免疫沉淀反应

范文一:19免疫沉淀反应IP

免疫沉淀反应

IP-Immunoprecipitation

免疫沉淀是利用抗体特异性反应纯化富集目的蛋白的一种方法。抗体与细胞裂解液或表达上清中相应的蛋白结合后,再与蛋白A/G(ProteinA/G)或二抗偶联的agaose或Sepharose珠子孵育,通过离心得到珠子-蛋白A/G或二抗-抗体-目的蛋白复合物,沉淀经过洗涤后,重悬于电泳上样缓冲液,煮沸5-10min,在高温及还原剂的作用下,抗原与抗体解离,离心收集上清,上清中包括抗体、目的蛋白和少量的杂蛋白。

主要用于抗原或者抗体的定性检测。其原理是指可溶性抗原与相应抗体在有电解质存在的情况下,按适当比例所形成的可见沉淀物现象。据此现象设计的沉淀实验主要包括絮状沉淀试验,环状沉淀试验和凝胶内的沉淀试验。凝胶内的沉淀试验依所用的实验方法又可分为免疫扩散实验和免疫电泳技术2类。

材料:1. 蛋白A 或蛋白G

2. 一抗

3. 免疫沉淀缓冲液:20 mM 磷酸钠,pH 7.5,500 mM NaCl,0.1% SDS,1% NP40,0.5% 脱氧胆酸钠 and 0.02% 叠氮化钠. (> NOTE: 50 mM 醋酸钠缓冲液,pH 5.0,. 500 mM NaCl,0.1% SDS,1% NP-40 and 0.02%叠氮化钠也可作为免疫沉淀的缓冲液,能提高蛋白G的结合功效)

4. 洗脱液:0.1 M 甘氨酸-HCl buffer,pH 2.5

5.SDS-PAGE上样缓冲液 (pH 6.8):2% SDS,62.5 mM Tris 碱,10% 甘油,2-5%2-巯基乙醇

步骤:1. 用50 μl免疫沉淀缓冲液溶解抗原,向溶液中加入1倍过量的特异性一抗。加入免疫沉淀缓冲液至样品体积为0.2 ml。一般情况下,在此体积下2-5μg的纯化抗体能够较好地形成抗原抗体复合物。

2. 样品4℃.孵育过夜。

3. 将适量的蛋白A或蛋白G加到抗原抗体复合物中(~ 50 μl of gel per 5 μg of antibody)。

4. 室温下,轻柔混匀样品,孵育2小时。

5. 用0.5ml免疫沉淀缓冲液洗蛋白A或蛋白G连接的抗原抗体复合物,离心2-3分钟,弃上清。重复此步骤至少6次。

6. 用50 μl洗脱液孵育蛋白A或蛋白G连接的抗原抗体复合物5分钟,将抗原抗体复合物从蛋白A或蛋白G上洗脱下来,离心,收集上清。另用50 μl洗脱液孵育胶5分钟,离心,收上清。将两个上清混合。

7. 立即调节蛋白样品的pH至生理值,用一种合适的、多次离心的缓冲液调节,如1.0 M Tris,pH 7.5 (10 μl of this buffer to 100 μl of the supernatant should be sufficient).

8. 将洗脱成分除盐。

9. 准备好样品待定性。

NOTE: 如果用SDS-PAGE定性蛋白质,省去步骤6-9。在完成第5步之前,用0.5ml蒸馏水洗胶。离心蛋白A或蛋白G 2-3分钟,弃上清。用25μl SDS-PAGE上样缓冲液在95°C孵育蛋白A或蛋白G连接的抗原抗体复合物5分钟。样品离心,收集上清。重复一次,汇集上清至总体积50μl。由此样品则准备妥当。

