用含900 mmol/L NaCl的NETN洗蛋白A-Sepharose混合物,再重复洗5次。最后,用NETN洗一次。

6.吸出混合物的液体部分。加入800μl的1×SDS胶加样缓冲液到球珠中,煮沸4 min。

7.将样品加入到大孔的不连续SDS-PAGE梯度胶中,在10 mA的恒定电流下电泳过夜。

8.通过考马斯蓝染色观察蛋白质泳带。

9.从胶上切下目标带,将其放到微量离心管中,用1ml 50%乙腈洗两次,每次3 min。

10. 用胰蛋白酶消化胶中的蛋白质,再将肽电洗脱。

11. 通过窄孔高效液相色谱分离肽。将收集的肽在ABI 477A或494A机器上进行自动Edman降解测序。

四、注意的问题:

(1)细胞裂解采用温和的裂解条件,不能破坏细胞内存在的所有蛋白质-蛋白质相互作用,多采用非离子变性剂(NP40 或Triton X-100)。每种细胞的裂解条件是不一样的,通过经验确定。不能用高浓度的变性剂(0.2%SDS),细胞裂解液中要加各种酶抑制剂,如商品化的 cocktailer。

(2)使用明确的抗体,可以将几种抗体共同使用

(3)使用对照抗体:

单克隆抗体:正常小鼠的IgG或另一类单抗

兔多克隆抗体:正常兔IgG

在免疫共沉淀实验中要保证实验结果的真实性,应注意以下几点:

(1) 确保共沉淀的蛋白是由所加入的抗体沉淀得到的,而并非外源非特异蛋白,单克隆抗体的使用有助于避免污染的发生;

(2) 要确保抗体的特异性,即在不表达抗原的细胞溶解物中添加抗体后不会引起共沉淀;

(3) 确定蛋白间的相互作用是发生在细胞中,而不是由于细胞的溶解才发生的,这需要进行蛋白质的定位来确定

范文七:免疫共沉淀(Co-IP)详细步骤教程

免疫共沉淀(Co-IP)详细步骤教程

一、原理:免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation)是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。其原理是:当细胞在非变性条件下被裂解时,完整细胞内存在的许多蛋白质-蛋白质间的相互作用被保留了下来。如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X,那么与X在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。目前多用精制的prorein A预先结合固化在argarose的beads上,使之与含有抗原的溶液及抗体反应后,beads上的prorein A就能吸附抗原达到精制的目的。这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合;也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档。

其优点为:(1)相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的,处于天然状态;(2)蛋白的相互作用是在自然状态下进行的,可以避免人为的影响;(3)可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物。缺点为:(1)可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质-蛋白质相互作用;(2)两种蛋白质的结合可能不是直接结合,而可能有第三者在中间起桥梁作用;(3)必须在实验前预测目的蛋白是什么,以选择最后检测的抗体,所以,若预测不正确,实验就得不到结果,方法本身具有冒险性。

二、准备工作:

预冷PBS,RIPA Buffer,细胞刮子(用保鲜膜包好后,埋冰下),离心机

1. 用预冷的PBS洗涤细胞两次,最后一次吸干PBS;

2. 加入预冷的RIPA Buffer(1ml/107个细胞、10cm培养皿或150cm2培养瓶,0.5ml/5×106个细胞、6cm培养皿、75cm2培养瓶)

3. 用预冷的细胞刮子将细胞从培养皿或培养瓶上刮下,把悬液转到1.5EP管中,4℃,缓慢晃动15min(EP管插冰上,置水平摇床上)

4. 4℃,14000g离心15min,立即将上清转移到一个新的离心管中

5. 准备Protein A agarose,用PBS 洗两遍珠子,然后用PBS配制成50%浓度,建议减掉枪尖部分,避免在涉及琼脂糖珠的操作中破坏琼脂糖珠

6. 每1ml总蛋白中加入100μl Protein A琼脂糖珠(50%),4℃摇晃10min(EP管插冰上,置水平摇床上),以去除非特异性杂蛋白,降低背景

7. 4℃,14000g离心15min,将上清转移到一个新的离心管中,去除Protein A珠子

8. (Bradford 法)做蛋白标准曲线,测定蛋白浓度,测前将总蛋白至少稀释1:10倍以上,以减少细胞裂解液中去垢剂的影响(定量,分装后,可以在-20℃保存一个月)

9. 用PBS将总蛋白稀释到约1 μg/μl,以降低裂解液中去垢剂的浓度,如果兴趣蛋白在细胞中含量较低,则总蛋白浓度应该稍高(如10 μg/μl)

10. 加入一定体积的兔抗到500μl总蛋白中,抗体的稀释比例因兴趣蛋白在不同细胞系中的多少而异

11. 4℃缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或室温2h,激酶或磷酸酯酶活性分析建议用2 h室温孵育

12. 加入100μl Protein A琼脂糖珠来捕捉抗原抗体复合物,4℃缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或室温1h,如果所用抗体为鼠抗或鸡抗,建议加2 μl"过渡抗体"(兔抗鼠IgG,兔抗鸡IgG)

13. 14000rpm瞬时离心5s,收集琼脂糖珠-抗原抗体复合物,去上清,用预冷的RIPA buffer洗3遍,800μl/遍,RIPA buffer有时候会破坏琼脂糖珠-抗原抗体复合物内部的结合,可以使用PBS

14. 用60μl 2×上样缓冲液将琼脂糖珠-抗原抗体复合物悬起,轻轻混匀,缓冲液的量依据上样多少的需要而定(60 μl足够上三道)

15. 将上样样品煮5min,以游离抗原,抗体,珠子,离心,将上清电泳,收集剩余琼脂糖珠,上清也可以暂时冻-20℃,留待以后电泳,电泳前应再次煮5min变性。

RIPA Buffer配制:

基础成分:

Tris-HCl(缓冲液成分,防止蛋白变性)

NaCl(盐份,防止非特异蛋白聚集)

NP-40(非离子去污剂,提取蛋白;用H2O配制成10%储存液)

去氧胆酸钠(离子去污剂,提取蛋白;用H2O配制成10%储存液;避光保存) 注意:准备激酶(致活酶)实验时,不要加去氧胆酸钠,因为离子型去污剂能够

使酶变性,导致活性丧失。

RIPA蛋白酶抑制剂

苯甲基磺酰氟(PMSF)(用异丙醇配制成200mM的储存液,室温保存) EDTA(钙螯合剂;用H2O配制成100mM的储存液,PH 7.4)

