免疫共沉淀

范文一:免疫共沉淀

1. 免疫沉淀(Immunoprecipitation, IP):

A.蛋白样品的准备:

A1.对于10厘米细胞培养皿中的贴壁细胞,吸除细胞培养液,PBS洗涤一次,然后加入500微升至2毫升细胞裂解液裂解细胞。可以使用碧云天生产的Western及IP细胞裂解液(P0013)或各种RIPA裂解液(P0013B、P0013C、P0013D或P0013E)等进行细胞的裂解。

A2.对于组织样品参考贴壁细胞使用裂解液的比例进行裂解。

A3.对于悬浮细胞,离心收集细胞后,PBS洗涤一次,然后参考贴壁细胞的裂解方法进行裂解。

注:详细的裂解方法参考不同裂解液的详细使用方法。对于不同的培养器材,参考10厘米培养皿的裂解液的用量进行裂解。如果裂解获得的蛋白样品浓度过高,可以用裂解液或PBS适当稀释,如果蛋白样品浓度过低,在以后的裂解过程中宜适当减少裂解液的用量。

B.去除非特异性结合(可选做):

B1.取200微升至1毫升蛋白样品,蛋白量约为200微克至1毫克,加入约1微克和免疫沉淀时使用的IgG种属相同的普通IgG和20微升充分重悬的Protein G Agarose,4℃缓慢摇动30分钟至2小时。

B2.2500rpm(约1000g)离心5分钟,取上清用于后续的免疫沉淀。

注:所谓种属相同的IgG是指,例如后续免疫沉淀时用的是小鼠IgG,则在本步骤中可以加入normal mouse IgG,如无normal IgG可以加入其它不影响后续检测的其它mouse IgG类型的抗体。通过和normal IgG和Protein G Agarose的孵育,可以充分降低非特异性的结合,降低背景。

C.免疫沉淀:

C1.加入0.2-2微克用于免疫沉淀的一抗,4℃缓慢摇动过夜。

C2.再加入20微升充分重悬的Protein G Agarose,4℃缓慢摇动1-3个小时。(为方便后续的洗涤操作可以把加入充分重悬的Protein G Agarose的量调整为40微升。)

C3.2500rpm(约1000g)离心5分钟,或瞬时高速离心,小心吸除上清,注意宁可留下少量上清也不能吸掉Protein G Agarose。

C4.用准备蛋白样品时的裂解液或PBS洗涤沉淀5次,裂解液或PBS的用量每次为0.5-1毫升。洗涤时离心条件和吸除上清的要求同上面的步骤C3。

C5.完成最后一次洗涤后,去除上清,加入20-40微升1XSDS-PAGE电泳上样缓冲液Vortex重悬沉淀,瞬时高速离心把样品离心至管底。

C6.100℃或沸水浴处理3-5分钟,取部分或全部样品用于SDS-PAGE电泳,暂时不用的样品可以-20℃保存。

2.免疫共沉淀:

参考免疫沉淀的方法进行,但免疫共沉淀(co-IP)通常必须使用未经冻存的新鲜蛋白样品。普通的免疫沉淀虽然可以使用冻存的蛋白样品,但也宜用新鲜的蛋白样品为佳。

免疫共沉淀

一 原理:

IP是利用抗原蛋白质和抗体的特异性结合以及细菌蛋白质的“prorein A"特异性地结合到免疫球蛋白的FC片段的现象活用开发出来的方法。目前多用精制的prorein A预先结合固化在argarose的beads上,使之与含有抗原的溶液及抗体反应后,beads上的prorein A就能吸附抗原达到精制的目的。

实验最需要注意点就是抗体的性质。抗体不同和抗原结合能力也不同,免染能结合未必能用在IP反应。建议仔细检查抗体

的说明书。特别是多抗的特异性是问题。

其次,要注意溶解抗原的缓冲液的性质。多数的抗原是细胞构成的蛋白,特别是骨架蛋白,缓冲液必须要使其溶解。为此,必须使用含有强界面活性剂的缓冲液,尽管它有可能影响一部分抗原抗体的结合。另一面,如用弱界面活性剂溶解细胞,就不能充分溶解细胞蛋白。即便溶解也产生与其它的蛋白结合的结果,抗原决定族被封闭,影响与抗体的结合,即使IP成功,也是很多蛋白与抗体共沉的悲惨结果。

再次,为防止蛋白的分解,修饰,溶解抗原的缓冲液必须加蛋白每抑制剂,低温下进行实验。

每次实验之前,首先考虑抗体/缓冲液的比例。抗体过少就不能检出抗原,过多则就不能沉降在beads上,残存在上清。缓冲剂太少则不能溶解抗原,过多则抗原被稀释。欲速则不达,确定好比例很必要。

二 准备:

器械

#微量高速冷冻离心机

#移液枪

#旋转盘

#电泳设备

#vortex震荡器

#液氮及组织粉碎器 #eppentube

试剂

#细胞或组织

#蛋白定量kit

#SDS电泳试剂

#抗体(单抗时选择protein G,二抗选择抗鼠Ig兔血清) #PBS #NaN3 #proteinA sapharose

试剂配制

抗原蛋白溶解缓冲液

1.RIPA缓冲液 (最终浓度)

1MTris-HCL(PH7.4) 5ml (10mM) 5MNacl 15ml (150mM)

0.5M EDTA(PH7.4) 5ml (5mM)

20%TritonX-100 25ml (1%) 10% DOC 50ml (1%) 10%SDS 5ml ( o.1%)

TLCK 18.5mg (0.1mM) TPCK 35mg (0.2mM) DDW 395ml toal 500ml

另外,使用之前加1mMPMSF(PMSF溶在酒精,浓度100mM,-20度遮光保存。注意不易溶于水)

2.NP40 lysis 缓冲液

1MTris-HCL(PH7.4) 5ml (10mM) 5MNacl 15ml (150mM)

0.5M EDTA(PH7.4) 5ml (5mM) 20%NP40 25ml (1%)

TLCK 18.5mg (0.1mM) TPCK 35mg (0.2mM) DDW 450ml toal 500ml

使用前加1mM的PMSF

注意点:

*Tris缓冲剂PH随温度变化,高浓度盐酸滴定时发热,冷却后PH增高。

*反复使用PMSF要注意保管方法。

*1和2的缓冲剂的区别在于界面活性剂。TritonX-100,NP40是非离子界面活性剂,作用温和,,DOC

*两方都有EDTA,对抗原而言,二价离子Mg,Ca等是必要的。根据自己需要调节。EDTA用NaOH滴定。

Protocol

1 调制protein A sapharose

protein A sapharose 5ml 溶于20ml含0.02%NaN3的PBS

离心2000转2分,去上清,在沉淀加0.02%NaN3的PBS,离心后去上清,重复2次,最后沉淀加20ml含0.02%NaN3的PBS,冷藏保存

用单抗做一抗时,把protein A sapharose先用抗鼠Ig兔血清处理(每50ulprotein A sapharose用1-5ul血清)。旋转1-2h,混匀后,再离心1-2s

去上清后,加PBS,vortex混合,离心去上清,重复二次

加含0.02%NaN3的PBS到原来体积,冷存。避免长期保存。

2.抗原的检出

以下操作全在冰面或4度进行

去除细胞培养液,用冷PBS洗一次。加RIPA,溶解后,转移到eppentube中用vortex混匀。RIPA的量:6cm的培养皿加1 ml(蛋白质的量为500mg/ml),组织块用液氮粉碎,在缓冲剂中捣匀,蛋白定量。

30m,15000rpm离心,上清转移到新tube 。不用移液枪,直接从tube倒进另一个tube

往上清加抗体,1ml加2-5ul抗体,冷室内旋转混匀1h

加protein A sapharose50ul,再混匀1h

5000rpm离心1s,使sapharose沉淀,去上清。往sapharose加RIPA,vortex 混匀,离心,去上清。重复4次洗净。

加电泳用 sample 缓冲液40ul,2m煮沸,泳动后,固定/干燥胶,现像。

3.注意点

A:不熟练使用移液枪,会混入沉淀的不溶性蛋白,使实验失败。对无论怎么也除不去的混入蛋白,只使用上清的上半部,或用超速离心机。

B:对电泳的非特异条带,最后可依次用含300mM,1omMNaCl的RIPA洗净各一次。(完)

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免疫共沉淀技术路线

准备工作:

预冷PBS,RIPA Buffer,细胞刮子(用保鲜膜包好后,埋冰下),离心机

1. 用预冷的PBS洗涤细胞两次,最后一次吸干PBS;

2. 加入预冷的RIPA Buffer(1ml/107个细胞、10cm培养皿或150cm2培养瓶,0.5ml/5×106个细胞、6cm培养皿、75cm2培养瓶)

3. 用预冷的细胞刮子将细胞从培养皿或培养瓶上刮下,把悬液转到1.5EP管中,4℃,缓慢晃动15min(EP管插冰上,置水平摇床上)

4. 4℃,14000g离心15min,立即将上清转移到一个新的离心管中

5. 准备Protein A agarose,用PBS 洗两遍珠子,然后用PBS配制成50%浓度,建议减掉枪尖部分,避免在涉及琼脂糖珠的操作中破坏琼脂糖珠

6. 每1ml总蛋白中加入100μl Protein A琼脂糖珠(50%),4℃摇晃10min(EP管插冰上,置水平摇床上),以去除非特异性杂蛋白,降低背景

7. 4℃,14000g离心15min,将上清转移到一个新的离心管中,去除Protein A珠子

8. (Bradford 法)做蛋白标准曲线,测定蛋白浓度,测前将总蛋白至少稀释1:10倍以上,以减少细胞裂解液中去垢剂的影响(定量,分装后,可以在-20℃保存一个月)

9. 用PBS将总蛋白稀释到约1 μg/μl,以降低裂解液中去垢剂的浓度,如果兴趣蛋白在细胞中含量较低,则总蛋白浓度应该稍高(如10 μg/μl)

10. 加入一定体积的兔抗到500μl总蛋白中,抗体的稀释比例因兴趣蛋白在不同细胞系中的多少而异

11. 4℃缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或室温2h,激酶或磷酸酯酶活性分析建议用2 h室温孵育

12. 加入100μl Protein A琼脂糖珠来捕捉抗原抗体复合物,4℃缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或室温1h,如果所用抗体为鼠抗或鸡抗,建议加2 μl“过渡抗体”(兔抗鼠IgG,兔抗鸡IgG)

13. 14000rpm瞬时离心5s,收集琼脂糖珠-抗原抗体复合物,去上清,用预冷的RIPA buffer洗3遍,800μl/遍,RIPA buffer有时候会破坏琼脂糖珠-抗原抗体复合物内部的结合,可以使用PBS

14. 用60μl 2×上样缓冲液将琼脂糖珠-抗原抗体复合物悬起,轻轻混匀,缓冲液的量依据上样多少的需要而定(60 μl足够上三道)

15. 将上样样品煮5min,以游离抗原,抗体,珠子,离心,将上清电泳,收集剩余琼脂糖珠,上清也可以暂时冻-20℃,留待以后电泳,电泳前应再次煮5min变性。

RIPA Buffer配制:

基础成分:

Tris-HCl(缓冲液成分,防止蛋白变性)

NaCl(盐份,防止非特异蛋白聚集)

NP-40(非离子去污剂,提取蛋白;用H2O配制成10%储存液) 去氧胆酸钠(离子去污剂,提取蛋白;用H2O配制成10%储存液;避光保存)

注意:准备激酶(致活酶)实验时,不要加去氧胆酸钠,因为离子型去污剂能够使酶变性,导致活性丧失。

RIPA蛋白酶抑制剂

苯甲基磺酰氟(PMSF)(用异丙醇配制成200mM的储存液,室温保存)

EDTA(钙螯合剂;用H2O配制成100mM的储存液,PH 7.4)

亮抑酶肽(Leupeptin)(用H2O配制成1mg/ml的储存液,分装,-20℃保存)

抑蛋白酶肽(Aprotinin)(用H2O配制成1mg/ml的储存液,分装,-20℃保存)

胃蛋白酶抑制剂(Pepstatin)(用甲醇配制成1mg/ml的储存液,分装,-20℃保存)

RIPA磷酸(酯)酶抑制剂

激活的Na3VO4(用H2O配制成200mM的储存液,见Sodium Orthovanadate Activation Protoco)

NaF(200mM的储存液,室温保存)

注意:在准备做磷酸(酯)酶实验的时候,不加磷酸酯酶抑制剂

工作液配制:

配制100ml的modified RIPA buffe:

1. 称取790mg 的Tris-Base,加到75ml 去离子水中,加入900mg的NaCl,搅拌,直到全部溶解,用HCl调节PH值到7.4

2. 加10 ml 10%的NP-40

3. 加2.5 ml 10%的去氧胆酸钠,搅拌,直到溶液澄清

4. 加1 ml 100mM的EDTA,用量筒定容到100ml,2-8℃保存

5. 理论上,蛋白酶和磷酸酯酶抑制剂应该在使用当天同时加入(抑蛋白酶肽,亮抑酶肽,胃蛋白酶抑制剂各100 µl; PMSF, Na3VO4, NaF各500 µl),但是PMSF在水溶液中很不稳定,30分钟就会降解一半,所以PMSF应该在使用前现加,其他抑制剂成分可以在水溶液中稳定5天。