特发性多神经炎idiopathic polyneuritis 潜伏期/孵育期incubation perioc

吞噬指数index of phagocytosis 预防感染,预防传染infection prevention

数字PCR(digital PCR) 让你能够直接数出DNA分子的个数,是对起始样品的绝对定量。因此ddPCR特别适用于依靠Ct值不能很好分辨的应用领域:拷贝数变异、突变检测、基因相对表达研究(如等位基因不平衡表达)、二代测序结果验证、miRNA表达分析、单细胞基因表达分析等。

ddPCR技术是通过将微量样品作大倍数稀释和分液(partitioning),直至每个样品中所含有的待测分子数不会超过1个,再将所有样品在相同条件下进行PCR扩增,并对发生了扩增反应的样品逐个进行计数的一种技术。

数字PCR原理:PCR实际上是一个在模板DNA、引物(模板片段两端的已知序列)和四种脱氧核苷酸等存在的情况下,DNA聚合酶依赖的酶促合成反应,扩增的特异性取决于引物与模板DNA的持异结合。

整个扩增过程分三步:

1、变性:使DNA双链解离,形成两条单链;

2、退火:温度下降后模板DNA与引物按碱基配对原则互补结合,也可能存在两条模板链之间的结合,但由于引物的高浓度、结构简单等特点,结合主要发生在模板与引物之间;

3、延伸:在DNA聚合酶及镁离子等存在的条件下,从引物的3"端开始,结合单核苷酸,形成与模板链互补的新DNA链。上述几步为一个循环,从理论上讲,每经过1个循环,样本中的DNA应该增加一倍,新形成的链又可成为新一轮循环的模板。第2个循环开始后,模板链增加—倍。

仪器:伯乐生命bio-rad QX200 微滴式数字PCR (ddPCR) 系统可对DNA或RNA分子进行绝对定量分析,适用于 EvaGreen 或基于探针的数字PCR应用领域。

QX200 Droplet数字PCR(Digital PCR) 系统的应用领域:癌症生物标志物研究和拷贝数变异分析。

PFU微型生物群落监测方法(以下简称PFU法)

是应用泡沫塑料块作为人工基质收集水体中的微型生物群落,测定该群落结构与功能的各种参数,以评价水质。此外,用室内毒性试验方法,以预报工业废水和化学品对受纳水体中微型生物群落的毒性强度,为制定其安全浓度和最高允许浓度提出群落级水平的基准。 原理:微型生物群落在水生态系统中客观存在。用PFU浸泡水中,曝露一定时间后,水体中大部分微型生物种类均可群集到PFU内,挤出的水样能代表该水体中的微型生物群落。

遗传异质性: 遗传异质性(genetic heterogeneity)是指某一种遗传疾病或表型可以由不同的等位基因或者基因座突变所引起的现象。与之相对反的是基因多效性,是由某一个基因突变引起多种疾病或表型。遗传异质性分为等位基因异质性和基因座异质性。

基因座异质性病是由不同基因座的基因突变引起的,如先天性聋哑有常染色体隐性遗传、常染色体显性遗传和X连锁隐性遗传3种遗传方式。属于场染色体隐性遗传的有35个基因座位,占病例总数的68%。因此,常可见到2

个先天性聋哑患者婚配后生出并不聋哑的孩子,就是由于父母的聋哑基因不在同一基因座位所致,即一个亲代的基因型为AAbb,另一个亲代的基因型为aaBB,两个亲代都是某基因座的纯合子患者,但他们子女的基因型为AaBb,在两个基因座位上均为杂合子,故表现正常。

等位基因异质性是指某一遗传病是由同一基因座上的不同突变引起的,如β地中海贫血,既可能是由于β珠蛋白基因点突变所致的RNA加工障碍或转录调控区改变引起的,也可能是由于β珠蛋白基因缺失引起的

骨髓增生异常综合症( myelodysplastic syndrome, MDS):是一组起源于造血髓系定向干细胞或多能干细胞的异质性克隆性疾患,主要特征是无效造血和高危演变为急性髓系白血病,临床表现为造血细胞在质和量上出现不同程度的异常变化。其具体临床表现为贫血,可伴有感染或出血,部分病人可无症状。部分患者可有肝,脾,淋巴结轻度肿大,少数患者可有胸骨压痛,肋骨或四肢关节痛。血象可呈全血细胞减少,或任何一系及二系血细胞减少。 1982年由FAB协作组建议确立病名,并将MDS分为五型:难治性贫血;难治性贫血伴环状铁粒幼细胞增多;难治性贫血伴原始细胞增多,转变中的难治性贫血伴原始细胞增多;慢性粒-单核细胞白血病。