亮抑酶肽(Leupeptin)(用H2O配制成1mg/ml的储存液,分装,-20℃保存) 抑蛋白酶肽(Aprotinin)(用H2O配制成1mg/ml的储存液,分装,-20℃保存) 胃蛋白酶抑制剂(Pepstatin)(用甲醇配制成1mg/ml的储存液,分装,-20℃保存)

RIPA磷酸(酯)酶抑制剂

激活的Na3VO4(用H2O配制成200mM的储存液,见

Sodium Orthovanadate Activation Protoco)

NaF(200mM的储存液,室温保存)

注意:在准备做磷酸(酯)酶实验的时候,不加磷酸酯酶抑制剂

工作液配制:

配制100ml的modified RIPA buffe:

1. 称取790mg 的Tris-Base,加到75ml 去离子水中,加入900mg的NaCl,搅拌,直到全部溶解,用HCl调节PH值到7.4

2. 加10 ml 10%的NP-40

3. 加2.5 ml 10%的去氧胆酸钠,搅拌,直到溶液澄清

4. 加1 ml 100mM的EDTA,用量筒定容到100ml,2-8℃保存

5. 理论上,蛋白酶和磷酸酯酶抑制剂应该在使用当天同时加入(抑蛋白酶肽,亮抑酶肽,胃蛋白酶抑制剂各100 μl; PMSF, Na3VO4, NaF各500 μl),但是

PMSF在水溶液中很不稳定,30分钟就会降解一半,所以PMSF应该在使用前现加,其他抑制剂成分可以在水溶液中稳定5天。

各种成分在工作液中的终浓度:

* Tris-HCl: 50 mM, pH 7.4

* NP-40: 1%

* 去氧胆酸钠:0.25%

* NaCl: 150 mM

* EDTA: 1 mM

* PMSF: 1 mM

* 抑蛋白酶肽,亮抑酶肽,胃蛋白酶抑制剂: 各1 μg/ml

* Na3VO4: 1 mM

* NaF: 1 mM

三、实验流程为:

(1)转染后24-48 h 可收获细胞,加入适量细胞裂解缓冲液(含蛋白酶抑制剂),冰上裂解30min, 细胞裂解液于4°C,最大转速离心30 min后取上清;

(2)取少量裂解液以备Western blot分析,剩余裂解液加1μg相应的抗体加

入到细胞裂解液,4°C缓慢摇晃孵育过夜;

(3)取10μl protein A 琼脂糖珠,用适量裂解缓冲液洗3 次,每次3,000 rpm离心3 min;

(4)将预处理过的10μl protein A 琼脂糖珠加入到和抗体孵育过夜的细胞裂解液中4°C缓慢摇晃孵育2-4h,使抗体与protein A琼脂糖珠偶连;

(5)免疫沉淀反应后,在4°C 以3,000 rpm 速度离心3 min,将琼脂糖珠离心至管底;将上清小心吸去,琼脂糖珠用1ml裂解缓冲液洗3-4次;最后加入15μl的2×SDS 上样缓冲液,沸水煮5分钟;

(6)SDS-PAGE, Western blotting或质谱仪分析。通过免疫共沉淀确定结合蛋白

1.用磷酸盐缓冲液洗30块10 cm培养板上的适宜细胞。刮去每块板上的细胞到1 ml冰冷的EBC裂解缓冲液中。

2.将每毫升细胞悬液转移到微量离心管中,在微量离心机上4℃以最大速度离心15 min。

3.收集上清(约30 ml)并加入30μg的适当抗体,4℃摇动免疫沉淀物1 h。

4.加入0.9 ml的蛋白质A-Sepharose 悬液,4℃摇动免疫沉淀物30 min。

5.用含900 mmol/L NaCl的NETN洗蛋白A-Sepharose混合物,再重复洗5次。最后,用NETN洗一次。

6.吸出混合物的液体部分。加入800μl的1×SDS胶加样缓冲液到球珠中,煮

沸4 min。

7.将样品加入到大孔的不连续SDS-PAGE梯度胶中,在10 mA的恒定电流下电泳过夜。

8.通过考马斯蓝染色观察蛋白质泳带。

9.从胶上切下目标带,将其放到微量离心管中,用1ml 50%乙腈洗两次,每次3 min。

10. 用胰蛋白酶消化胶中的蛋白质,再将肽电洗脱。

11. 通过窄孔高效液相色谱分离肽。将收集的肽在ABI 477A或494A机器上进行自动Edman降解测序。

四、注意的问题:

(1)细胞裂解采用温和的裂解条件,不能破坏细胞内存在的所有蛋白质-蛋白质相互作用,多采用非离子变性剂(NP40 或Triton X-100)。每种细胞的裂解条件是不一样的,通过经验确定。不能用高浓度的变性剂(0.2%SDS),细胞裂解液中要加各种酶抑制剂,如商品化的 cocktailer。

(2)使用明确的抗体,可以将几种抗体共同使用

(3)使用对照抗体:

单克隆抗体:正常小鼠的IgG或另一类单抗

兔多克隆抗体:正常兔IgG

在免疫共沉淀实验中要保证实验结果的真实性,应注意以下几点:

(1) 确保共沉淀的蛋白是由所加入的抗体沉淀得到的,而并非外源非特异蛋白,单克隆抗体的使用有助于避免污染的发生;

(2) 要确保抗体的特异性,即在不表达抗原的细胞溶解物中添加抗体后不会引起

共沉淀;

(3) 确定蛋白间的相互作用是发生在细胞中,而不是由于细胞的溶解才发生的,这需要进行蛋白质的定位来确定。

范文八:免疫共沉淀(Co-IP)详细步骤教程

免疫共沉淀(Co-IP)详细步骤教程

一、 原理:

免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation)是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。

其原理是:当细胞在非变性条件下被裂解时,完整细胞内存在的许多蛋白质-蛋白质间的相互作用被保留了下来。如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X,那么与X在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。目前多用精制的protein A预先结合固化在argarose的beads上,使之与含有抗原的溶液及抗体反应后,beads上的prorein A就能吸附抗原达到精制的目的。这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合;也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档。

其优点为:(1)相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的,处于天然状态;

(2)蛋白的相互作用是在自然状态下进行的,可以避免人为的影响;

(3)可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物。

缺点为:(1)可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质-蛋白质相互作用;

(2)两种蛋白质的结合可能不是直接结合,而可能有第三者在中间起桥梁作

用;

(3)必须在实验前预测目的蛋白是什么,以选择最后检测的抗体,所以,若

预测不正确,实验就得不到结果,方法本身具有冒险性。

二、准备工作:

预冷PBS,RIPA Buffer,细胞刮子(用保鲜膜包好后,埋冰下),离心机

1. 用预冷的PBS洗涤细胞两次,最后一次吸干PBS;