各种成分在工作液中的终浓度:

• Tris-HCl: 50 mM, pH 7.4

• NP-40: 1%

• 去氧胆酸钠:0.25%

• NaCl: 150 mM

• EDTA: 1 mM

• PMSF: 1 mM

• 抑蛋白酶肽,亮抑酶肽,胃蛋白酶抑制剂: 各1 µg/ml

• Na3VO4: 1 mM

• NaF: 1 mM

通过免疫共沉淀确定结合蛋白

1.用磷酸盐缓冲液洗30块10 cm培养板上的适宜细胞。刮去每块板上的细胞到1 ml冰冷的EBC裂解缓冲液中。

2.将每毫升细胞悬液转移到微量离心管中,在微量离心机上4℃以最大速度离心15 min。

3.收集上清(约30 ml)并加入30μg的适当抗体,4℃摇动免疫沉淀物1 h。

4.加入0.9 ml的蛋白质A-Sepharose 悬液,4℃摇动免疫沉淀物30 min。

5.用含900 mmol/L NaCl的NETN洗蛋白A-Sepharose混合物,再重复洗5次。最后,用NETN洗一次。

6.吸出混合物的液体部分。加入800μl的1×SDS胶加样缓冲液到球珠中,煮沸4 min。

7.将样品加入到大孔的不连续SDS-PAGE梯度胶中,在10 mA的恒定电流下电泳过夜。

8.通过考马斯蓝染色观察蛋白质泳带。

9.从胶上切下目标带,将其放到微量离心管中,用1ml 50%乙腈洗两次,每次3 min。

10. 用胰蛋白酶消化胶中的蛋白质,再将肽电洗脱。

11. 通过窄孔高效液相色谱分离肽。将收集的肽在ABI 477A或494A机器上进行自动Edman降解测序。

免疫共沉淀

一 原理:

IP是利用抗原蛋白质和抗体的特异性结合以及细菌蛋白质的“prorein A"特异性地结合到免疫球蛋白的FC片段的现象活用开发出来的方法。目前多用精制的prorein A预先结合固化在argarose的beads上,使之与含有抗原的溶液及抗体反应后,beads上的prorein A就能吸附抗原达到精制的目的。

实验最需要注意点就是抗体的性质。抗体不同和抗原结合能力也不同,免染能结合未必能用在IP反应。建议仔细检查抗体的说明书。特别是多抗的特异性是问题。

其次,要注意溶解抗原的缓冲液的性质。多数的抗原是细胞构成的蛋白,特别是骨架蛋白,缓冲液必须要使其溶解。为此,必须使用含有强界面活性剂的缓冲液,尽管它有可能影响一部分抗原抗体的结合。另一面,如用弱界面活性剂溶解细胞,就不能充分溶解细胞蛋白。即便溶解也产生与其它的蛋白结合的结果,抗原决定族被封闭,影响与抗体的结合,即使IP成功,也是很多蛋白与抗体共沉的悲惨结果。

再次,为防止蛋白的分解,修饰,溶解抗原的缓冲液必须加蛋白每抑制剂,低温下进行实验。

每次实验之前,首先考虑抗体/缓冲液的比例。抗体过少就不能检出抗原,过多则就不能沉降在beads上,残存在上清。缓冲剂太少则不能溶解抗原,过多则抗原被稀释。欲速则不达,确定好比例很必要。

二 准备:

器械

#微量高速冷冻离心机

#移液枪

#旋转盘

#电泳设备

#vortex震荡器

#液氮及组织粉碎器 #eppentube

试剂

#细胞或组织

#蛋白定量kit

#SDS电泳试剂

#抗体(单抗时选择protein G,二抗选择抗鼠Ig兔血清)

#PBS

#NaN3 #proteinA sapharose

试剂配制

抗原蛋白溶解缓冲液

1.RIPA缓冲液 (最终浓度)

1MTris-HCL(PH7.4) 5ml (10mM) 5MNacl 15ml (150mM)

0.5M EDTA(PH7.4) 5ml (5mM)

20%TritonX-100 25ml (1%) 10% DOC 50ml (1%) 10%SDS 5ml ( o.1%)

TLCK 18.5mg (0.1mM) TPCK 35mg (0.2mM) DDW 395ml toal 500ml

另外,使用之前加1mMPMSF(PMSF溶在酒精,浓度100mM,-20度遮光保存。注意不易溶于水)

2.NP40 lysis 缓冲液

1MTris-HCL(PH7.4) 5ml (10mM) 5MNacl 15ml (150mM)

0.5M EDTA(PH7.4) 5ml (5mM) 20%NP40 25ml (1%)

TLCK 18.5mg (0.1mM) TPCK 35mg (0.2mM) DDW 450ml toal 500ml

使用前加1mM的PMSF

注意点:

*Tris缓冲剂PH随温度变化,高浓度盐酸滴定时发热,冷却后PH增高。

*反复使用PMSF要注意保管方法。

*1和2的缓冲剂的区别在于界面活性剂。TritonX-100,NP40是非离子界面活性剂,作用温和,,DOC

*两方都有EDTA,对抗原而言,二价离子Mg,Ca等是必要的。根据自己需要调节。EDTA用NaOH滴定。

Protocol

1 调制protein A sapharose

protein A sapharose 5ml 溶于20ml含0.02%NaN3的PBS

离心2000转2分,去上清,在沉淀加0.02%NaN3的PBS,离心后去上清,重复2次,最后沉淀加20ml含0.02%NaN3的PBS,冷藏保存

用单抗做一抗时,把protein A sapharose先用抗鼠Ig兔血清处理(每50ulprotein A sapharose用1-5ul血清)。旋转1-2h,

混匀后,再离心1-2s

去上清后,加PBS,vortex混合,离心去上清,重复二次

加含0.02%NaN3的PBS到原来体积,冷存。避免长期保存。

2.抗原的检出

以下操作全在冰面或4度进行

去除细胞培养液,用冷PBS洗一次。加RIPA,溶解后,转移到eppentube中用vortex混匀。RIPA的量:6cm的培养皿加1 ml(蛋白质的量为500mg/ml),组织块用液氮粉碎,在缓冲剂中捣匀,蛋白定量。

30m,15000rpm离心,上清转移到新tube 。不用移液枪,直接从tube倒进另一个tube

往上清加抗体,1ml加2-5ul抗体,冷室内旋转混匀1h

加protein A sapharose50ul,再混匀1h

5000rpm离心1s,使sapharose沉淀,去上清。往sapharose加RIPA,vortex 混匀,离心,去上清。重复4次洗净。

加电泳用 sample 缓冲液40ul,2m煮沸,泳动后,固定/干燥胶,现像。

3.注意点

A:不熟练使用移液枪,会混入沉淀的不溶性蛋白,使实验失败。对无论怎么也除不去的混入蛋白,只使用上清的上半部,或用超速离心机。

B:对电泳的非特异条带,最后可依次用含300mM,1omMNaCl的RIPA洗净各一次。(完)

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免疫共沉淀技术路线

准备工作:

预冷PBS,RIPA Buffer,细胞刮子(用保鲜膜包好后,埋冰下),离心机

1. 用预冷的PBS洗涤细胞两次,最后一次吸干PBS;

2. 加入预冷的RIPA Buffer(1ml/107个细胞、10cm培养皿或150cm2培养瓶,0.5ml/5×106个细胞、6cm培养皿、75cm2培养瓶)

3. 用预冷的细胞刮子将细胞从培养皿或培养瓶上刮下,把悬液转到1.5EP管中,4℃,缓慢晃动15min(EP管插冰上,置水平摇床上)

4. 4℃,14000g离心15min,立即将上清转移到一个新的离心管中

5. 准备Protein A agarose,用PBS 洗两遍珠子,然后用PBS配制成50%浓度,建议减掉枪尖部分,避免在涉及琼脂糖珠的操作中破坏琼脂糖珠

6. 每1ml总蛋白中加入100μl Protein A琼脂糖珠(50%),4℃摇晃10min(EP管插冰上,置水平摇床上),以去除非特异性杂蛋白,降低背景

7. 4℃,14000g离心15min,将上清转移到一个新的离心管中,去除Protein A珠子

8. (Bradford 法)做蛋白标准曲线,测定蛋白浓度,测前将总蛋白至少稀释1:10倍以上,以减少细胞裂解液中去垢剂的影响(定量,分装后,可以在-20℃保存一个月)

9. 用PBS将总蛋白稀释到约1 μg/μl,以降低裂解液中去垢剂的浓度,如果兴趣蛋白在细胞中含量较低,则总蛋白浓度应该稍高(如10 μg/μl)

10. 加入一定体积的兔抗到500μl总蛋白中,抗体的稀释比例因兴趣蛋白在不同细胞系中的多少而异

11. 4℃缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或室温2h,激酶或磷酸酯酶活性分析建议用2 h室温孵育

12. 加入100μl Protein A琼脂糖珠来捕捉抗原抗体复合物,4℃缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或室温1h,如果所用抗体为鼠抗或鸡抗,建议加2 μl“过渡抗体”(兔抗鼠IgG,兔抗鸡IgG)

13. 14000rpm瞬时离心5s,收集琼脂糖珠-抗原抗体复合物,去上清,用预冷的RIPA buffer洗3遍,800μl/遍,RIPA buffer有时候会破坏琼脂糖珠-抗原抗体复合物内部的结合,可以使用PBS

14. 用60μl 2×上样缓冲液将琼脂糖珠-抗原抗体复合物悬起,轻轻混匀,缓冲液的量依据上样多少的需要而定(60 μl足够上三道)

15. 将上样样品煮5min,以游离抗原,抗体,珠子,离心,将上清电泳,收集剩余琼脂糖珠,上清也可以暂时冻-20℃,留待以后电泳,电泳前应再次煮5min变性。

RIPA Buffer配制:

基础成分:

Tris-HCl(缓冲液成分,防止蛋白变性)

NaCl(盐份,防止非特异蛋白聚集)

NP-40(非离子去污剂,提取蛋白;用H2O配制成10%储存液) 去氧胆酸钠(离子去污剂,提取蛋白;用H2O配制成10%储存液;避光保存)

注意:准备激酶(致活酶)实验时,不要加去氧胆酸钠,因为离子型去污剂能够使酶变性,导致活性丧失。

RIPA蛋白酶抑制剂

苯甲基磺酰氟(PMSF)(用异丙醇配制成200mM的储存液,室温保存)

EDTA(钙螯合剂;用H2O配制成100mM的储存液,PH 7.4)

亮抑酶肽(Leupeptin)(用H2O配制成1mg/ml的储存液,分装,-20℃保存)

抑蛋白酶肽(Aprotinin)(用H2O配制成1mg/ml的储存液,分装,-20℃保存)

胃蛋白酶抑制剂(Pepstatin)(用甲醇配制成1mg/ml的储存液,分装,-20℃保存)

RIPA磷酸(酯)酶抑制剂

激活的Na3VO4(用H2O配制成200mM的储存液,见Sodium Orthovanadate Activation Protoco)

NaF(200mM的储存液,室温保存)

注意:在准备做磷酸(酯)酶实验的时候,不加磷酸酯酶抑制剂

工作液配制:

配制100ml的modified RIPA buffe:

1. 称取790mg 的Tris-Base,加到75ml 去离子水中,加入900mg的NaCl,搅拌,直到全部溶解,用HCl调节PH值到7.4

2. 加10 ml 10%的NP-40

3. 加2.5 ml 10%的去氧胆酸钠,搅拌,直到溶液澄清

4. 加1 ml 100mM的EDTA,用量筒定容到100ml,2-8℃保存

5. 理论上,蛋白酶和磷酸酯酶抑制剂应该在使用当天同时加入(抑蛋白酶肽,亮抑酶肽,胃蛋白酶抑制剂各100 µl; PMSF, Na3VO4, NaF各500 µl),但是PMSF在水溶液中很不稳定,30分钟就会降解一半,所以PMSF应该在使用前现加,其他抑制剂成分可以在水溶液中稳定5天。

各种成分在工作液中的终浓度:

• Tris-HCl: 50 mM, pH 7.4

• NP-40: 1%

• 去氧胆酸钠:0.25%

• NaCl: 150 mM

• EDTA: 1 mM

• PMSF: 1 mM

• 抑蛋白酶肽,亮抑酶肽,胃蛋白酶抑制剂: 各1 µg/ml

• Na3VO4: 1 mM

• NaF: 1 mM

通过免疫共沉淀确定结合蛋白

1.用磷酸盐缓冲液洗30块10 cm培养板上的适宜细胞。刮去每块板上的细胞到1 ml冰冷的EBC裂解缓冲液中。

2.将每毫升细胞悬液转移到微量离心管中,在微量离心机上4℃以最大速度离心15 min。

3.收集上清(约30 ml)并加入30μg的适当抗体,4℃摇动免疫沉淀物1 h。

4.加入0.9 ml的蛋白质A-Sepharose 悬液,4℃摇动免疫沉淀物30 min。

5.用含900 mmol/L NaCl的NETN洗蛋白A-Sepharose混合物,再重复洗5次。最后,用NETN洗一次。

6.吸出混合物的液体部分。加入800μl的1×SDS胶加样缓冲液到球珠中,煮沸4 min。

7.将样品加入到大孔的不连续SDS-PAGE梯度胶中,在10 mA的恒定电流下电泳过夜。

8.通过考马斯蓝染色观察蛋白质泳带。

9.从胶上切下目标带,将其放到微量离心管中,用1ml 50%乙腈洗两次,每次3 min。

10. 用胰蛋白酶消化胶中的蛋白质,再将肽电洗脱。

11. 通过窄孔高效液相色谱分离肽。将收集的肽在ABI 477A或494A机器上进行自动Edman降解测序。

范文二:免疫共沉淀

原理:免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation)是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。 其原理是:当细胞在非变性条件下被裂解时,完整细胞内存在的许多蛋白质-蛋白质间的相互作用被保留了下来。如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X,那么与X在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。目前多用精制的protein A预先结合固化在argarose的beads上,使之与含有抗原的溶液及抗体反应后,beads上的protein A就能吸附抗原达到精制的目的。这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合;也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档。

二、准备工作:

预冷PBS,RIPA Buffer,细胞刮子(用保鲜膜包好后,埋冰下),离心机

1. 用预冷的PBS洗涤细胞两次,最后一次吸干PBS;

2. 加入预冷的200ul RIPA Buffer (10cm培养皿)

3. 用预冷的细胞刮子将细胞从培养皿或培养瓶上刮下,把悬液转到2.0 EP管中,4℃,缓慢晃动15min(EP管插冰上,置水平摇床上)

4. 4℃,14000g离心15min,立即将上清转移到一个新的离心管中

5. 准备Protein A agarose,用PBS 洗两遍珠子,然后用PBS配制成50%浓度,建议减掉枪尖部分,避免在涉及琼脂糖珠的操作中破坏琼脂糖珠

6. 取30μl protein A 琼脂糖珠,用冷PBS洗3 次,每次3,000 rpm离心3 min;

7. 将预处理过的30μl protein A 琼脂糖珠加入到和抗体孵育过夜的细胞裂解液中4°C缓慢摇晃孵育过夜,使抗体与protein A琼脂糖珠偶连;

8. 免疫沉淀反应后,在4°C 以3,000 rpm 速度离心3 min,将琼脂糖珠离心至管底;将上清小心吸去,琼脂糖珠用1ml裂解缓冲液洗3-4次;最后加入的5×上样缓冲液,沸水煮10分钟;

9. Western blotting

实验第一步验证nemo与pidd的相互作用关系:

(1)5个10cm培养皿培养BV-2细胞

(2)每个皿加入200ul的中等强度的RIPA裂解液,裂解细胞

a Input组

b IgG组

c pidd抗体protein A 琼脂糖珠组孵育过夜

加入5×上样缓冲液煮10分钟

a、b、c组孵育nemo抗体,来证明nemo可以拉出pidd

a Input组

b IgG组

c nemo抗体protein A 琼脂糖珠组孵育过夜

加入5×上样缓冲液煮10分钟

a、b、c组孵育pidd抗体,来证明pidd可以拉出nemo

实验第二步分别转染带flag-空载体与flag-pidd-c

flag-空载体按上述提取细胞分两组,分别加入flag抗体与protein A 琼脂糖珠孵育过夜,分别用flag抗体与nemo抗体

flag-pidd-c按上述提取细胞分两组,分别加入flag抗体与protein A 琼脂糖珠孵育过夜,分别加入flag抗体与nemo抗体

实验第三步分别转染带flag-空载体与flag-pidd-cc

flag-空载体按上述提取细胞分两组,分别加入flag抗体与protein A 琼脂糖珠孵育过夜,分别用flag抗体与nemo抗体

flag-pidd-cc按上述提取细胞分两组,分别加入flag抗体与protein A 琼脂糖珠孵育过夜,分别加入flag抗体与nemo抗体

范文三:免疫共沉淀Immunoprecipitationprotocol

Immunoprecipitation protocol

General IP procedure including a list of reagents and a table to help you choose the correct protein beads

Immunoprecipitation is a method that enables the purification of a protein. An antibody for the protein of interest is incubated with a cell extract enabling the antibody to bind to the protein in solution. The antibody/antigen complex will then be pulled out of the sample using protein A/G-coupled agarose beads. This physically isolates the protein of interest from the rest of the sample. The sample can then be separated by SDS-PAGE for western blot analysis.

1. Lysis buffers and other reagents

2. Preparation of lysates

3. Preclearing the lysates

4. Immunoprecipitation

5. Wash

6. Elution

7. Choosing the correct beads - summary table

8. References

1. a. Lysis buffers

The ideal lysis buffer will leave proteins in their native conformation, minimizing denaturation of antibody binding sites while at the same time releasing adequate amounts of protein from the sample for subsequent analysis. Non-ionic detergents such as NP-40 and Triton X-100 are less harsh than ionic detergents such as SDS and sodium deoxycholate. Other variables that can affect the success of IP include salt concentration, divalent cation concentration, and pH. Therefore to optimize these variables

they should be tested within the following ranges (From Harlow and Lane, page 231; see References): Salts: 0-1 M

Detergent, non-ionic: 0.1-2%

Detergent, ionic: 0.01-0.5%

Divalent cations: 0-10 mM

EDTA: 0-5 mM

pH: 6 - 9

1. Non-denaturing lysis buffer

Use for antigens that are detergent soluble and can be recognised in native form by the antibody. Triton X-100 can be substituted for NP-40.

20 mM Tris HCl pH 8

137 mM NaCl

1% Nonidet P-40 (NP-40)

2 mM EDTA

Store up to 6 months at 4°C. Immediately before use add protease inhibitors

2. RIPA (RadioImmunoPrecipitation Assay) buffer

More denaturing than NP-40 or Triton X-100 lysis buffer, RIPA buffer contains the ionic detergents SDS and sodium deoxycholate as active constituents and is particularly useful for nuclear membrane disruption for nuclear extracts. RIPA buffer gives low background but can denature kinases.

50 mM Tris HCl pH 8

150 mM NaCl

1% NP-40

0.5% sodium deoxycholate

0.1% SDS

Store up to 6 months at 4°C. Immediately before use add protease inhibitors.

For convenience, a 10% sodium deoxycholate stock solution (5 g into 50 ml) may be prepared. It must be protected from light.

3. Detergent-free soluble protein lysis buffer

Some soluble proteins may not require use of detergents. Use this buffer with mechanical breakage of cells, e.g. repeated passage through a syringe or homogenization with a Dounce homogenizer. PBS containing:

5 mM EDTA

0.02 % Sodium Azide

Store up to 6 months at 4°C. Immediately before use add protease inhibitors

4. Denaturing lysis buffer/buffer for non-detergent soluble antigens:

Epitopes of native proteins are not accessible to antibodies that only recognise denatured proteins. When harvesting and lysing the cells, heat the cells in denaturing lysis buffer. This method can also be used for antigens that cannot be extracted from the cell with non-ionic detergents. Use of DNase1 will aid extraction of proteins from chromatin.

1% SDS

5 mM EDTA

Store up to 1 week at room temperature

Immediately before use add:

10 mM dithiothreitol or beta-mercaptoethanol

Protease inhibitors

15 U/ml DNase1

5. Wash buffers

10mM Tris; adjust to pH 7.4

1mM EDTA

1mM EGTA; pH 8.0

150mM NaCl

1% Triton X-100

0.2mM sodium ortho-vanadate

Protease inhibitor cocktail

Store up to 6 months at 4°C. Immediately before use add protease inhibitors

1. b. Other reagents

Protease inhibitors

As soon as lysis occurs, proteolysis, dephosphorylation and denaturation begin. These events can be slowed down tremendously if samples are kept on ice or at 4°C at all times and appropriate inhibitors are added fresh to the lysis buffer. Mixtures (“cocktails”) of protease and phosphatase inhibitors are

commercially available. If not using a cocktail, two of the most commonly used protease inhibitors for IP are PMSF (50 μg/ml) and aprotinin (1 μg/ml). For more details of protease and phosphatase inhibitors, please see our western blot guide.

Other reagents required:

Sterile PBS pH 7.4

Sterile PBS-BSA 1% w/v (filtered)

TBST buffer

Loading/sample buffer for western blotting

100 mM EDTA stock solution is made with 1.86 g EDTA dissolved into 40 ml H2O. Add NaOH to adjust the pH to 7.4. Finally, adjust the total volume to 50 ml.

2. Preparation of lysates

2.1. Lysates from cell culture

2.1.a. Non denaturing:

1. Place the cell culture dish on ice and wash the cells with ice cold PBS.

2. Drain the PBS, then add ice cold lysis buffer (1 ml per 107 cells/100 mm2 dish/150 cm2 flask;

0.5 ml per 5x106cells/60 mm2 dish or 75cm2 flask).

3. Scrape adherent cells off the dish using a cold plastic cell scraper then gently transfer the cell

suspension into a pre-cooled micro centrifuge tube.

4. Maintain constant agitation for 30 min at 4°C.

5. Centrifuge in a micro centrifuge at 4°C.

You may need to vary the centrifugation force and time depending on the cell type. A guideline is 20 min at 12,000 rpm but this must be determined by the end user (e.g. leukocytes need a

very light centrifugation).

6. Gently remove the tubes from the centrifuge and place on ice. Aspirate the supernatant and

place in a fresh tube kept on ice, and discard the pellet.

2.1.b. Denaturing:

1. Add 100 μl denaturing lysis buffer to 0.5 to 2 x 107 cells.

2. Mix well by vortexing vigorously for 2 to 3 sec at maximum speed. Transfer the cell suspension to a micro centrifuge tube.

The solution can be viscous at this stage due to release of DNA.

3. Heat samples to 95°C for 5 min to denature.

4. Dilute the suspension with 0.9 ml non denaturing lysis buffer. Mix gently. (The excess 1% Triton X-100 in the non denaturing lysis buffer quenches the SDS in the original denaturing buffer).

5. Fragment the DNA by passing the lysed suspension 5 to 10 times through a needle attached to a 1 ml

syringe.

Repeat mechanical disruption until the viscosity is reduced to manageable levels.

If the DNA is not fully digested and fragmented, it can interfere with the separation

of the pellet and supernatant following centrifugation.

6. Incubate on ice for 5 min.

7. Proceed with the immunoprecipitation

2. 2 Lysates from tissue

1. Dissect the tissue of interest with clean tools, on ice preferably, and as quickly as possible to prevent degradation by proteases.

2. Place the tissue in round bottom micro centrifuge tubes and immerse in liquid nitrogen to “snap freeze”. Store samples at -80°C for later use or keep on ice for immediate homogenization.

3. For a ~5 mg piece of tissue, add ~300 μl lysis buffer rapidly to the tube and homogenize with an electric homogenizer.

4. Rinse the blade twice with another 300 μl lysis buffer per rinse and then maintain constant agitation for

2 hr at 4°C (e.g. place on an orbital shaker in the refrigerator).

Volumes of lysis buffer must be determined in relation to the amount of tissue present. Protein extract should not be too dilute in order to avoid loss of protein and to minimize the volume of samples to be

loaded onto gels. The minimum concentration is 0.1 mg/ml; optimal concentration is 1-5 mg/ml.

Note: If denatured samples are required, use denaturing lysis buffer and perform

steps 2 to 5 from the denaturing protocol above.

5. Centrifuge for 20 min at 12,000 rpm at 4°C in a micro centrifuge. Gently remove the tubes from the centrifuge and place on ice, aspirate the supernatant and place in a fresh tube kept on ice. Discard the pellet.

3. Pre-clearing the lysates

Pre-clearing the lysate can help reduce non specific binding of proteins to agarose or Sepharose beads. Pre-clearing with an irrelevant antibody or serum will remove proteins that bind immunoglobulins

non-specifically. The end result will have a lower level of background and an improved signal to noise ratio. However, if the final detection of the protein is by western blotting, pre-clearing may not be necessary, unless a contaminating protein is interfering with visualization of the protein of interest.

1. Add either 50 μl of irrelevant antibody of the same species and isotype as the IP antibody or

normal serum (rabbit is preferred by some researchers, see Harlow and Lane, page 243) to 1 ml of lysate. Incubate for 1 hr on ice.

2. Add 100 μl of bead slurry to the lysate.

3. Incubate for 10 to 30 min at 4°C with gentle agitation.

4. Spin in micro centrifuge at 14,000 x g at 4°C for 10 min.

5. Discard bead pellet and keep supernatant for immunoprecipitation.

To increase the yield, the beads can be washed 1 or 2 more times in lysis buffer, and the supernatants

collected together.

It is important to make sure that as much of the normal serum is removed as possible as this will compete with the specific antibody against the antigen of interest. To check for this, a test can be done with lysis buffer instead of sample, performing all pre-clearing steps as above. A coomassie stain of a gel in which the resulting supernatant is run will reveal if the serum Ig is being removed effectively. If serum has not been sufficiently removed, bands will be present at 50 and 25 kDa for heavy and light chains; its

presence may contribute to a weak IP. Consider either decreasing the amount of serum or increasing the amount of beads incubated with your samples in the pre-clearing

step.