MDS分型:1982年FAB协作组首先倡导MDS这一概念并将MDS分为五型:难治性贫血(refracrory aremia,RA);难治性贫血伴环状铁幼粒细胞增多(RA with ring sideroblst ,RAS);难治性贫血伴原始细胞增多(RA with an excess of blast, RAEB);转变中的难治性贫血伴原始细胞增多(RAEB in transformation,RAEB-T);慢性粒-单核细胞性白血病(chronic myelo-monocytic leukemia,CMML); MDS分型已由FAB标准过度到WHO标准,按照此标准将MDS分为以下八型:难治性贫血(RA);难治性贫血伴环状铁幼粒细胞增多(RARS);难治性血细胞减少症伴幼多系发育异常(RCMD);难治性血细胞减少症伴有多系发育异常和环状铁幼粒细胞(RCMD-RS);难治性贫血伴原始细胞增多-1(RAEB-1);难治性贫血伴原始细胞增多-2(RAEB-2);MDS,不能分类(MDS-U);MDS伴单纯del(5q);.WHO关于MDS的分类标准对于规范和同意MDS的诊断和治疗具有非常重要的意义,但WHO 分型标准面世,不久,目前尚未得到与FAB分型同样的认可与应用。 无效造血----ineffective hematopoiesis在骨髓内红细胞分裂成熟的过程中,由于某种原因使其在成熟和进入外周循环之前就被破坏,死亡,称之为无效造血,或者无效性红细胞生成,或原位溶血。

无效造血包括获得性和遗传性两种情况,前者如骨髓增生异常综合症,后者如先天性红系造血异常性贫血(congenital

dyserythropoietic anemia)。在巨幼红细胞性贫血,铁粒幼细胞性贫血和珠蛋白合成障碍性贫血(海洋性贫血或异常血红蛋白病)等,无效造血明显增加,导致释放到末梢血中的红细胞减少,是造成贫血的一个重要原因。

造血细胞(hematopoietic cell): 造血干细胞和定向干细胞的统称,是免疫细胞的来源。

范文二:免疫沉淀反应(刘江涌)21段

免疫沉淀反应,Western印迹法和共免疫沉淀

根据厂商的指示,依靠Grb2, CrkII, Nck2或者PNRC抗体的抗体免疫沉淀反应实验的进行需要使用免疫沉淀试剂盒(蛋白A)(罗氏分子生化药剂,曼海姆,德国)。简单地说,细胞裂解液(冰冻, 50mM Tris-HCl, pH 7.5, 150mM NaCl,1% Nonidet P40, 0.5% 脱氧胆酸钠,以及整套蛋白酶抑制剂的混合物)被添加到经PBS洗过的细胞上。经过20分钟的冰敷后,将细胞刮下,转移至微量离心管,声波处理,然后在4摄氏度、12000的离心力下离心10分钟。用来进行免疫沉淀反应和共反应沉淀的细胞裂解物量分别为2mg,15mg。为了减少本底,将小份溶菌液和50微升蛋白A均匀琼脂悬浮液混合,然后在2至8摄氏度的摇摆平台上培育一夜。用12000g、4摄氏度的离心机离心20s来清除琼脂糖微球。接下来用上清液来培育特定抗体,这需要Grb2,CrkII, Nck2(1:1000稀释,圣克鲁斯生物技术公司,Inc.,Santa Cruz, CA, USA),或者PNRC抗血清(1:500稀释),或者非特异性的免疫球蛋白G(1:1000稀释,杰克逊Immunoresearch实验室),或者rabbit preserum(1:500稀释)作为一种control(control不知道是对照还是抑制还是调控),并且轻轻的在41度下摇晃1小时。在2-8度下,将五十微升的蛋白A的均质琼脂糖悬液添加到摇摆平台上来进一步培养。在4度下,用12000g的离心力离心20秒来收集免疫复合物。沉淀颗粒的洗涤每次都要用三种洗涤缓冲液,洗涤液1(和细胞裂解液相同),洗涤液2(冰冻,50mM Tris-HCl, pH 7.5, 500mM NaCl, 0.1% Nonidet P40, 0.05% 脱氧胆酸钠)。沉淀颗粒用凝胶加样缓冲液洗脱,在一个12% 的SDS– PAGE上进行分离,并用Western印迹法检验,使用Grab2抗体或者PNRC抗血清中的任意一个。免疫蛋白复合体被1:1000稀释的山羊抗兔辣根过氧化物酶共轭(皮尔斯化工有限公司)检测到,紧接着的是二氨基联苯胺(二氨基联苯胺盐酸盐,西格玛)的底物显谱。