2. 加入预冷的RIPA Buffer (1ml/107个细胞、10cm培养皿或150cm2培养瓶,0.5ml/5×106个细胞、6cm培养皿、75cm2培养瓶)

3. 用预冷的细胞刮子将细胞从培养皿或培养瓶上刮下,把悬液转到1.5EP管中,4℃,缓慢晃动15min(EP管插冰上,置水平摇床上)

4. 4℃,14000g离心15min,立即将上清转移到一个新的离心管中

5. 准备Protein A agarose,用PBS 洗两遍珠子,然后用PBS配制成50%浓度,建议减掉枪尖部分,避免在涉及琼脂糖珠的操作中破坏琼脂糖珠

6. 每1ml总蛋白中加入100μl Protein A琼脂糖珠(50%),4℃摇晃10min(EP管插冰上,置水平摇床上),以去除非特异性杂蛋白,降低背景

7. 4℃,14000g离心15min,将上清转移到一个新的离心管中,去除Protein A珠子

8. (Bradford 法) 做蛋白标准曲线,测定蛋白浓度,测前将总蛋白至少稀释1:10倍以上,以减少细胞裂解液中去垢剂的影响(定量,分装后,可以在-20℃保存一个月)

9. 用PBS将总蛋白稀释到约1 μg/μl,以降低裂解液中去垢剂的浓度,如果兴趣蛋白在细胞中含量较低,则总蛋白浓度应该稍高(如10 μg/μl)

10. 加入一定体积的兔抗到500μl总蛋白中,抗体的稀释比例因兴趣蛋白在不同细胞系中的多少而异

11. 4℃缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或室温2h,激酶或磷酸酯酶活性分析建议用2 h室温孵育

12. 加入100μl Protein A琼脂糖珠来捕捉抗原抗体复合物,4℃缓慢摇动抗原抗体混合物过

夜或室温1h,如果所用抗体为鼠抗或鸡抗,建议加2 μl"过渡抗体"(兔抗鼠IgG,兔抗鸡IgG)

13. 14000rpm瞬时离心5s,收集琼脂糖珠-抗原抗体复合物,去上清,用预冷的RIPA buffer洗3遍,800μl/遍,RIPA buffer有时候会破坏琼脂糖珠-抗原抗体复合物内部的结合,可以使用PBS

14. 用60μl 2×上样缓冲液将琼脂糖珠-抗原抗体复合物悬起,轻轻混匀,缓冲液的量依据上样多少的需要而定(60 μl足够上三道)

15. 将上样样品煮5min,以游离抗原,抗体,珠子,离心,将上清电泳,收集剩余琼脂糖珠,上清也可以暂时冻-20℃,留待以后电泳,电泳前应再次煮5min变性。

RIPA Buffer配制:

基础成分:

Tris-HCl(缓冲液成分,防止蛋白变性)

NaCl(盐份,防止非特异蛋白聚集)

NP-40(非离子去污剂,提取蛋白;用H2O配制成10%储存液)

去氧胆酸钠(离子去污剂,提取蛋白;用H2O配制成10%储存液;避光保存)

注意:准备激酶(致活酶)实验时,不要加去氧胆酸钠,因为离子型去污剂能够使酶变性,导致活性丧失。

RIPA蛋白酶抑制剂

苯甲基磺酰氟(PMSF)(用异丙醇配制成200mM的储存液,室温保存)

EDTA(钙螯合剂;用H2O配制成100mM的储存液,PH 7.4)

亮抑酶肽(Leupeptin)(用H2O配制成1mg/ml的储存液,分装,-20℃保存)

抑蛋白酶肽(Aprotinin)(用H2O配制成1mg/ml的储存液,分装,-20℃保存)

胃蛋白酶抑制剂(Pepstatin)(用甲醇配制成1mg/ml的储存液,分装,-20℃保存) RIPA磷酸(酯)酶抑制剂

激活的Na3VO4(用H2O配制成200mM的储存液,见Sodium Orthovanadate Activation Protoco)

NaF(200mM的储存液,室温保存)

注意:在准备做磷酸(酯)酶实验的时候,不加磷酸酯酶抑制剂

工作液配制:

配制100ml的modified RIPA buffe:

1. 称取790mg 的Tris-Base,加到75ml 去离子水中,加入900mg的NaCl,搅拌,直到全部溶解,用HCl调节PH值到7.4

2. 加10 ml 10%的NP-40

3. 加2.5 ml 10%的去氧胆酸钠,搅拌,直到溶液澄清

4. 加1 ml 100mM的EDTA,用量筒定容到100ml,2-8℃保存

5. 理论上,蛋白酶和磷酸酯酶抑制剂应该在使用当天同时加入(抑蛋白酶肽,亮抑酶肽,胃蛋白酶抑制剂各100 μl; PMSF, Na3VO4, NaF各500 μl),但是PMSF在水溶液中很不稳定,30分钟就会降解一半,所以PMSF应该在使用前现加,其他抑制剂成分可以在水溶液中稳定5天。

各种成分在工作液中的终浓度:

* Tris-HCl: 50 mM, pH 7.4

* NP-40: 1%

* 去氧胆酸钠:0.25%

* NaCl: 150 mM

* EDTA: 1 mM

* PMSF: 1 mM

* 抑蛋白酶肽,亮抑酶肽,胃蛋白酶抑制剂: 各1 μg/ml

* Na3VO4: 1 mM

* NaF: 1 mM

三、实验流程为:

(1)转染后24-48 h 可收获细胞,加入适量细胞裂解缓冲液(含蛋白酶抑制剂),冰上裂解30min, 细胞裂解液于4°C,最大转速离心30 min后取上清;

(2)取少量裂解液以备Western blot分析,剩余裂解液加1μg相应的抗体加入到细胞裂解液,4°C缓慢摇晃孵育过夜;

(3)取10μl protein A 琼脂糖珠,用适量裂解缓冲液洗3 次,每次3,000 rpm离心3 min;

(4)将预处理过的10μl protein A 琼脂糖珠加入到和抗体孵育过夜的细胞裂解液中4°C缓慢摇晃孵育2-4h,使抗体与protein A琼脂糖珠偶连;

(5)免疫沉淀反应后,在4°C 以3,000 rpm 速度离心3 min,将琼脂糖珠离心至管底;将上清小心吸去,琼脂糖珠用1ml裂解缓冲液洗3-4次;最后加入15μl的2×SDS 上样缓冲液,沸水煮5分钟;