4. Immunoprecipitation

Immunoprecipitation can be performed using antibodies by different methods. The use of these methods is based on the requirements of end users. The first approach (4.2 Method A) is to mix antibody with protein sample and allowing it to interact with protein followed by addition of Protein A/G support. This method yields high purity of protein however the antibodies are also co-eluted with protein of interest which sometime creates difficulties in western blot detection. The second approach (4.2 Method B) is to bind antibody to the Protein A/G beads and then mix with the antigen. This method gives lesser yield than first one and avoids the problem of co-elution of antibodies. The third approach is to mix antibody, antigen and beads together; this method gives lowest yield and purity.

4.1 Method A

Immunoprecipitation with antibodies in solution

1. On ice, in a micro centrifuge tube add 10-50 μg cell lysate plus the recommended amount of antibody (see below). These amounts will be chosen depending on the abundance of the protein and the affinity of the antibody for the protein. Typically in a pilot experiment a fixed amount of protein is precipitated by increasing amounts of antibody.

Check the antibody datasheet for recommended antibody concentration. As a guideline use:

1-5 μl polyclonal antiserum

1 μg affinity purified polyclonal antibody

0.2-1 μl ascites fluid (monoclonal antibody)

20-100 μl culture supernatant (monoclonal antibody)

2. Incubate the sample with the antibody between 1-12 hr (overnight) at 4°C, preferably under gentle agitation or rotation. The length of the incubation period depends on the amount of protein and affinity properties of the antibody.

3. Meanwhile prepare the Sepharose beads. If using a monoclonal antibody choose protein G-coupled Sepharose beads. If using a polyclonal antibody, protein A-coupled Sepharose beads are usually suitable (please refer to „Choosing the protein beads‟ table below).

If the beads come as a powder, incubate 100 mg of beads in 1 ml 0.1 M PBS, wash for 1 hr so they swell up, then centrifuge, remove the supernatant and discard. Add 1 ml PBS 0.1% BSA, mix for 1 hr using eppendorf rotator and rinse in PBS 2 X. Remove the supernatant and add 400 μl of buffer made with protease inhibitors (can be the same as the lysis buffer). The slurry is now ready for use. It can be stored at 4°C for a few days; for longer periods keep the beads in PBS with 0.02% azide (rinse the beads

extensively on the day of use and make up in fresh lysis buffer). You can also buy pre-swollen beads as

slurry ready for use.

It is advisable to use pipette tips with the end cut off to prevent damage to the

beads.

IgM antibody: Do not use protein-A or protein-G conjugated beads. Use anti IgM

coupled protein A or Protein G beads. The IgM will then bind to the beads by

binding to the anti-IgM antibody.

Click here to view the procedure using IgM antibodies:

4. Mix the slurry well and add 70-100 μl of the beads to each sample. Always keep samples on ice.

Beads will tend to stick to the sides of the tip so try to minimize the movement in the pipette and use a tip cut 5 mm from the top.

5. Incubate the lysate beads mixture at 4°C under rotary agitation for 4 hr (the optimal incubation time can be determined in a preliminary experiment).

6. Follow the steps in section 5 wash.

4.2. Method B

Immunoprecipitation with Antibody-Agarose conjugate

1. To prepare Protein A or G agarose/Sepharose beads, follow the step 3 in method A.

2. To the microcentrifuge tubes add approximately 70-100 µl of slurry of Protein A-, or G-, or

L-agarose conjugate.

3. Add 10 µl of primary antibody. Use the dilution recommended on the antibody datasheet for IP

as a guideline.

4. Incubate the antibody-beads mixture for 1-4 hours at 4°C by gently mixing the mixture on a

suitable shaker.

5. Centrifuge at 1,000-3,000 g for 2 minutes at 4°C and discard the supernatant.

6. Add 1 ml lysis buffer to the mixture by keeping gentle agitation and then centrifuge at 3,000 g for

2 minutes at 4°C. Repeat this washing step twice.

7. After washing the beads and antibody mixture, add 10-50 μg of cell lysates.

8. Incubate the lysate-beads/antibody conjugate mixture at 4°C under rotary agitation between 4

hours to overnight as required (The optimal incubation time can be determined in a preliminary experiment).

9. At the end of the incubation, continue with wash steps given in section 5.

5. Wash

1. When the lysate-beads/antibody incubation time is over centrifuge the tubes, remove the supernatant from the beads and discard. The complex of interest should now be specifically bound to the antibody coating the beads.

2. Wash the beads with washing buffer or lysis buffer 3 times, to remove non-specific binding. For each wash, mix the beads gently with wash buffer, centrifuge at 4°C and remove the supernatant which can be discarded.

3. Finally, ensure to carefully remove as much wash buffer as possible from the beads. The complex is

now ready for elution from beads.

Using loading buffer is the harshest elution method, and will also elute any

non-covalently bound antibodies and antibody fragments, which will appear on

western blot gels. Antigens can be gently eluted with a glycine gradient (up to 1

M) to reduce the amount of eluted antibody.

Click here to view separate procedure for cross-linking antibody to Sepharose.

6. Elution洗脱

One of the three common methods can be used to elute the complex from the beads. The SDS buffer is the harshest buffer which will also elute non-covalently bound antibodies and antibody fragments along with the protein of interest on the other hand Glycine buffer gently elutes the protein with reduced amount of eluted antibody.

6.1. Glycine Buffer Elution:

In this procedure the complex can be eluted from the beads by acidification. A glycine buffer containing 0.1-0.2 M Glycine pH 2.0-3.0 can be used. The low pH of glycine buffer helps to weaken the interaction between the antibody and the beads. This method is advantageous as beads can be reused after

removal of the glycine buffer. However the eluted sample should be immediately neutralized with Tris, pH

8.0-8.5. After standard IP, follow these steps for glycine elution:

1. Elute the beads (50 µl) 3 X with 150 µl 0.2 M glycine pH 2.6 (1:1) by incubating the sample for

10 minutes with frequent agitation before gentle centrifugation.

2. Pool the eluate and neutralize by adding equal volume of Tris pH 8.0.

3. Repeat these steps 1-2 times and collect all the eluate.

4. Neutralize the beads by washing 2 X with 150 µl lysis buffer (without detergent) and pool with

eluate.

5. Run the samples on a western blot to check the precipitation of proteins.

6.2. SDS Buffer Elution

In SDS elution the Ag-Ab complex is eluted from the beads by heating or boiling samples in loading buffer with denaturant SDS. This method is advantageous because the extraction method is highly efficient and the resulting sample is more concentrated.

1. Elute 50 µl of beads by heating in 50 µl of 2 X SDS without DTT for 10 min at 50°C.

2. Pellet beads, transfer supplement to a new tube and add DTT at 100 mM (Elution 1).

3. Add 50 µl 2 X SDS Buffer with DTT to pelleted beads (Elution 2).

4. Boil the elution samples for 5 min and analyze content of the sample by western blot.

Generally, there should be target protein in both elutions 1 and 2 collected above although amounts in each will be variable; Elution 2 will have more IgG contamination than Elution 1.

6.3. Urea Buffer Elution:

In this method the complex is eluted from the beads by the chaotrope urea. Beads should be

resuspended in 2-5 volumes of urea elution buffer (6 – 8 M Urea, 20 mM Tris pH 7.5, and 100 mM NaCl). The purified complexes have now been released into the supernatant which should be collected from above the beads. This method is advantageous for mass spectrometry because the sample can be digested by proteolytic enzymes.

1. Wash beads with pre-urea wash buffer (50 mM Tris pH 8.5, 1 mM EGTA, 75 mM

KCl). Remove all residual supernatant.

2. Add 100 µl urea elution buffer and rotate for 30 min at room temperature with frequent agitation

before gentle centrifugation.

3. Repeat this process at least twice more to ensure that the entire captured complex has been

released from the beads. Pellet beads and remove urea to a new tube.

4. Add 3 X sample buffer to run on a gel in western blot.

7. Choosing the correct beads- summary table

Key: +++ = Strong binding, ++ = Medium binding, + = Weak binding, - = No binding

8. References

Harlow, Ed, and David Lane. Using Antibodies. Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999.

Bonifacino, Juan S. et al. Current Protocols in Immunology 8.3.1-8.3.28, New York: John Wiley, 2001.

范文四:免疫共沉淀事项

最近我们实验室想做这个试验,以前也没有做过,如果有战友做过这个试验,希望介绍点经验和教训,谢谢乐。

应战友要求,在网上找乐一下基础资料,方便大家查看,虽然下面也列出了试验方法,但在实际实验室可能并不一样,希望战友们较少些自己的亲身体会,让大家和我本人在即将进行的试验中少走弯路。先谢谢各位了

免疫共沉淀 免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation)是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。 其原理是:当细胞在非变性条件下被裂解时,完整细胞内存在的许多蛋白质-蛋白质间的相互作用被保留了下来。如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X,那么与X在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合;也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档。

其优点为:(1)相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的,处于天然状态;(2)蛋白的相互作用是在自然状态下进行的,可以避免人为的影响;(3)可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物。缺点为:(1)可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质-蛋白质相互作用;(2)两种蛋白质的结合可能不是直接结合,而可能有第三者在中间起桥梁作用; (3)必须在实验前预测目的蛋白是什么,以选择最后检测的抗体,所以,若预测不正确,实验就得不到结果,方法本身具有冒险性。

实验流程为:

(1)转染后24-48 h 可收获细胞,加入适量细胞裂解缓冲液(含蛋白酶抑制剂),冰上裂解30min, 细胞裂解液于4°C, 最大转速离心30 min后取上清;

(2)取少量裂解液以备Western blot分析,剩余裂解液加1μg相应的抗体加入到细胞裂解液,4°C缓慢摇晃孵育过夜;

(3)取10μl protein A 琼脂糖珠,用适量裂解缓冲液洗3 次,每次3,000 rpm离心3 min;

(4)将预处理过的10μl protein A 琼脂糖珠加入到和抗体孵育过夜的细胞裂解液中4°C缓慢摇晃孵育2-4h,使抗体与protein A琼脂糖珠偶连;

(5)免疫沉淀反应后,在4°C 以3,000 rpm 速度离心3 min,将琼脂糖珠离心至管底;将上清小心吸去,琼脂糖珠用1ml裂解缓冲液洗3-4次;最后加入15μl的2×SDS 上样缓冲液,沸水煮5分钟;

(6)SDS-PAGE, Western blotting或质谱仪分析。

注意的问题:

(1)细胞裂解采用温和的裂解条件,不能破坏细胞内存在的所有蛋白质-蛋白质相互作用,多采用非离子变性剂(NP40或Triton X-100)。每种细胞的裂解条件是不一样的,通过经验确定。不能用高浓度的变性剂(0.2%SDS),细胞裂解液中要加各种酶抑制剂,如商品化的cocktailer。

(2)使用明确的抗体,可以将几种抗体共同使用

(3)使用对照抗体:

单克隆抗体:正常小鼠的IgG或另一类单抗

兔多克隆抗体:正常兔IgG

在免疫共沉淀实验中要保证实验结果的真实性,应注意以下几点:

(1) 确保共沉淀的蛋白是由所加入的抗体沉淀得到的,而并非外源非特异蛋白,单克隆抗体的使用有助于避免污染的发生;

(2) 要确保抗体的特异性,即在不表达抗原的细胞溶解物中添加抗体后不会引起共沉淀;

(3) 确定蛋白间的相互作用是发生在细胞中,而不是由于细胞的溶解才发生的,这需要

进行蛋白质的定位来确定。ChIP是个很郁闷的实验,时间花费N长,如果做的不好非常打击人,我也谈不上什么成功经验呢

1)显然抗体来源要可靠,很多在WB上很好的商业化抗体并不能成功使用到ChIP上。

2)超声处理要充分,处理完呢以后DNA一定要跑胶检测看看,如果片段都很大,结果受到的影响很大,特别是如果ChIP组蛋白谢谢 alixtardxy 现在好多大牛文章上面都用IP ,做的也很漂亮,摸索好了条件,应该是不难做的,有个疑问 ,为什么在WB上能用的 在IP上就不能用乐啊?对不起,我直接想到ChIP上去了,所以才出现了上面的那些说法。你的意思应该是 chip 用的抗体是特殊的吧?即便和WB试验一样,抗同样的抗原。楼主是否把免疫共沉淀的定义和实验目的说下,这样方便讨论,呵呵这个试验太陌生了,还望各位多多指教啊ChIP是ChIp(染色质免疫沉淀),不是楼主说的Co-IP(免疫共沉淀),二者是风马牛不相及的两个试验和概念,原理和目的都不一样,楼上很多人将二者搞混了.