(6)SDS-PAGE, Western blotting或质谱仪分析。通过免疫共沉淀确定结合蛋白

1.用磷酸盐缓冲液洗30块10 cm培养板上的适宜细胞。刮去每块板上的细胞到1 ml冰冷的EBC裂解缓冲液中。

2.将每毫升细胞悬液转移到微量离心管中,在微量离心机上4℃以最大速度离心15 min。

3.收集上清(约30 ml)并加入30μg的适当抗体,4℃摇动免疫沉淀物1 h。

4.加入0.9 ml的蛋白质A-Sepharose 悬液,4℃摇动免疫沉淀物30 min。

5.用含900 mmol/L NaCl的NETN洗蛋白A-Sepharose混合物,再重复洗5次。最后,用NETN洗一次。

6.吸出混合物的液体部分。加入800μl的1×SDS胶加样缓冲液到球珠中,煮沸4 min。

7.将样品加入到大孔的不连续SDS-PAGE梯度胶中,在10 mA的恒定电流下电泳过夜。

8.通过考马斯蓝染色观察蛋白质泳带。

9.从胶上切下目标带,将其放到微量离心管中,用1ml 50%乙腈洗两次,每次3 min。

10. 用胰蛋白酶消化胶中的蛋白质,再将肽电洗脱。

11. 通过窄孔高效液相色谱分离肽。将收集的肽在ABI 477A或494A机器上进行自动Edman降解测序。

四、注意的问题:

(1)细胞裂解采用温和的裂解条件,不能破坏细胞内存在的所有蛋白质-蛋白质相互作用,多采用非离子变性剂(NP40 或Triton X-100)。每种细胞的裂解条件是不一样的,通过经验确定。不能用高浓度的变性剂(0.2%SDS),细胞裂解液中要加各种酶抑制剂,如商品化的 cocktailer。

(2)使用明确的抗体,可以将几种抗体共同使用

(3)使用对照抗体:

单克隆抗体:正常小鼠的IgG或另一类单抗

兔多克隆抗体:正常兔IgG

在免疫共沉淀实验中要保证实验结果的真实性,应注意以下几点:

(1) 确保共沉淀的蛋白是由所加入的抗体沉淀得到的,而并非外源非特异蛋白,单克隆抗体的使用有助于避免污染的发生;

(2) 要确保抗体的特异性,即在不表达抗原的细胞溶解物中添加抗体后不会引起共沉淀;

(3) 确定蛋白间的相互作用是发生在细胞中,而不是由于细胞的溶解才发生的,这需要进行蛋白质的定位来确定

范文九:免疫共沉淀

1. 免疫沉淀(Immunoprecipitation, IP):

A.蛋白样品的准备:

A1.对于10厘米细胞培养皿中的贴壁细胞,吸除细胞培养液,PBS洗涤一次,然后加入500微升至2毫升细胞裂解液裂解细胞。可以使用碧云天生产的Western及IP细胞裂解液(P0013)或各种RIPA裂解液(P0013B、P0013C、P0013D或P0013E)等进行细胞的裂解。

A2.对于组织样品参考贴壁细胞使用裂解液的比例进行裂解。

A3.对于悬浮细胞,离心收集细胞后,PBS洗涤一次,然后参考贴壁细胞的裂解方法进行裂解。

注:详细的裂解方法参考不同裂解液的详细使用方法。对于不同的培养器材,参考10厘米培养皿的裂解液的用量进行裂解。如果裂解获得的蛋白样品浓度过高,可以用裂解液或PBS适当稀释,如果蛋白样品浓度过低,在以后的裂解过程中宜适当减少裂解液的用量。

B.去除非特异性结合(可选做):

B1.取200微升至1毫升蛋白样品,蛋白量约为200微克至1毫克,加入约1微克和免疫沉淀时使用的IgG种属相同的普通IgG和20微升充分重悬的Protein G Agarose,4℃缓慢摇动30分钟至2小时。

B2.2500rpm(约1000g)离心5分钟,取上清用于后续的免疫沉淀。

注:所谓种属相同的IgG是指,例如后续免疫沉淀时用的是小鼠IgG,则在本步骤中可以加入normal mouse IgG,如无normal IgG可以加入其它不影响后续检测的其它mouse IgG类型的抗体。通过和normal IgG和Protein G Agarose的孵育,可以充分降低非特异性的结合,降低背景。

C.免疫沉淀:

C1.加入0.2-2微克用于免疫沉淀的一抗,4℃缓慢摇动过夜。

C2.再加入20微升充分重悬的Protein G Agarose,4℃缓慢摇动1-3个小时。(为方便后续的洗涤操作可以把加入充分重悬的Protein G Agarose的量调整为40微升。)

C3.2500rpm(约1000g)离心5分钟,或瞬时高速离心,小心吸除上清,注意宁可留下少量上清也不能吸掉Protein G Agarose。

C4.用准备蛋白样品时的裂解液或PBS洗涤沉淀5次,裂解液或PBS的用量每次为0.5-1毫升。洗涤时离心条件和吸除上清的要求同上面的步骤C3。

C5.完成最后一次洗涤后,去除上清,加入20-40微升1XSDS-PAGE电泳上样缓冲液Vortex重悬沉淀,瞬时高速离心把样品离心至管底。

C6.100℃或沸水浴处理3-5分钟,取部分或全部样品用于SDS-PAGE电泳,暂时不用的样品可以-20℃保存。

2.免疫共沉淀:

参考免疫沉淀的方法进行,但免疫共沉淀(co-IP)通常必须使用未经冻存的新鲜蛋白样品。普通的免疫沉淀虽然可以使用冻存的蛋白样品,但也宜用新鲜的蛋白样品为佳。

免疫共沉淀

一 原理:

IP是利用抗原蛋白质和抗体的特异性结合以及细菌蛋白质的“prorein A"特异性地结合到免疫球蛋白的FC片段的现象活用开发出来的方法。目前多用精制的prorein A预先结合固化在argarose的beads上,使之与含有抗原的溶液及抗体反应后,beads上的prorein A就能吸附抗原达到精制的目的。

实验最需要注意点就是抗体的性质。抗体不同和抗原结合能力也不同,免染能结合未必能用在IP反应。建议仔细检查抗体

的说明书。特别是多抗的特异性是问题。

其次,要注意溶解抗原的缓冲液的性质。多数的抗原是细胞构成的蛋白,特别是骨架蛋白,缓冲液必须要使其溶解。为此,必须使用含有强界面活性剂的缓冲液,尽管它有可能影响一部分抗原抗体的结合。另一面,如用弱界面活性剂溶解细胞,就不能充分溶解细胞蛋白。即便溶解也产生与其它的蛋白结合的结果,抗原决定族被封闭,影响与抗体的结合,即使IP成功,也是很多蛋白与抗体共沉的悲惨结果。