染色质免疫沉淀的作用是鉴定蛋白与DNA的结合,相当于EMSA(凝胶滞留试验)的体内试验。

基本原理是用抗体将目标蛋白及其它可能结合的DNA沉淀下来,然后用引物扩增DNA的序列。因此这个目标蛋白通常具备转录调节功能,能够结合DNA,目前也有做结合RNA的Chip。

免疫共沉淀的作用是鉴定蛋白与蛋白的相互作用。用抗体将蛋白(A)及其可能结合的目标蛋白(B)沉淀下来。因此这个A蛋白可以是任何蛋白。“共”指反过来用B的抗体也能将A/B复合物沉下来。如果是单向的,通常叫免疫沉淀。楼主的帖子“免疫共沉淀的具体注意事项”不适合放在核酸版块,更适合放在蛋白质版块。

相反,“染色质免疫沉淀CHIP”适合在该版块。我做的不是很多,但是有几点提出来和大家讨论下。

我想这个试验最关键的就是细胞的处理和抗体来源。

如二楼所说,的确很多WB的抗体是不一定可以用到ChIP上的,这个应该是和抗体的制作过程有关系的。至于多抗还是单抗,我认为各有优缺点。比如说单抗是特异性的针对某种表位的,这样可以选择几种单抗混合使用效果会好些,而且背景也低很多。多抗虽然比较复杂,最主要的是非特异性反应比较多,导致试验结果不好判断,但是经过合理的纯化,应该会将这个缺点变小。做ChIP的抗体应该是能够针对空间表位的,虽然某些针对线性表位的抗体也能够运用其中,但是那只是小部分,所以我认为抗体的来源很关键,无论是购买还是自己制作,都需要对其的特性比较了解。

ChIP还有一个问题是细胞的处理,虽然很多公司都提供了现成的试剂可供选择,但是那只是通用性的试剂,真正适合自己细胞的还需要做预试验摸索下。其次是细胞内相互作用的蛋白,可能会由于处理导致不发生作用等等因素导致相应值变低,所以我觉得处理时间,温度等等外部条件还是很重要的。

以上是个人观点,仅供参考!看来我也看错了,不好意思!目前个人认为生物医学研究的瓶颈就是是否能制备高质量的适合多种用途的抗体。

很多所谓的主流研究方法都要依赖抗体。例如Western blot,免疫荧光,流式分析,ELISA,IP,CoIP, ChIP。个人对抗体制备的原理和方法不是很清楚,但是实际过程中很多并不想说明书上说的那样,结果是否漂亮,只有用了才知道。

Western blot应该是抗体的最基本功能,他的最后原理是抗体结合到膜上的抗原,然后通过二抗来显示其位置。免疫共沉淀的抗体就不一样了,他要保证能够将你的目标蛋白及其复合物牢固的结合并通过蛋白A或G将其沉下来。

举个简单的例子说明二者的不同,不知道是否正确,一男(抗体)与一女(抗原)热情的接吻,在床上(膜)可能很容易办到,上述过程类似WB,抗体的功能只是识别固定物(转膜)

上的抗原,风平浪静。相反,一男(抗体)与一女(抗原)热情的接吻,在激流中就不容易办到,上述过程类似免疫沉淀,是动态环境下的识别,而且必须特异性的牢固结合,这种接吻要求是热吻,紧密结合,并且最终用一个钩子(免疫沉淀中叫蛋白A或G)将男的勾下来后,要保证男的还热吻者那个女的(即抗原)。因此要求这个男的(抗体)要紧紧的抱住那个女的(抗原)。可想而知激流中(免疫沉淀)对男的质量要求更高,一定要保证不与女的分手。如果男的还三心二意,可能抱的是其他的女人,这在免疫沉淀中就会产生非特异性条带。因此,免疫沉淀一定要设置对照IG抗体来沉淀,如果随便一个男的(对照IG)也能将某个女的抱下来,那这个女的就是“博爱”,不是真正需要的最爱(特异条带)。

鉴于目前很多男的(抗体)质量不可靠或者不能满足,因此大量的文献喜欢采用标签蛋白(例如,HIS,HA,GFP,MYC等)作为“特异男”来勾引“女”的。

个人认为需要一个个试,看那个能够用于免疫沉淀,有的抗体是针对男的“嘴巴”来设计的,这种抗体当然能够容易将女的抱下来,相反有的是针对其他部位设计制备抗体的,功能也就不一样了。

Co-Ip成功的关键主要有两个:1)男的质量。2)男女接吻时的环境(例如是否有其他干扰因素,沉淀的时间,温度,比例,旋转强度等)

不对指正。tangdl2000的比喻很有意思,呵呵

再次建议楼主把免疫共沉淀的实验目的说下,这样方便讨论,呵呵

想说下免疫沉淀,免疫沉淀是用你的抗体富集目的抗原,然后用WESTERN显示,你的抗体是否结合抗原。

由于是富集了目的抗原,WESTERN不容易做出来的,用免疫沉淀可能容易出结果,但是也容易出杂带。

如果看两个分子是否相互作用,可以用免疫共沉淀。

染色质免疫沉淀(EMSA)主要用于研究转录因子的。

实验技巧是为了实验目的服务的,撇开实验目的,单纯讨论实验技巧,似不可取。

另外建议:发现很多战友发贴,不注明实验目的,这样讨论,可能最后发现所讨论的实验技术并不是为你的实验目的服务的。

GOOD LUCK呵呵,由于我的疏忽,把这个帖子置顶了。

关于抗体的问题,我的看法是。

1)对应WB而言,使用的抗体识别的抗原应该是线性化的抗原(SDS)的作用,因此它识别的不是蛋白在具有正常空间结构时的抗原决定簇,而是在蛋白一级结构上相临的几个AA组成的抗原决定簇。

2)对应FACS而言,多数情况下,它识别的是具有正常高级结构的蛋白的抗原决定簇,这些抗原决定簇可能是由相邻近的AA组成的或者是由于蛋白折叠后原本在一级结构上相距比较远的几个AA组成的,因此WB和FACS的抗体有时能够通用,有时不能通用。

3) Co-IP的情况,我认为和FACS是相类似的。

4) ChIP的情况最为头痛,因为它涉及了一个crosslink的过程,这个可能造成一些抗原决定簇被封闭掉,而且在免疫共沉淀使用的buffer中含有一些变性剂,进一步影响了抗原抗体的结合,因此WB可以用的抗体并不一定能用于ChIP,按照现在的说法,如果不是被validated过的抗体,做ChIP可能需要对多个抗体进行优化评估灵敏性和特异性。

至于是固相杂交还是液像杂交我觉得到不是重点,事实上,和固态的蛋白芯片相比较,液态蛋白芯片(luminex)的效率更高,因为抗原抗体有更加充分的机会接触。我们一般都称之为 IP试验 ,这样就包括 染色质和蛋白 及蛋白和蛋白了谢谢 版主的建议 ,我也是进入实验室不到一年的时间,接触IP的时间更短,试验设计也是在完善阶段,现在主要是实验技术方面的知识太欠缺了

另外 实验的目的,不便说的太详细,因为这个实验有可能投今年的基金,请各位战友谅解谢谢LZ把你的经验拿出来大家分享,最近也在打算做免疫沉淀,学习了各位战友的经验,受益匪浅。我有个问题想请问大家,我的目的蛋白是个跨膜蛋白,表达在哺乳动物细胞膜上,我最终的目的是想把这个蛋白提出来作为抗原去检测患者血清中的抗体,所以对蛋白的量有一定要求。原来标书写的步骤是用免疫沉淀的方法来纯化蛋白,但我认为这个方案不可行,原因是一、哺乳动物细胞蛋白表达量少、膜蛋白提取的量也少,二、免疫沉淀其实就是用抗体去抓取目的蛋白,代价较大,不可能获得大量目的蛋白来作为抗原去行Elisa检测抗体。

三、就算我不惜花钱,免疫沉淀最后洗脱的是Beads,得到的是抗原抗体复合物,会不会影响目标蛋白的抗原性,因为目标蛋白的抗原表位已经被确定的一抗结合了。请各位战友帮忙看看,给些建议,谢谢了。IP本身的假阳性和假阴性和多,具体的操作过程上面的几位谈的挺多了。

我想说的是不管是co-IP还是ChIP,一定要有阴性control,也就是和一抗相同来源的normal IgG。因为珠子本身可以吸附一定的蛋白和DNA,包括一些抗原抗体的非特异性结合,所以很多时候阴性control和实验组时间是量的差别,而不是有或无的关系。这样的结果还是可信的吗?正好今天我也在第一次做这个实验,步骤按着这个程序做的,有经验的人帮我看看。

1、 Add 3 ml ice cold RIPA buffer to cell monolayer and incubate at 4° C for

10 minutes. For suspension cells, add the RIPA buffer to washed cell pellet

in a 15 ml conical centrifuge tube.

2、Disrupt cells by repeated aspiration through a 21 gauge needle and transfer to a 15 ml conical centrifuge tube.

3、Pellet cellular debris by centrifu gation at 10,000xg for 10 minutes at 4° C.

Transfer supernatant to a fresh 15 ml conical centrifuge tube on ice.

Preclear lysate (optional step) by adding 1.0 μg of the appropriate control

IgG (normal mouse, rat, rabbit or goat IgG, corresponding to the host

species of the primary antibody), together with 20 μl of resuspended

volume of Protein A/G PLUS-Agarose. Incubate at 4° C for 30 minutes.

Pellet beads by centrifu gation at 2,500 rpm (approximately 1,000xg) for 5

minutes at 4° C. Transfer supernatant (cell lysate) to a fresh 15 ml conical

centrifuge tube on ice.

4、Transfer 1 ml of the above cell lysate, or approximately 100–500 μg total

cellular protein, to a 1.5 ml microcentrifuge tube. Add 1–10 μl (i.e., 0.2–2

μg) primary antibody (optimal antibody concentration should be determined

by titration) and incubate for 1 hour at 4° C.

5、Add 20 μl of resuspended volume of Protein A/G PLUS-Agarose. Cap tubes and incubate at 4° C on a rocker platform or rotating device for 1 hour to

overnight.

6、Collect immunoprecipitates by centrifugation at 2,500 rpm (approx imately

1,000xg) for 5 minutes at 4° C. Carefully aspirate and discard radioactive

supernatant.

7、 Wash pellet 4 times with 1.0 ml RIPA buffer (more stringent) or PBS (less

stringent), each time repeating centrifugation step above.

8、After final wash, aspirate and discard supernatant and resuspend pellet in

40 μl of 1x electrophoresis sample buffer.

9、Boil samples for 2–3 minutes and analyze 20 μl aliquots by SDS-PAGE and

autoradiography. Unused samples may be stored at -20° C.

10、 Optional: After boiling, samples may be centrifuged to pellet the agarose

beads followed by SDS-PAGE analysis of the supernatant.

不能理解第三步中

Preclear lysate (optional step) by adding 1.0 μg of the appropriate control

IgG (normal mouse, rat, rabbit or goat IgG, corresponding to the host

species of the primary antibody), together with 20 μl of resuspended

volume of Protein A/G PLUS-Agarose. Incubate at 4° C for 30 minutes.

Pellet beads by centrifu gation at 2,500 rpm (approximately 1,000xg) for 5

minutes at 4° C. Transfer supernatant (cell lysate) to a fresh 15 ml conical

centrifuge tube on ice.

这是什么作用?肯定不是对照了啰!!!

第五步,照上面战友的说法孵育的温度、时间、摇床的转速都是很重要的哦?我还准备就在室温呢,会增加非特异性结合?

抗体的量以及总蛋白的量(或者说他们的比值)重要不?需要严格控制不?还是需要调整? 买的是santa cruz的抗体,听说是没有验证过的,但说明书上写明了是可以进行免疫共沉淀的。

心里没底阿。

谢谢Because some proteins such as complement components may bind to the Fc region of the IgG, step 3 can deplete these proteins from your samples.大家的发言都很精彩,我对IP的了解也是最近才开始的,受益匪浅啊这个protocol繁琐而且效果很差。

1.做co-IP是不宜采用变性能力强的去垢剂的lysis buffer,所以不能用RIPA,应采用NP40等弱去垢为基础的lysis buffer.而且,protocol中没有说明多少的细胞加入3ml的lysis buffer,我个人的经验是每组一个10cm plate的细胞足够了,加入1ml lysis buffer with complete protease inhibitor cocktails。

2.步骤3中的预处理需不需要的问题。我个人认为,如果抗体质量足够好(没有明显的杂带,或者杂带确实不会产生影响),则没有必要。

3.protocol中为什么有“radioactivesupernatant”?co-IP和CHIP都不会用同位素啊。而且protocol中离心的转速我感觉太低了,通常5000-10000rpm均可,10000rpm 30s或者5000rpm 2min都不会对抗体抗原-beads复合物产生影响。

4.所有的步骤均需要在4度,主要是抑制蛋白酶活性;抗体的量0.2ug-2ug之间可以,蛋白表达的量最好尽可能的高。santa cruz的抗体既然写了可以做IP,那说明还是没有问题的。呵呵,devil19840一棒子把这个操作步骤打得这么死啊。明天看看结果就知道了。建议:

1.有一种免疫沉淀的方案是有“radioactivesupernatant”,我们一般做的是不用同位素的免疫沉淀方案的,看具体的实验目的了。

2.santa cruz的抗体写了可以做IP,但是出厂不检验,看你的运气了,要多摸索条件。

3.你的抗原是在细胞膜上还是在细胞核上,可根据情况选择裂解液。

4.免疫沉淀的结果最好同时有WESTERN对照,这样可以知道是否成功沉淀了特异性条带。免疫沉淀本身还有个阴性对照。

5.实验注意低温,操作细心。

GOOD LUCK无以为报,投上一票,谢谢。

我做的目的蛋白是做成了转基因小鼠了,在肝细胞的胞浆和胞核均有表达的。

这次只是预试验一下,熟悉整个实验流程,沉淀得到的产物和提取的总蛋白一起做了个western看有没有特异性条带,但没有阴性对照。

沉淀得到的产物和提取的总蛋白sds-page电泳后考染效果还行,至少沉淀得到的产物除了抗体的两条粗条带还有一些细条带,尽管现在还不能排除是否为非特异性的。但好像在目的蛋白的位置没有条带哦,太少?太弱?