再次,为防止蛋白的分解,修饰,溶解抗原的缓冲液必须加蛋白每抑制剂,低温下进行实验。

每次实验之前,首先考虑抗体/缓冲液的比例。抗体过少就不能检出抗原,过多则就不能沉降在beads上,残存在上清。缓冲剂太少则不能溶解抗原,过多则抗原被稀释。欲速则不达,确定好比例很必要。

二 准备:

器械

#微量高速冷冻离心机

#移液枪

#旋转盘

#电泳设备

#vortex震荡器

#液氮及组织粉碎器 #eppentube

试剂

#细胞或组织

#蛋白定量kit

#SDS电泳试剂

#抗体(单抗时选择protein G,二抗选择抗鼠Ig兔血清) #PBS #NaN3 #proteinA sapharose

试剂配制

抗原蛋白溶解缓冲液

1.RIPA缓冲液 (最终浓度)

1MTris-HCL(PH7.4) 5ml (10mM) 5MNacl 15ml (150mM)

0.5M EDTA(PH7.4) 5ml (5mM)

20%TritonX-100 25ml (1%) 10% DOC 50ml (1%) 10%SDS 5ml ( o.1%)

TLCK 18.5mg (0.1mM) TPCK 35mg (0.2mM) DDW 395ml toal 500ml

另外,使用之前加1mMPMSF(PMSF溶在酒精,浓度100mM,-20度遮光保存。注意不易溶于水)

2.NP40 lysis 缓冲液

1MTris-HCL(PH7.4) 5ml (10mM) 5MNacl 15ml (150mM)

0.5M EDTA(PH7.4) 5ml (5mM) 20%NP40 25ml (1%)

TLCK 18.5mg (0.1mM) TPCK 35mg (0.2mM) DDW 450ml toal 500ml

使用前加1mM的PMSF

注意点:

*Tris缓冲剂PH随温度变化,高浓度盐酸滴定时发热,冷却后PH增高。

*反复使用PMSF要注意保管方法。

*1和2的缓冲剂的区别在于界面活性剂。TritonX-100,NP40是非离子界面活性剂,作用温和,,DOC

*两方都有EDTA,对抗原而言,二价离子Mg,Ca等是必要的。根据自己需要调节。EDTA用NaOH滴定。

Protocol

1 调制protein A sapharose

protein A sapharose 5ml 溶于20ml含0.02%NaN3的PBS

离心2000转2分,去上清,在沉淀加0.02%NaN3的PBS,离心后去上清,重复2次,最后沉淀加20ml含0.02%NaN3的PBS,冷藏保存

用单抗做一抗时,把protein A sapharose先用抗鼠Ig兔血清处理(每50ulprotein A sapharose用1-5ul血清)。旋转1-2h,混匀后,再离心1-2s

去上清后,加PBS,vortex混合,离心去上清,重复二次

加含0.02%NaN3的PBS到原来体积,冷存。避免长期保存。

2.抗原的检出

以下操作全在冰面或4度进行

去除细胞培养液,用冷PBS洗一次。加RIPA,溶解后,转移到eppentube中用vortex混匀。RIPA的量:6cm的培养皿加1 ml(蛋白质的量为500mg/ml),组织块用液氮粉碎,在缓冲剂中捣匀,蛋白定量。

30m,15000rpm离心,上清转移到新tube 。不用移液枪,直接从tube倒进另一个tube

往上清加抗体,1ml加2-5ul抗体,冷室内旋转混匀1h

加protein A sapharose50ul,再混匀1h

5000rpm离心1s,使sapharose沉淀,去上清。往sapharose加RIPA,vortex 混匀,离心,去上清。重复4次洗净。

加电泳用 sample 缓冲液40ul,2m煮沸,泳动后,固定/干燥胶,现像。

3.注意点

A:不熟练使用移液枪,会混入沉淀的不溶性蛋白,使实验失败。对无论怎么也除不去的混入蛋白,只使用上清的上半部,或用超速离心机。

B:对电泳的非特异条带,最后可依次用含300mM,1omMNaCl的RIPA洗净各一次。(完)

阅读全文(5393) / 评论(10) / 给紫晓留言 / 扔小纸条 / 文件夹: 医学知识

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免疫共沉淀技术路线

准备工作:

预冷PBS,RIPA Buffer,细胞刮子(用保鲜膜包好后,埋冰下),离心机

1. 用预冷的PBS洗涤细胞两次,最后一次吸干PBS;

2. 加入预冷的RIPA Buffer(1ml/107个细胞、10cm培养皿或150cm2培养瓶,0.5ml/5×106个细胞、6cm培养皿、75cm2培养瓶)

3. 用预冷的细胞刮子将细胞从培养皿或培养瓶上刮下,把悬液转到1.5EP管中,4℃,缓慢晃动15min(EP管插冰上,置水平摇床上)

4. 4℃,14000g离心15min,立即将上清转移到一个新的离心管中

5. 准备Protein A agarose,用PBS 洗两遍珠子,然后用PBS配制成50%浓度,建议减掉枪尖部分,避免在涉及琼脂糖珠的操作中破坏琼脂糖珠

6. 每1ml总蛋白中加入100μl Protein A琼脂糖珠(50%),4℃摇晃10min(EP管插冰上,置水平摇床上),以去除非特异性杂蛋白,降低背景

7. 4℃,14000g离心15min,将上清转移到一个新的离心管中,去除Protein A珠子

8. (Bradford 法)做蛋白标准曲线,测定蛋白浓度,测前将总蛋白至少稀释1:10倍以上,以减少细胞裂解液中去垢剂的影响(定量,分装后,可以在-20℃保存一个月)

9. 用PBS将总蛋白稀释到约1 μg/μl,以降低裂解液中去垢剂的浓度,如果兴趣蛋白在细胞中含量较低,则总蛋白浓度应该稍高(如10 μg/μl)

10. 加入一定体积的兔抗到500μl总蛋白中,抗体的稀释比例因兴趣蛋白在不同细胞系中的多少而异

11. 4℃缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或室温2h,激酶或磷酸酯酶活性分析建议用2 h室温孵育

12. 加入100μl Protein A琼脂糖珠来捕捉抗原抗体复合物,4℃缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或室温1h,如果所用抗体为鼠抗或鸡抗,建议加2 μl“过渡抗体”(兔抗鼠IgG,兔抗鸡IgG)

13. 14000rpm瞬时离心5s,收集琼脂糖珠-抗原抗体复合物,去上清,用预冷的RIPA buffer洗3遍,800μl/遍,RIPA buffer有时候会破坏琼脂糖珠-抗原抗体复合物内部的结合,可以使用PBS