God bless me!!作了快半年IP了,都不好意思说,到现在也没得到好的结果,同样也是第一次接触这个实验,实验室没人做过,只好在网上找方法,**里比较少,只有几个帖子转贴的方法,未见有讨论的。

我的实验目的是检测细胞转染一种蛋白之后,培养基中的该蛋白分泌情况,在人体中这种蛋白分泌量极低,而且对培养基直接westernblot未见条带,但对细胞裂解物作western有很强的条带。该蛋白有信号肽,应该分泌出细胞,因无抗体,构建载体时在尾部加上了myc和his片段,我的大致试验过程是:

1。转染该蛋白入HepG2细胞,3小时之后换有或无血清培养基(担心血清里蛋白影响IP过程),24小时之后收集细胞和培养基。

2。westernblot检测细胞裂解物和培养基中表达情况,每次细胞中表达都很好。培养基中都没有见条带。

3。对培养基的IP:

a。1/1000的anti-myc50ul加入到1000ul培养基(直接1000ul,500ul培养基加500ulRIPAbuffer,500ul培养基加500ulTBS都试过),3小时和过夜都尝试过,

b。ProteinG凝胶50ul加入,1-3小时,(在加抗体之前preclear也试过)

c。TBS洗3次,每次离心去上清,小心不丢失凝胶

d。后面基本同western过程。

希望大家指教何处需要改进。

文献中的方法基本也是这样,但就是做不出来,教授不满意压力很大阿~~~谢谢大家贴出经验 一起分享最近我也准备做CO-IP.抗体是自己制备的,不太纯,但是检测抗原比较特异。请教各位,能否在昆虫组织匀浆里做,不用细胞?能否提供一份步骤,谢谢!顶一下。我也即将开始CoIP实验了,其他人没做过都,得自己摸索了,希望能在这获得帮助!!谢谢大家再次有问请教这里的前辈,

我把IP下来的蛋白进行SDS-PAGE电泳,然后进行WESTERN BLOT 或者考马斯亮蓝染色,WESTERN BOT可以明显看到我用于沉淀的蛋白,灰度几乎和抗体的重链差不多,可是考染的结果却只能看到重链和轻连,银染也是这样子,这可怎么办呢?我的目的就是要比较沉下来的东西有什么差别。

沉下来的东西直接进行质谱鉴定应该怎么处理呢?请教各位,本人也在用自己制备的单抗做IP实验,第一次做,很多东西不太明白,望赐教:

1)IP结果跑SDS-PAGE胶,考马染色后,出现抗体重链和轻链带,而且很浓很明显,然而目标蛋白处却很淡,不知是特异的目的带,还是非特异条带?怎么排出这种可能性?

2)我是用虫体组织加RIPA后直接匀浆抽提的总蛋白,但是不知RIPA与组织按照什么比例加,得到的蛋白浓度才适合做IP实验?

3)我已经用protein A做了预处理,但WB后背景比较暗?我也是第一次做coip,结果只有一抗的轻链和重链的地方有条带,目的蛋白或者杂蛋白的条带都没有。用我们提取的蛋白直接做western却能看到目的蛋白。有哪位高手能帮忙分析一下。我们的抗体也是senta的。步骤3是必需的,没有步骤3那么coIP的实验不是严谨的实验。如果没有步骤3那么你怎么排除你coIP下来的蛋白不是跟抗体本身(IgG)结合而下来的呢?如不处理,那么就必须将样品一分为二,增加一个只加对照IgG(抗体是什么源性的加什么)代替抗体的组,同

时进行余下步骤。

该实验细胞裂解液,蛋白酶抑制,低温都很重要。另外最好有同时有两种抗体,用mouse IP,用rabbit WB。或反之。这样可以避免出现IgG轻链和重链,这两条条带太浓,如果目的条带靠的近,你就不用指望能做出漂亮图了。现在有很多抗体都有自己包被好的beads。很方便。

另外IP前需要进行蛋白定量,最好在1mg/ML浓度内,太高了,容易出现假阳性。

范文五:组织免疫共沉淀

实验方法如下:

第一步:制备组织裂解物

1. 把组织剪切成细小的碎片。

2. 融解Western及IP细胞裂解液,混匀。取适当量的裂解液,在使用前数分钟内加入PMSF,使PMSF的最终浓度为1mM。

3. 按照每20毫克组织加入100-200微升裂解液的比例加入裂解液。(如果裂解不充分可以适当添加更多的裂解液,如果需要高浓度的蛋白样品,可以适当减少裂解液的用量。)

4. 用玻璃匀浆器匀浆,直至充分裂解。

5. 充分裂解后,10000-14000g离心3-5分钟,取上清,即可进行后续的PAGE、Western、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作。

6. 如果组织样品本身非常细小,可以适当剪切后直接加入裂解液裂解,通过强烈vortex使样品裂解充分。然后同样离心取上清,用 于后续实验。

1. 使用洁净的工具用最快的速度切取待测组织。最好在冰上操作。以防止蛋白降解

2. 将组织放入圆底离心管中,浸入液氮以达到“snap freeze”. 如果马上裂解则将组织冰浴,否则将组织保存-80°C以备后用。

3. 每5mg组织加入300ul裂解液,使用玻璃匀浆器匀浆,直至充分裂解。

4. 用300ul裂解液冲洗刀片两次,然后将组织液在4°C缓慢摇动2小时

5. 12000rpm 4°C.离心20分钟。轻轻的将离心管取出冰浴,将上清吸出到新的预冷的离心管中(保持冰浴),弃沉淀 。

裂解液的体积要根据组织量来确定。蛋白提取物不能太过稀释一方面避免蛋白的损失,另一方面也减少后续电泳的上样量(如果需要的话)。蛋白的合适浓度为1-5 mg/ml ,最低不能少于0.1 mg/ml。

第二步:预纯化裂解物

使用无关抗体或血清可以将裂解物非特异性结合Ig的蛋白去除,随后加入的agarose beads一方面将裂解物中非特异结合agarose 或sepharose beads的蛋白去除,另一方面也将加入的无关抗体和血清蛋白去除。经过处理的裂解物所得试验结果背景更低、信噪比更好。但如果最后是使用WB来检测的话,预纯化就不是特别的必要了。

主要步骤:

1. 每1ml裂解物加入50ul和IP抗体来源及亚型相同的无关抗体(例如后续免疫沉淀时用的是小鼠IgG,则在本步骤中可以加入normal mouse IgG)或者正常血清(常用兔血清),冰浴1小时

2. 加100 μl Preotein A/G agarose beads, 4°C缓慢摇动10-30分钟

3. 14,000 x g 4°C离心10分钟

4. 取上清,弃沉淀

为提高蛋白回收率,可将Preotein A/G agarose beads(上述沉淀)用裂解液洗涤1-2次,所得上清和前面的合在一起

Note:要确保最大可能将正常血清(或无关Ig)从标本中去除。

第三步:免疫沉淀

1. 取10-500 μg细胞裂解物,加入推荐量的抗体:抗体用量取决于蛋白的量以及抗体的亲和力。可参考说明书推荐的抗体用量,如果说明书没有推荐,也可以参考以下数据:.

o 多抗血清:1-5 μl

o 亲和纯化的多抗:1 μg

o 腹水(单抗):0.2-1 μl

o 培养上清(单抗):20 -100 μl

2. 4℃缓慢摇动孵育1h到过夜,取决于蛋白的量以及抗体的亲和力

3. 同时准备Preotein A/G agarose beads。建议减掉枪尖部分,避免在涉及琼脂糖珠的操作中破坏琼脂糖珠:根据抗体类型选择合适的beads(参考附表2),如果IP抗体是IgM:不使用protein-A/G beads,直接使用Goat anti Mouse IgM beads。

4. 加入混匀的70-100ul protein-A/G beads,4℃缓慢摇动4h(根据具体实验优化孵育时间)

5. 2500rpm(约1000g) 4°C离心5分钟,或瞬时高速离心,小心吸除上清,注意宁可留下少量上清也不能吸掉Protein G Agarose。

6. 用准备蛋白样品时的裂解液洗涤沉淀3-5次,裂解液或PBS的用量每次为0.5-1毫升。洗涤时离心条件和吸除上清的要求同上面的步骤3。

7. 最后一次洗涤后,去除上清,加入25-50ul 2×电泳上样缓冲液,95-100°C煮沸5分钟(将蛋白变性并从protein-A/G beads中分离下来)。离心后取上清,弃沉淀。得到的上清可以即可进行后续WB分析或-80°C保存。

Loading buffer是最强力的洗脱液,所以同时也会将无关的结合抗体或抗体片段洗脱下来,这些在后面电泳时会有所体现。抗原可以使用梯度甘氨酸溶液(up to 1 M)从抗体上洗脱下来。 附1:免疫沉淀中用到的主要buffer和试剂

裂解buffer中各种成分的推荐浓度范围

Salts: 0-1 M

Detergent, non-ionic: 0.1-2%

Detergent, ionic: 0.01-0.5%

Divalent cations: 0-10 mM

EDTA: 0-5 mM

pH: 6-9

1. 非变性裂解buffer:

适用于抗原类型:可溶于变性剂并且其天然状态可被抗体识别

20 mM Tris HCl pH 8

137 mM NaCl

10% glycerol

1% Nonidet P-40 (NP-40)

2 mM EDTA

4°C 可保存6个月

使用前加入:Protease inhibitors

上述溶液中NP-40可使用Triton X-100替代

2. RIPA (RadioImmunoPrecipitation Assay) buffer

含有更强的变性剂,特别适用于核蛋白的提取。

50mM Tris HCl pH 8

150 mM NaCl

1% NP-40

0.5% sodium deoxycholate

0.1% SDS

10% sodium deoxycholate橱窗液需要避光保存。

3. 不含去污剂的可溶性蛋白裂解buffer(Detergent-free soluble protein lysis buffer):

一些可溶性蛋白不需要使用去污剂,只要使用该buffer配合机械性的破碎操作即可:如将细胞反复用带针头的注射器吸取或进行匀浆操作

含有以下成分的PBS:

5 mM EDTA

0.02 % Sodium Azide

4°C 可保存6个月

使用前加入:Protease inhibitors

4. 变性裂解buffer或不溶于变性剂的抗原提取buffer:

有些抗体只能识别变性后蛋白的表位而不识别天然状态的蛋白表位。这样就需要使用变性裂解buffer,然后煮沸处理即可。该方法同样适用于不能用非离子去污剂提取的蛋白。在该buffer中加入DNase1将有利于提取染色质蛋白

1% SDS

5 mM EDTA

室温可保存1周

使用前加入:Protease inhibitors、10mM DTT or beta-mercaptoethanol、15 U/ml DNase1

5、其它所需试剂:

蛋白酶抑制剂Protease inhibitors :推荐使用蛋白酶抑制剂cocktail,也可使用PMSF (50 ug/ml)和aprotinin (1 ug/ml).

无菌PBS pH 7.4

无菌PBS-BSA 1% (过滤处理)

TBST缓冲液

WB上样buffer

范文六:免疫共沉淀IP

免疫共沉淀(Co-IP)

免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation)可以:(1)测定两种目标蛋白质是否在体内结合;

(2)确定一种特定蛋白质的新的作用搭档;(3)分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物。

实验方法原理

免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation)是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。 其原理是:当细胞在非变性条件下被裂解时,完整细胞内存在的许多蛋白质-蛋白质间的相互作用被保留了下来。如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X,那么与X在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。目前多用精制的proreinA预先结合固化在argarose的beads上,使之与含有抗原的溶液及抗体反应后,beads上的proreinA就能吸附抗原达到精制的目的。这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合;也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档。

实验材料 蛋白质

试剂、试剂盒 RIPA Buffer、PBS、Protein A、 agarose、琼脂糖、考马斯亮蓝染色液 仪器、耗材 离心机、摇床、EP管、细胞刮子、离心管、培养板、电泳仪、电泳槽、高效液相色谱仪

实验步骤

一、试剂准备

1. 预冷PBS,RIPA Buffer,细胞刮子(用保鲜膜包好后,埋冰下),离心机。

2. 用预冷的PBS洗涤细胞两次,最后一次吸干PBS。

3. 加入预冷的RIPA Buffer(1 ml/107个细胞、10 cm培养皿或150 cm2培养瓶,0.5 ml/5×106个细胞、6 cm培养皿、75 cm2培养瓶)。

4. 用预冷的细胞刮子将细胞从培养皿或培养瓶上刮下,把悬液转到1.5EP管中,4℃,缓慢晃动15 min(EP管插冰上,置水平摇床上)。

5. 4℃,14000 g离心15 min,立即将上清转移到一个新的离心管中。

6. 准备Protein A agarose,用PBS 洗两遍珠子,然后用PBS配制成50%浓度,建议减掉枪尖部分,避免在涉及琼脂糖珠的操作中破坏琼脂糖珠。

7. 每1 ml总蛋白中加入100 μl Protein A琼脂糖珠(50%),4℃摇晃10 min(EP管插冰上,置水平摇床上),以去除非特异性杂蛋白,降低背景。

8. 4℃,14000 g离心1 5min,将上清转移到一个新的离心管中,去除Protein A珠子。

9. (Bradford 法)做蛋白标准曲线,测定蛋白浓度,测前将总蛋白至少稀释1:10倍以上,以减少细胞裂解液中去垢剂的影响(定量,分装后,可以在-20℃保存一个月)。

10. 用PBS将总蛋白稀释到约1 μg/μl,以降低裂解液中去垢剂的浓度,如果兴趣蛋白在细胞中含量较低,则总蛋白浓度应该稍高(如10 μg/μl)。

11. 加入一定体积的兔抗到500 μl总蛋白中,抗体的稀释比例因兴趣蛋白在不同细胞系中的多少而异。

12. 4℃缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或室温2h,激酶或磷酸酯酶活性分析建议用2 h室温孵育。

13. 加入100 μl Protein A琼脂糖珠来捕捉抗原抗体复合物,4℃缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或室温1 h,如果所用抗体为鼠抗或鸡抗,建议加2 μl"过渡抗体"(兔抗鼠IgG,兔抗鸡IgG)。

14. 14000 rpm瞬时离心5 s,收集琼脂糖珠-抗原抗体复合物,去上清,用预冷的RIPA buffer洗3遍,800 μl/遍,RIPA buffer有时候会破坏琼脂糖珠-抗原抗体复合物内部的结合,可以使用PBS。

15. 用60 μl 2×上样缓冲液将琼脂糖珠-抗原抗体复合物悬起,轻轻混匀,缓冲液的量依据上样多少的需要而定(60 μl足够上三道)。

16. 将上样样品煮5 min,以游离抗原,抗体,珠子,离心,将上清电泳,收集剩余琼脂糖珠,上清也可以暂时冻-20℃,留待以后电泳,电泳前应再次煮5 min变性。

二、免疫共沉淀反应

1. 转染后24-48 h 可收获细胞,加入适量细胞裂解缓冲液(含蛋白酶抑制剂),冰上裂解30 min,细胞裂解液于4°C,最大转速离心30 min后取上清;

2. 取少量裂解液以备Western blot分析,剩余裂解液加1μg相应的抗体加入到细胞裂解液,4°C缓慢摇晃孵育过夜;

3. 取10 μl protein A 琼脂糖珠,用适量裂解缓冲液洗3 次,每次3 000 rpm离心3 min;

4.. 将预处理过的10μl protein A 琼脂糖珠加入到和抗体孵育过夜的细胞裂解液中4°C缓慢摇晃孵育2-4 h,使抗体与protein A琼脂糖珠偶连;

5. 免疫沉淀反应后,在4°C 以3,000 rpm 速度离心3 min,将琼脂糖珠离心至管底;将上清小心吸去,琼脂糖珠用1 ml裂解缓冲液洗3-4次;最后加入15 μl的2×SDS 上样缓冲液,沸水煮5分钟;

6. SDS-PAGE,Western blotting或质谱仪分析。

三、通过免疫共沉淀确定结合蛋白

1.用磷酸盐缓冲液洗30块10 cm培养板上的适宜细胞。刮去每块板上的细胞到1 ml冰冷的EBC裂解缓冲液中;

2.将每毫升细胞悬液转移到微量离心管中,在微量离心机上4℃以最大速度离心15 ;

3.收集上清(约30 ml)并加入30 μg的适当抗体,4℃摇动免疫沉淀物1 h;

4.加入0.9 ml的蛋白质A-Sepharose 悬液,4℃摇动免疫沉淀物30 min;

5.用含900 mmol/L NaCl的NETN洗蛋白A-Sepharose混合物,再重复洗5次。最后,用NETN洗一次;

6.吸出混合物的液体部分。加入800 μl的1×SDS胶加样缓冲液到球珠中,煮沸4 min;

7.将样品加入到大孔的不连续SDS-PAGE梯度胶中,在10 mA的恒定电流下电泳过夜;

8.通过考马斯亮蓝染色观察蛋白质泳带;

9.从胶上切下目标带,将其放到微量离心管中,用1 ml 50%乙腈洗两次,每次3 min;

10. 用胰蛋白酶消化胶中的蛋白质,再将肽电洗脱;

11. 通过窄孔高效液相色谱分离肽。将收集的肽在ABI 477A或494A机器上进行自动Edman降解测序。

注意事项

1. 细胞裂解采用温和的裂解条件,不能破坏细胞内存在的所有蛋白质-蛋白质相互作用,多采用非离子变性剂(NP40 或Triton X-100)。每种细胞的裂解条件是不一样的,通过经验确定。不能用高浓度的变性剂(0.2%SDS),细胞裂解液中要加各种酶抑制剂,如商品化的。

2. 使用明确的抗体,可以将几种抗体共同使用。

3. 使用对照抗体:

单克隆抗体:正常小鼠的IgG或另一类单抗

兔多克隆抗体:正常兔IgG

4. 确保共沉淀的蛋白是由所加入的抗体沉淀得到的,而并非外源非特异蛋白,单克隆抗体的使用有助于避免污染的发生。

5. 要确保抗体的特异性,即在不表达抗原的细胞溶解物中添加抗体后不会引起共沉淀。

6. 确定蛋白间的相互作用是发生在细胞中,而不是由于细胞的溶解才发生的,这需要进行蛋白质的定位来确定。

其他

一、免疫共沉淀的优点

1. 相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的,处于天然状态。

2. 蛋白的相互作用是在自然状态下进行的,可以避免人为的影响。

3. 可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物。

二、免疫共沉淀的缺点

1. 可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质-蛋白质相互作用;

2. 两种蛋白质的结合可能不是直接结合,而可能有第三者在中间起桥梁作用;

3. 必须在实验前预测目的蛋白是什么,以选择最后检测的抗体,所以,若预测不正确,实验就得不到结果,方法本身具有冒险性。

三、RIPA Buffer配制

1. 基础成分

Tris-HCl(缓冲液成分,防止蛋白变性)

NaCl(盐份,防止非特异蛋白聚集)

NP-40(非离子去污剂,提取蛋白;用H2O配制成10%储存液)

去氧胆酸钠(离子去污剂,提取蛋白;用H2O配制成10%储存液;避光保存)

注意:准备激酶(致活酶)实验时,不要加去氧胆酸钠,因为离子型去污剂能够使酶变性,导致活性丧失。

2. RIPA蛋白酶抑制剂

苯甲基磺酰氟(PMSF)(用异丙醇配制成200 mM的储存液,室温保存)

EDTA(钙螯合剂;用H2O配制成100 mM的储存液,PH 7.4)

亮抑酶肽(Leupeptin)(用H2O配制成1 mg/ml的储存液,分装,-20℃保存)

抑蛋白酶肽(Aprotinin)(用H2O配制成1 mg/ml的储存液,分装,-20℃保存)

胃蛋白酶抑制剂(Pepstatin)(用甲醇配制成1 mg/ml的储存液,分装,-20℃保存)

3. RIPA磷酸(酯)酶抑制剂

激活的Na3VO4(用H2O配制成200 mM的储存液

NaF(200 mM的储存液,室温保存)

注意:在准备做磷酸(酯)酶实验的时候,不加磷酸酯酶抑制剂。

四、工作液配制

1. 配制100 ml的modified RIPA buffe

(1)称取790 mg 的Tris-Base,加到75ml 去离子水中,加入900 mg的NaCl,搅拌,直到全部溶解,用HCl调节PH值到7.4。

(2)加10 ml 10%的NP-40。

(3)加2.5 ml 10%的去氧胆酸钠,搅拌,直到溶液澄清。

(4)加1 ml 100mM的EDTA,用量筒定容到100 ml,2-8℃保存。

(5)理论上,蛋白酶和磷酸酯酶抑制剂应该在使用当天同时加入(抑蛋白酶肽、亮抑酶肽、胃蛋白酶抑制剂各100 μl;PMSF、Na3VO4、 NaF各500 μl),但是PMSF在水溶液中很不稳定,30分钟就会降解一半,所以PMSF应该在使用前现加,其他抑制剂成分可以在水溶液中稳定5天。

范文七:CO-IP免疫共沉淀

免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation)是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。用抗体将相应特定分子沉淀的同时,与该分子特异性结合的其他分子也会被带着一起沉淀出来的技术。这种技术常用于验证蛋白质之间相互特异性结合。 过程:免疫共沉淀(Co- Immunoprecipitation, Co-IP)是利用抗原和抗体的特异性结合以及细菌的Protein A或G特异性地结合到免疫球蛋白的Fc片段的现象开发出来的方法。其基本原理是,在细胞裂解液中加入抗兴趣蛋白的抗体,孵育后再加入与抗体特异结合的结合于Agarose珠上的Protein A或G,若细胞中有与兴趣蛋白结合的目的蛋白,就可以形成这样一种复合物:“目的蛋白—兴趣蛋白—抗兴趣蛋白抗体—Protein A或G”,经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,复合物又被分开。然后经免疫印迹或质谱检测目的蛋白。这种方法得到的目的蛋白是在细胞内与兴趣蛋白天然结合的,符合体内实际情况,得到的结果可信度高。这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合;也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档。

免疫共沉淀优点

(1)相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的,处于天然状态;

(2)蛋白的相互作用是在自然状态下进行的,可以避免人为的影响;

(3)可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物。

免疫共沉淀缺点

(1)可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质-蛋白质相互作用;

(2)两种蛋白质的结合可能不是直接结合,而可能有第三者在中间起桥梁作用;

(3)必须在实验前预测目的蛋白是什么,以选择最后检测的抗体,所以,若预测不正确,实验就得不到结果,方法本身具有冒险性。 免疫共沉淀实验流程

(1) 转染后24-48 h 可收获细胞,加入适量细胞裂解缓冲液(含蛋

免疫共沉淀酶抑制剂),冰上裂解30min, 细胞裂解液于4°C, 最大转速离心30 min后取上清;

(2)取少量裂解液以备Western blot分析,剩余裂解液加1μg相应的抗体加入到细胞裂解液,4°C缓慢摇晃孵育过夜;

(3)取10μl protein A 琼脂糖珠,用适量裂解缓冲液洗3 次,每次3,000 rpm离心3 min;

(4)将预处理过的10μl protein A 琼脂糖珠加入到和抗体孵育过夜的细胞裂解液中4°C缓慢摇晃孵育2-4h,使抗体与protein A琼脂糖珠偶连;

(5)免疫沉淀反应后,在4°C 以3,000 rpm 速度离心3 min,将琼脂糖珠离心至管底;将上清小心吸去,琼脂糖珠用1ml裂解缓冲液洗3-4次;最后加入15μl的2×SDS 上样缓冲液,沸水煮5分钟;

(6)SDS-PAGE, Western blotting或质谱仪分析。

注意的问题:

(1)细胞裂解采用温和的裂解条件,不能破坏细胞内存在的所有蛋白质-蛋白质相互作用,多采用非离子变性剂(NP40或Triton )。每种细胞的裂解条件是不一样的,通过经验确定。不能用高浓度的变性剂(0.2%SDS),细胞裂解液中要加各种酶抑制剂,如商品化的cocktailer。

(2)使用明确的抗体,可以将几种抗体共同使用

(3)使用对照抗体:

单克隆抗体:正常小鼠的IgG或另一类单抗

兔多克隆抗体:正常兔IgG

免疫共沉淀注意的问题

(1) 确保共沉淀的蛋白是由所加入的抗体沉淀得到的,而并非外源非特异蛋白,单克隆抗体的使用有助于避免污染的发生;

(2) 要确保抗体的特异性,即在不表达抗原的细胞溶解物中添加抗体后不会引起共沉淀;

(3) 确定蛋白间的相互作用是发生在细胞中,而不是由于细胞的溶解才发生的,这需要进行蛋白质的定位来确定。

使用酵母双杂交实验发现的蛋白相互作用通常需要免疫共沉淀实验进行验证。

实验最需要注意点就是抗体的性质。抗体不同和抗原结合能力也不同,免染能结合未必能用在IP反应。建议仔细检查抗体的说明书。特别是多抗的特异性是问题。

其次,要注意溶解抗原的缓冲液的性质。多数的抗原是细胞构成的蛋白,特别是骨架蛋白,缓冲液必须要使其溶解。为此,必须使用含有强界面活性剂的缓冲液,尽管它有可能影响一部分抗原抗体的结合。另一面,如用弱界面活性剂溶解细胞,就不能充分溶解细胞蛋白。即便溶解也产生与其它的蛋白结合的结果,抗原决定族被封闭,影响与抗体的结合,即使IP成功,也是很多蛋白与抗体共沉的悲惨结果。 再次,为防止蛋白的分解,修饰,溶解抗原的缓冲液必须加蛋白每抑制剂,低温下进行实验。