14. 用60μl 2×上样缓冲液将琼脂糖珠-抗原抗体复合物悬起,轻轻混匀,缓冲液的量依据上样多少的需要而定(60 μl足够上三道)

15. 将上样样品煮5min,以游离抗原,抗体,珠子,离心,将上清电泳,收集剩余琼脂糖珠,上清也可以暂时冻-20℃,留待以后电泳,电泳前应再次煮5min变性。

RIPA Buffer配制:

基础成分:

Tris-HCl(缓冲液成分,防止蛋白变性)

NaCl(盐份,防止非特异蛋白聚集)

NP-40(非离子去污剂,提取蛋白;用H2O配制成10%储存液) 去氧胆酸钠(离子去污剂,提取蛋白;用H2O配制成10%储存液;避光保存)

注意:准备激酶(致活酶)实验时,不要加去氧胆酸钠,因为离子型去污剂能够使酶变性,导致活性丧失。

RIPA蛋白酶抑制剂

苯甲基磺酰氟(PMSF)(用异丙醇配制成200mM的储存液,室温保存)

EDTA(钙螯合剂;用H2O配制成100mM的储存液,PH 7.4)

亮抑酶肽(Leupeptin)(用H2O配制成1mg/ml的储存液,分装,-20℃保存)

抑蛋白酶肽(Aprotinin)(用H2O配制成1mg/ml的储存液,分装,-20℃保存)

胃蛋白酶抑制剂(Pepstatin)(用甲醇配制成1mg/ml的储存液,分装,-20℃保存)

RIPA磷酸(酯)酶抑制剂

激活的Na3VO4(用H2O配制成200mM的储存液,见Sodium Orthovanadate Activation Protoco)

NaF(200mM的储存液,室温保存)

注意:在准备做磷酸(酯)酶实验的时候,不加磷酸酯酶抑制剂

工作液配制:

配制100ml的modified RIPA buffe:

1. 称取790mg 的Tris-Base,加到75ml 去离子水中,加入900mg的NaCl,搅拌,直到全部溶解,用HCl调节PH值到7.4

2. 加10 ml 10%的NP-40

3. 加2.5 ml 10%的去氧胆酸钠,搅拌,直到溶液澄清

4. 加1 ml 100mM的EDTA,用量筒定容到100ml,2-8℃保存

5. 理论上,蛋白酶和磷酸酯酶抑制剂应该在使用当天同时加入(抑蛋白酶肽,亮抑酶肽,胃蛋白酶抑制剂各100 µl; PMSF, Na3VO4, NaF各500 µl),但是PMSF在水溶液中很不稳定,30分钟就会降解一半,所以PMSF应该在使用前现加,其他抑制剂成分可以在水溶液中稳定5天。

各种成分在工作液中的终浓度:

• Tris-HCl: 50 mM, pH 7.4

• NP-40: 1%

• 去氧胆酸钠:0.25%

• NaCl: 150 mM

• EDTA: 1 mM

• PMSF: 1 mM

• 抑蛋白酶肽,亮抑酶肽,胃蛋白酶抑制剂: 各1 µg/ml

• Na3VO4: 1 mM

• NaF: 1 mM

通过免疫共沉淀确定结合蛋白

1.用磷酸盐缓冲液洗30块10 cm培养板上的适宜细胞。刮去每块板上的细胞到1 ml冰冷的EBC裂解缓冲液中。

2.将每毫升细胞悬液转移到微量离心管中,在微量离心机上4℃以最大速度离心15 min。

3.收集上清(约30 ml)并加入30μg的适当抗体,4℃摇动免疫沉淀物1 h。

4.加入0.9 ml的蛋白质A-Sepharose 悬液,4℃摇动免疫沉淀物30 min。

5.用含900 mmol/L NaCl的NETN洗蛋白A-Sepharose混合物,再重复洗5次。最后,用NETN洗一次。

6.吸出混合物的液体部分。加入800μl的1×SDS胶加样缓冲液到球珠中,煮沸4 min。

7.将样品加入到大孔的不连续SDS-PAGE梯度胶中,在10 mA的恒定电流下电泳过夜。

8.通过考马斯蓝染色观察蛋白质泳带。

9.从胶上切下目标带,将其放到微量离心管中,用1ml 50%乙腈洗两次,每次3 min。

10. 用胰蛋白酶消化胶中的蛋白质,再将肽电洗脱。

11. 通过窄孔高效液相色谱分离肽。将收集的肽在ABI 477A或494A机器上进行自动Edman降解测序。

免疫共沉淀

一 原理:

IP是利用抗原蛋白质和抗体的特异性结合以及细菌蛋白质的“prorein A"特异性地结合到免疫球蛋白的FC片段的现象活用开发出来的方法。目前多用精制的prorein A预先结合固化在argarose的beads上,使之与含有抗原的溶液及抗体反应后,beads上的prorein A就能吸附抗原达到精制的目的。

实验最需要注意点就是抗体的性质。抗体不同和抗原结合能力也不同,免染能结合未必能用在IP反应。建议仔细检查抗体的说明书。特别是多抗的特异性是问题。

其次,要注意溶解抗原的缓冲液的性质。多数的抗原是细胞构成的蛋白,特别是骨架蛋白,缓冲液必须要使其溶解。为此,必须使用含有强界面活性剂的缓冲液,尽管它有可能影响一部分抗原抗体的结合。另一面,如用弱界面活性剂溶解细胞,就不能充分溶解细胞蛋白。即便溶解也产生与其它的蛋白结合的结果,抗原决定族被封闭,影响与抗体的结合,即使IP成功,也是很多蛋白与抗体共沉的悲惨结果。

再次,为防止蛋白的分解,修饰,溶解抗原的缓冲液必须加蛋白每抑制剂,低温下进行实验。

每次实验之前,首先考虑抗体/缓冲液的比例。抗体过少就不能检出抗原,过多则就不能沉降在beads上,残存在上清。缓冲剂太少则不能溶解抗原,过多则抗原被稀释。欲速则不达,确定好比例很必要。

二 准备:

器械

#微量高速冷冻离心机

#移液枪

#旋转盘

#电泳设备

#vortex震荡器

#液氮及组织粉碎器 #eppentube

试剂

#细胞或组织

#蛋白定量kit

#SDS电泳试剂

#抗体(单抗时选择protein G,二抗选择抗鼠Ig兔血清)

#PBS

#NaN3 #proteinA sapharose

试剂配制

抗原蛋白溶解缓冲液

1.RIPA缓冲液 (最终浓度)

1MTris-HCL(PH7.4) 5ml (10mM) 5MNacl 15ml (150mM)

0.5M EDTA(PH7.4) 5ml (5mM)

20%TritonX-100 25ml (1%) 10% DOC 50ml (1%) 10%SDS 5ml ( o.1%)

TLCK 18.5mg (0.1mM) TPCK 35mg (0.2mM) DDW 395ml toal 500ml

另外,使用之前加1mMPMSF(PMSF溶在酒精,浓度100mM,-20度遮光保存。注意不易溶于水)

2.NP40 lysis 缓冲液

1MTris-HCL(PH7.4) 5ml (10mM) 5MNacl 15ml (150mM)

0.5M EDTA(PH7.4) 5ml (5mM) 20%NP40 25ml (1%)

TLCK 18.5mg (0.1mM) TPCK 35mg (0.2mM) DDW 450ml toal 500ml

使用前加1mM的PMSF

注意点:

*Tris缓冲剂PH随温度变化,高浓度盐酸滴定时发热,冷却后PH增高。

*反复使用PMSF要注意保管方法。

*1和2的缓冲剂的区别在于界面活性剂。TritonX-100,NP40是非离子界面活性剂,作用温和,,DOC

*两方都有EDTA,对抗原而言,二价离子Mg,Ca等是必要的。根据自己需要调节。EDTA用NaOH滴定。

Protocol

1 调制protein A sapharose

protein A sapharose 5ml 溶于20ml含0.02%NaN3的PBS

离心2000转2分,去上清,在沉淀加0.02%NaN3的PBS,离心后去上清,重复2次,最后沉淀加20ml含0.02%NaN3的PBS,冷藏保存

用单抗做一抗时,把protein A sapharose先用抗鼠Ig兔血清处理(每50ulprotein A sapharose用1-5ul血清)。旋转1-2h,

混匀后,再离心1-2s

去上清后,加PBS,vortex混合,离心去上清,重复二次

加含0.02%NaN3的PBS到原来体积,冷存。避免长期保存。

2.抗原的检出

以下操作全在冰面或4度进行

去除细胞培养液,用冷PBS洗一次。加RIPA,溶解后,转移到eppentube中用vortex混匀。RIPA的量:6cm的培养皿加1 ml(蛋白质的量为500mg/ml),组织块用液氮粉碎,在缓冲剂中捣匀,蛋白定量。

30m,15000rpm离心,上清转移到新tube 。不用移液枪,直接从tube倒进另一个tube

往上清加抗体,1ml加2-5ul抗体,冷室内旋转混匀1h

加protein A sapharose50ul,再混匀1h

5000rpm离心1s,使sapharose沉淀,去上清。往sapharose加RIPA,vortex 混匀,离心,去上清。重复4次洗净。

加电泳用 sample 缓冲液40ul,2m煮沸,泳动后,固定/干燥胶,现像。

3.注意点

A:不熟练使用移液枪,会混入沉淀的不溶性蛋白,使实验失败。对无论怎么也除不去的混入蛋白,只使用上清的上半部,或用超速离心机。

B:对电泳的非特异条带,最后可依次用含300mM,1omMNaCl的RIPA洗净各一次。(完)

阅读全文(5393) / 评论(10) / 给紫晓留言 / 扔小纸条 / 文件夹: 医学知识

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免疫共沉淀技术路线

准备工作:

预冷PBS,RIPA Buffer,细胞刮子(用保鲜膜包好后,埋冰下),离心机

1. 用预冷的PBS洗涤细胞两次,最后一次吸干PBS;

2. 加入预冷的RIPA Buffer(1ml/107个细胞、10cm培养皿或150cm2培养瓶,0.5ml/5×106个细胞、6cm培养皿、75cm2培养瓶)

3. 用预冷的细胞刮子将细胞从培养皿或培养瓶上刮下,把悬液转到1.5EP管中,4℃,缓慢晃动15min(EP管插冰上,置水平摇床上)

4. 4℃,14000g离心15min,立即将上清转移到一个新的离心管中

5. 准备Protein A agarose,用PBS 洗两遍珠子,然后用PBS配制成50%浓度,建议减掉枪尖部分,避免在涉及琼脂糖珠的操作中破坏琼脂糖珠

6. 每1ml总蛋白中加入100μl Protein A琼脂糖珠(50%),4℃摇晃10min(EP管插冰上,置水平摇床上),以去除非特异性杂蛋白,降低背景

7. 4℃,14000g离心15min,将上清转移到一个新的离心管中,去除Protein A珠子

8. (Bradford 法)做蛋白标准曲线,测定蛋白浓度,测前将总蛋白至少稀释1:10倍以上,以减少细胞裂解液中去垢剂的影响(定量,分装后,可以在-20℃保存一个月)

9. 用PBS将总蛋白稀释到约1 μg/μl,以降低裂解液中去垢剂的浓度,如果兴趣蛋白在细胞中含量较低,则总蛋白浓度应该稍高(如10 μg/μl)

10. 加入一定体积的兔抗到500μl总蛋白中,抗体的稀释比例因兴趣蛋白在不同细胞系中的多少而异

11. 4℃缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或室温2h,激酶或磷酸酯酶活性分析建议用2 h室温孵育

12. 加入100μl Protein A琼脂糖珠来捕捉抗原抗体复合物,4℃缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或室温1h,如果所用抗体为鼠抗或鸡抗,建议加2 μl“过渡抗体”(兔抗鼠IgG,兔抗鸡IgG)

13. 14000rpm瞬时离心5s,收集琼脂糖珠-抗原抗体复合物,去上清,用预冷的RIPA buffer洗3遍,800μl/遍,RIPA buffer有时候会破坏琼脂糖珠-抗原抗体复合物内部的结合,可以使用PBS

14. 用60μl 2×上样缓冲液将琼脂糖珠-抗原抗体复合物悬起,轻轻混匀,缓冲液的量依据上样多少的需要而定(60 μl足够上三道)

15. 将上样样品煮5min,以游离抗原,抗体,珠子,离心,将上清电泳,收集剩余琼脂糖珠,上清也可以暂时冻-20℃,留待以后电泳,电泳前应再次煮5min变性。

RIPA Buffer配制:

基础成分:

Tris-HCl(缓冲液成分,防止蛋白变性)

NaCl(盐份,防止非特异蛋白聚集)

NP-40(非离子去污剂,提取蛋白;用H2O配制成10%储存液) 去氧胆酸钠(离子去污剂,提取蛋白;用H2O配制成10%储存液;避光保存)

注意:准备激酶(致活酶)实验时,不要加去氧胆酸钠,因为离子型去污剂能够使酶变性,导致活性丧失。

RIPA蛋白酶抑制剂

苯甲基磺酰氟(PMSF)(用异丙醇配制成200mM的储存液,室温保存)