每次实验之前,首先考虑抗体/缓冲液的比例。抗体过少就不能检出抗原,过多则就不能沉降在beads上,残存在上清。缓冲剂太少则不能溶解抗原,过多则抗原被稀释。欲速则不达,确定好比例很必要。

范文八:PulldownandCo-IP免疫共沉淀

融合蛋白pull-down实验

混合蛋白液中钓取标记蛋白的作用蛋白。蛋白质相互作用的类型有牢固型相互作用和暂时型相互作用两种。牢固型相互作用以多亚基蛋白复合体常见,最好通过免疫共沉淀(Co-IP)、Pull-down技术或Far-western法研究。

Pull-down技术用固相化的、已标记的饵蛋白或标签蛋白(生物素-、PolyHis-或GST-),从细胞裂解液中钓出与之相互作用的蛋白(对混合液中的所有蛋白一视同仁)。通过Pull-down技术可以确定已知的蛋白与钓出蛋白或已纯化的相关蛋白间的相互作用关系,从体外转录或翻译体系中检测出蛋白相互作用关系。

融合蛋白pull-down技术基本原理是将一种蛋白质固定于某种基质上(如Sepharose),当细胞抽提液经过该基质时,可与该固定蛋白相互作用的配体蛋白被吸附,而没有被吸附的“杂质”则随洗脱液流出。被吸附的蛋白可以通过改变洗脱液或洗脱条件而回收下来。

GST Pull-down实验是利用带有GST标签的诱饵蛋白从一个生物样品中亲和纯化一个或几个未知蛋白。主要原理就是带有GST标签的诱饵蛋白与其相互作用蛋白结合,所产生的复合物被捕获在连有谷胱甘肽的树脂上。为排除假阳性所设的一组对照实验是在没有诱饵蛋白存在的条件下,将样品结合到GST上。该对照可以是表达有GST(非诱饵融合蛋白)的分别转化细胞裂解物,也可以是将GST加到非转化细胞的裂解物中。设计合适的对照实验非常重要。

免疫共沉淀技术

(预先猜测两种蛋白作用,Co-IP进行检测)

如果在非变性的条件下裂解细胞,蛋白质之间的相互作用还可以保持。其基本原理是,在细胞裂解液中加入抗兴趣蛋白的抗体,孵育后再加入与抗体特异结合的结合于Pansobin珠上的金黄色葡萄球菌蛋白A(SPA),若细胞中有正与兴趣蛋白结合的目的蛋白,就可以形成这样一种复合物:“目的蛋白—兴趣蛋白—抗兴趣蛋白抗体—SPA\|Pansobin”,因为SPA\|Pansobin比较大,这样复合物在离心时就被分离出来。经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,复合物四组分又被分开。然后经Western blotting法,用抗体检测目的蛋白是什么,是否为预测蛋白。这种方法得到的目的蛋白是在细胞内天然与兴趣蛋白结合的,符合体内实际情况,得到的蛋白可信度高。

免疫共沉淀既可以用于检验已知的两个蛋白质在体内的相互作用,也可以找出未知的蛋白质相互作用,不管是两者的哪个,其原则都是一样的,都需要用特异性的抗体与其中的一种蛋白质结合,之后通过蛋白质A或蛋白质G-琼脂糖微珠将复合物沉淀下来,然后用SDS-PAGE鉴定.

免疫共沉淀中设置正确的对照非常重要,因为该方法可能出现假阳性的概率比较高.设置的对照包括:在对照组中使用对照抗体,以缺失目的蛋白的细胞系作为阴性对照等等。 但这种方法有两个缺陷:一是两种蛋白质的结合可能不是直接结合,而可能有第三者在中间起桥梁作用;二是必须在实验前预测目的蛋白是什么,以选择最后检测的抗体,所以,若预测不正确,实验就得不到结果,方法本身具有冒险性。

融合蛋白pull-down实验

为了更有效地利用pull-down技术,可以将待纯化地蛋白以融合蛋白地形式表达,即将“诱饵”蛋白与一种易于纯化地配体蛋白相融合。1988年Smith等利用谷胱甘肽-S-转移酶(glutathione-S-transferase ,GST)融合标签从细菌中一步纯化出GST融合蛋白。从此GST融合蛋白在蛋白质相互作用研究领域里得到了极大的推广。GST融合蛋白在经过固定有GST(glutathione)的色谱柱时,就可以通过GST与GSH的相互作用而被吸附。当再有细胞抽提物过柱,就可以得到能够与“诱饵”蛋白相互作用的兴趣蛋白。一般来说,GST融合蛋白pull-down方法用于两个方面:一是鉴定能与已知融合蛋白相互作用的未知蛋白质;二是鉴定两个已知蛋白质之间是否存在相互作用。该方法比较简便,避免了使用同位素等危险物质,在蛋白质相互作用研究中有很广泛的应用。类似的融合蛋白很多,如与葡萄球菌蛋白A融合的“诱饵”蛋白可以通过固定有IgG的色谱柱进行纯化;与寡聚组氨酸肽段融合的“诱饵”蛋白可以通过结合Ni的色谱柱进行纯化;与二氢叶酸还原酶融合的“诱饵”蛋白可以通过固定有氨甲喋呤的色谱柱进行纯化等等。

2+[2]

范文九:免疫共沉淀(CO-IP)

免疫共沉淀(CoIP)实验技术服务

一、免疫共沉淀概述

免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation,CoIP)只要以抗体和抗原之间的特异免疫反应为基础,研究蛋白质与蛋白质间相互作用的经典方法。其基本原理是在细胞裂解液中加入抗原特异性的抗体,抗体、抗原、以及与抗原具有相互作用的蛋白质通过抗原与抗体之间免疫沉淀反应将形成免疫复合物,经过纯化,洗脱,收集免疫复合物,SDS-PAGE电泳,western blot和(或)质谱可鉴定出与抗原相互作用的蛋白质。

图1:免疫共沉淀复合物

二、技术服务优势

与其他研究蛋白质相互作用技术(如Pull down、酵母双杂交等)相比,免疫共沉淀鉴定的相互作用蛋白是在细胞内与目的蛋白天然结合,符合体内实际情况,得到的蛋白可信度更高。

三、技术服务流程

图2:免疫共沉淀技术服务流程

四、服务内容

1、蛋白质抽提与定量;

2、免疫共沉淀(以normal IgG作为对照);

3、SDS-PAGE分离,western blot 和(或)质谱鉴定相互作用蛋白质; 4、实验报告提交。 五、顾客提供

1、蛋白质样品(组织、细胞、蛋白质溶液等)、用于免疫共沉淀的一抗(如果公司抗体

库里没有)及目的蛋白的相关信息;

2、需要通过转染载体表达基因的,提供表达载体,没有载体的本公司可以构建载体; 3、其他与免疫共沉淀相关信息。

六、实验报告内容

1、免疫共沉淀电子图片及分析结果;

2、相互作用蛋白鉴定结果,质谱鉴定结果和(或)western blot鉴定结果; 3、完整的实验步骤、使用仪器、软件检索参数等。

范文十:免疫沉淀与免疫共沉淀原理及方法

免疫沉淀与免疫共沉淀原理及方法

一、基本概念

免疫沉淀(immunoprecipitation)是利用抗体可与抗原特异性结合的特性,将抗原(常为靶蛋白)从混合体系沉淀下来,初步分离靶蛋白的一种方法。

免疫共沉淀(coimmunoprecipitation)是一种在体外探测两个蛋白分子间是否存在特异性相互作用的一种方法。其原理是如果两个蛋白在体外体系能够发生特异性相互作用的话,那么当用一种蛋白的抗体进行免疫沉淀时,另一个蛋白也会被同时沉淀下来。与酵母双杂交技术不同,免疫共沉淀技术所利用的是抗原和抗体间的免疫反应,是一种基于体外非细胞的环境中研究蛋白质与蛋白质的相互作用的方法。 不难看出,免疫共沉淀与免疫沉淀技术所使用的原理与方法大致相似,所不同的是,在免疫共沉淀中,对靶蛋白的结合与沉淀由另一个与之发生相互作用的蛋白替代。在免疫共沉淀或免疫沉淀的基础上,通过进一步与其它技术的结合,如聚丙烯酰胺凝胶电泳,还可进一步对靶蛋白的的分子量等特性进行鉴定。

二、抗体的选择

(一)多克隆抗体

多克隆抗体因其制备相对简单,可与靶蛋白分子的多个位点结合,所形成的抗原抗体复合物较稳定因而应用的最为广泛。但多克隆抗体的缺点在于非特异性结合较多,常会导致反映本底(是否是背景)升高和一定的假阳性结果。

(二)单克隆抗体

与多克隆抗体相比,单克隆抗体往往只结合一种抗原表位,具有单一结合特异性,所以发生非特异结合的机会少,可被用于确定靶蛋白上某一部位的特殊结构,甚至可被用于区分相同靶蛋白的不同形式如构象变化和修饰。但反过来,单克隆抗体仅与单一表位结合的特性也会引起具有同一表位的不同靶蛋白间的交叉反应。

三、免疫沉淀方法

免疫沉淀的靶蛋白一般来自细胞裂解液,可以是被同位素标记的也可以是未被标记的。若为前者,免

疫沉淀后再经聚丙烯酰胺凝胶电泳,只需压片即可检测到靶蛋白的存在;若为后者,经免疫沉淀和聚丙烯酰凝胶电泳后,尚需借助银染或免疫印迹进行鉴定。

(一)所需试剂及溶液

改良的RIPA液(细胞裂解液)、稀释缓冲液(常用PBS溶液)、TSA溶液、0.05mol/lTris(pH6.8)、2×SDS蛋白上样缓冲液、抗体与Sepharose或抗免疫球蛋白抗体、蛋白A、蛋白G的交联物。

改良的RIPA液的组成(100ml体系):Tris-HCl: 50 mM(pH 7.4)、NP-40: 1%脱氧胆酸钠(0.25%)、NaCl(150 mM)、EDTA(1 mM)、PMSF(1 mM)、抑肽酶、亮肽酶素、抑肽素(各1µg /ml)、Na3VO4(1 mM)、NaF(1 mM)。

(二)方法

1.用冰冷的PBS溶液洗涤贴壁细胞两次,弃干净PBS。(对于悬浮细胞则用台式离心机以800-1000rpm转速通过离心洗涤)。

2.给细胞培养瓶中加入冰冷的改良RIPA液,RIPA液的用量:按照1 ml/10 细胞/100mm 培养面/150cm瓶或 0.5 ml每5×10 细胞/60mm 培养面/75cm 瓶计算。

3.用经蒸馏水预冷的橡皮或塑料细胞刮棒将贴壁细胞转移至一离心管中,轻轻混匀细胞悬液,用振荡器在4℃振荡15min以裂解细胞。

4.于4℃,14000g离心裂解液15min,迅速转移上清至另一离心管中,弃掉沉淀。

5.准备蛋白A(蛋白G或Sepharose):用PBS洗涤蛋白A(蛋白G或Sepharose)珠子两次,并将其用PBS调制成50%悬液。

6.每1ml细胞裂解液上清加入100µl蛋白A,4℃,振荡10min,进行预清除。

7.4℃,14000g离心10min移去蛋白A(蛋白G或Sepharose)珠子,转移上清至一新离心管中。

8.用Bradford法(考马斯亮蓝染色法)测定蛋白浓度。(应至少将细胞裂解液作1:10稀释后再测定,这是因为存在于裂解液中的去污剂成分会干扰考马斯亮蓝的作用)。

9.根据所测得的细胞裂解液蛋白浓度,用PBS将其稀释至1mg/ml以降低缓冲体系中去污剂的浓度(但对于那些在细胞中表达水平较低的蛋白而言,10mg/ml这样更高的浓度可能对免疫沉淀更有效一些)。

10.加入推荐体积的免疫沉淀抗体至500µl细胞裂解液中。(抗体的最适用量要根据每一细胞模型中免疫沉淀靶蛋白的数量来确定)。 2627

11.将细胞裂解液与抗体轻轻混匀后孵育2h,或置摇床上振荡4℃过夜。(选择孵育2h常用于免疫沉淀与激酶或磷酸酯酶作用的活化酶。)加入100µl蛋白A(蛋白G或Sepharose)轻轻振荡1h或4℃过夜以捕获免疫沉淀复合物。(在多数情况下,加入2µg像兔抗小鼠IgG这样的桥连抗体可以增强对免疫复合物的捕获能力,这对于像小鼠IgG1或由鸡所产生的低亲和力抗体尤为重要)。

12.通过脉冲离心(14000 rpm,5s)收集琼脂糖/Sepharose珠子,弃掉上清,用800µl冰冷的改良RIPA缓冲液洗涤珠子3次。

13.将琼脂糖/Sepharose珠子重悬于60µl 2×SDS蛋白上样缓冲液中,轻混均匀后煮沸5min,200g离心1min弃掉珠子。

14.将上清转移至一新离心管中-20℃冻存或进行SDS-PAGE电泳。