EDTA(钙螯合剂;用H2O配制成100mM的储存液,PH 7.4)

亮抑酶肽(Leupeptin)(用H2O配制成1mg/ml的储存液,分装,-20℃保存)

抑蛋白酶肽(Aprotinin)(用H2O配制成1mg/ml的储存液,分装,-20℃保存)

胃蛋白酶抑制剂(Pepstatin)(用甲醇配制成1mg/ml的储存液,分装,-20℃保存)

RIPA磷酸(酯)酶抑制剂

激活的Na3VO4(用H2O配制成200mM的储存液,见Sodium Orthovanadate Activation Protoco)

NaF(200mM的储存液,室温保存)

注意:在准备做磷酸(酯)酶实验的时候,不加磷酸酯酶抑制剂

工作液配制:

配制100ml的modified RIPA buffe:

1. 称取790mg 的Tris-Base,加到75ml 去离子水中,加入900mg的NaCl,搅拌,直到全部溶解,用HCl调节PH值到7.4

2. 加10 ml 10%的NP-40

3. 加2.5 ml 10%的去氧胆酸钠,搅拌,直到溶液澄清

4. 加1 ml 100mM的EDTA,用量筒定容到100ml,2-8℃保存

5. 理论上,蛋白酶和磷酸酯酶抑制剂应该在使用当天同时加入(抑蛋白酶肽,亮抑酶肽,胃蛋白酶抑制剂各100 µl; PMSF, Na3VO4, NaF各500 µl),但是PMSF在水溶液中很不稳定,30分钟就会降解一半,所以PMSF应该在使用前现加,其他抑制剂成分可以在水溶液中稳定5天。

各种成分在工作液中的终浓度:

• Tris-HCl: 50 mM, pH 7.4

• NP-40: 1%

• 去氧胆酸钠:0.25%

• NaCl: 150 mM

• EDTA: 1 mM

• PMSF: 1 mM

• 抑蛋白酶肽,亮抑酶肽,胃蛋白酶抑制剂: 各1 µg/ml

• Na3VO4: 1 mM

• NaF: 1 mM

通过免疫共沉淀确定结合蛋白

1.用磷酸盐缓冲液洗30块10 cm培养板上的适宜细胞。刮去每块板上的细胞到1 ml冰冷的EBC裂解缓冲液中。

2.将每毫升细胞悬液转移到微量离心管中,在微量离心机上4℃以最大速度离心15 min。

3.收集上清(约30 ml)并加入30μg的适当抗体,4℃摇动免疫沉淀物1 h。

4.加入0.9 ml的蛋白质A-Sepharose 悬液,4℃摇动免疫沉淀物30 min。

5.用含900 mmol/L NaCl的NETN洗蛋白A-Sepharose混合物,再重复洗5次。最后,用NETN洗一次。

6.吸出混合物的液体部分。加入800μl的1×SDS胶加样缓冲液到球珠中,煮沸4 min。

7.将样品加入到大孔的不连续SDS-PAGE梯度胶中,在10 mA的恒定电流下电泳过夜。

8.通过考马斯蓝染色观察蛋白质泳带。

9.从胶上切下目标带,将其放到微量离心管中,用1ml 50%乙腈洗两次,每次3 min。

10. 用胰蛋白酶消化胶中的蛋白质,再将肽电洗脱。

11. 通过窄孔高效液相色谱分离肽。将收集的肽在ABI 477A或494A机器上进行自动Edman降解测序。

范文十:免疫共沉淀

原理:免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation)是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。 其原理是:当细胞在非变性条件下被裂解时,完整细胞内存在的许多蛋白质-蛋白质间的相互作用被保留了下来。如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X,那么与X在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。目前多用精制的protein A预先结合固化在argarose的beads上,使之与含有抗原的溶液及抗体反应后,beads上的protein A就能吸附抗原达到精制的目的。这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合;也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档。

二、准备工作:

预冷PBS,RIPA Buffer,细胞刮子(用保鲜膜包好后,埋冰下),离心机

1. 用预冷的PBS洗涤细胞两次,最后一次吸干PBS;

2. 加入预冷的200ul RIPA Buffer (10cm培养皿)

3. 用预冷的细胞刮子将细胞从培养皿或培养瓶上刮下,把悬液转到2.0 EP管中,4℃,缓慢晃动15min(EP管插冰上,置水平摇床上)

4. 4℃,14000g离心15min,立即将上清转移到一个新的离心管中

5. 准备Protein A agarose,用PBS 洗两遍珠子,然后用PBS配制成50%浓度,建议减掉枪尖部分,避免在涉及琼脂糖珠的操作中破坏琼脂糖珠

6. 取30μl protein A 琼脂糖珠,用冷PBS洗3 次,每次3,000 rpm离心3 min;

7. 将预处理过的30μl protein A 琼脂糖珠加入到和抗体孵育过夜的细胞裂解液中4°C缓慢摇晃孵育过夜,使抗体与protein A琼脂糖珠偶连;

8. 免疫沉淀反应后,在4°C 以3,000 rpm 速度离心3 min,将琼脂糖珠离心至管底;将上清小心吸去,琼脂糖珠用1ml裂解缓冲液洗3-4次;最后加入的5×上样缓冲液,沸水煮10分钟;

9. Western blotting

实验第一步验证nemo与pidd的相互作用关系:

(1)5个10cm培养皿培养BV-2细胞

(2)每个皿加入200ul的中等强度的RIPA裂解液,裂解细胞

a Input组

b IgG组

c pidd抗体protein A 琼脂糖珠组孵育过夜

加入5×上样缓冲液煮10分钟

a、b、c组孵育nemo抗体,来证明nemo可以拉出pidd

a Input组

b IgG组

c nemo抗体protein A 琼脂糖珠组孵育过夜

加入5×上样缓冲液煮10分钟

a、b、c组孵育pidd抗体,来证明pidd可以拉出nemo

实验第二步分别转染带flag-空载体与flag-pidd-c

flag-空载体按上述提取细胞分两组,分别加入flag抗体与protein A 琼脂糖珠孵育过夜,分别用flag抗体与nemo抗体

flag-pidd-c按上述提取细胞分两组,分别加入flag抗体与protein A 琼脂糖珠孵育过夜,分别加入flag抗体与nemo抗体

实验第三步分别转染带flag-空载体与flag-pidd-cc

flag-空载体按上述提取细胞分两组,分别加入flag抗体与protein A 琼脂糖珠孵育过夜,分别用flag抗体与nemo抗体

flag-pidd-cc按上述提取细胞分两组,分别加入flag抗体与protein A 琼脂糖珠孵育过夜,分别加入flag抗体与nemo抗体