范文三:免疫共沉淀

1. 免疫沉淀(Immunoprecipitation, IP):

A.蛋白样品的准备:

A1.对于10厘米细胞培养皿中的贴壁细胞,吸除细胞培养液,PBS洗涤一次,然后加入500微升至2毫升细胞裂解液裂解细胞。可以使用碧云天生产的Western及IP细胞裂解液(P0013)或各种RIPA裂解液(P0013B、P0013C、P0013D或P0013E)等进行细胞的裂解。

A2.对于组织样品参考贴壁细胞使用裂解液的比例进行裂解。

A3.对于悬浮细胞,离心收集细胞后,PBS洗涤一次,然后参考贴壁细胞的裂解方法进行裂解。

注:详细的裂解方法参考不同裂解液的详细使用方法。对于不同的培养器材,参考10厘米培养皿的裂解液的用量进行裂解。如果裂解获得的蛋白样品浓度过高,可以用裂解液或PBS适当稀释,如果蛋白样品浓度过低,在以后的裂解过程中宜适当减少裂解液的用量。

B.去除非特异性结合(可选做):

B1.取200微升至1毫升蛋白样品,蛋白量约为200微克至1毫克,加入约1微克和免疫沉淀时使用的IgG种属相同的普通IgG和20微升充分重悬的Protein G Agarose,4℃缓慢摇动30分钟至2小时。

B2.2500rpm(约1000g)离心5分钟,取上清用于后续的免疫沉淀。

注:所谓种属相同的IgG是指,例如后续免疫沉淀时用的是小鼠IgG,则在本步骤中可以加入normal mouse IgG,如无normal IgG可以加入其它不影响后续检测的其它mouse IgG类型的抗体。通过和normal IgG和Protein G Agarose的孵育,可以充分降低非特异性的结合,降低背景。

C.免疫沉淀:

C1.加入0.2-2微克用于免疫沉淀的一抗,4℃缓慢摇动过夜。

C2.再加入20微升充分重悬的Protein G Agarose,4℃缓慢摇动1-3个小时。(为方便后续的洗涤操作可以把加入充分重悬的Protein G Agarose的量调整为40微升。)

C3.2500rpm(约1000g)离心5分钟,或瞬时高速离心,小心吸除上清,注意宁可留下少量上清也不能吸掉Protein G Agarose。

C4.用准备蛋白样品时的裂解液或PBS洗涤沉淀5次,裂解液或PBS的用量每次为0.5-1毫升。洗涤时离心条件和吸除上清的要求同上面的步骤C3。

C5.完成最后一次洗涤后,去除上清,加入20-40微升1XSDS-PAGE电泳上样缓冲液Vortex重悬沉淀,瞬时高速离心把样品离心至管底。

C6.100℃或沸水浴处理3-5分钟,取部分或全部样品用于SDS-PAGE电泳,暂时不用的样品可以-20℃保存。

2.免疫共沉淀:

参考免疫沉淀的方法进行,但免疫共沉淀(co-IP)通常必须使用未经冻存的新鲜蛋白样品。普通的免疫沉淀虽然可以使用冻存的蛋白样品,但也宜用新鲜的蛋白样品为佳。

免疫共沉淀

一 原理:

IP是利用抗原蛋白质和抗体的特异性结合以及细菌蛋白质的“prorein A"特异性地结合到免疫球蛋白的FC片段的现象活用开发出来的方法。目前多用精制的prorein A预先结合固化在argarose的beads上,使之与含有抗原的溶液及抗体反应后,beads上的prorein A就能吸附抗原达到精制的目的。

实验最需要注意点就是抗体的性质。抗体不同和抗原结合能力也不同,免染能结合未必能用在IP反应。建议仔细检查抗体

的说明书。特别是多抗的特异性是问题。

其次,要注意溶解抗原的缓冲液的性质。多数的抗原是细胞构成的蛋白,特别是骨架蛋白,缓冲液必须要使其溶解。为此,必须使用含有强界面活性剂的缓冲液,尽管它有可能影响一部分抗原抗体的结合。另一面,如用弱界面活性剂溶解细胞,就不能充分溶解细胞蛋白。即便溶解也产生与其它的蛋白结合的结果,抗原决定族被封闭,影响与抗体的结合,即使IP成功,也是很多蛋白与抗体共沉的悲惨结果。

再次,为防止蛋白的分解,修饰,溶解抗原的缓冲液必须加蛋白每抑制剂,低温下进行实验。

每次实验之前,首先考虑抗体/缓冲液的比例。抗体过少就不能检出抗原,过多则就不能沉降在beads上,残存在上清。缓冲剂太少则不能溶解抗原,过多则抗原被稀释。欲速则不达,确定好比例很必要。

二 准备:

器械

#微量高速冷冻离心机

#移液枪

#旋转盘

#电泳设备

#vortex震荡器

#液氮及组织粉碎器 #eppentube

试剂

#细胞或组织

#蛋白定量kit

#SDS电泳试剂

#抗体(单抗时选择protein G,二抗选择抗鼠Ig兔血清) #PBS #NaN3 #proteinA sapharose

试剂配制

抗原蛋白溶解缓冲液

1.RIPA缓冲液 (最终浓度)

1MTris-HCL(PH7.4) 5ml (10mM) 5MNacl 15ml (150mM)

0.5M EDTA(PH7.4) 5ml (5mM)

20%TritonX-100 25ml (1%) 10% DOC 50ml (1%) 10%SDS 5ml ( o.1%)

TLCK 18.5mg (0.1mM) TPCK 35mg (0.2mM) DDW 395ml toal 500ml

另外,使用之前加1mMPMSF(PMSF溶在酒精,浓度100mM,-20度遮光保存。注意不易溶于水)

2.NP40 lysis 缓冲液

1MTris-HCL(PH7.4) 5ml (10mM) 5MNacl 15ml (150mM)

0.5M EDTA(PH7.4) 5ml (5mM) 20%NP40 25ml (1%)

TLCK 18.5mg (0.1mM) TPCK 35mg (0.2mM) DDW 450ml toal 500ml

使用前加1mM的PMSF

注意点:

*Tris缓冲剂PH随温度变化,高浓度盐酸滴定时发热,冷却后PH增高。

*反复使用PMSF要注意保管方法。

*1和2的缓冲剂的区别在于界面活性剂。TritonX-100,NP40是非离子界面活性剂,作用温和,,DOC

*两方都有EDTA,对抗原而言,二价离子Mg,Ca等是必要的。根据自己需要调节。EDTA用NaOH滴定。

Protocol

1 调制protein A sapharose

protein A sapharose 5ml 溶于20ml含0.02%NaN3的PBS

离心2000转2分,去上清,在沉淀加0.02%NaN3的PBS,离心后去上清,重复2次,最后沉淀加20ml含0.02%NaN3的PBS,冷藏保存

用单抗做一抗时,把protein A sapharose先用抗鼠Ig兔血清处理(每50ulprotein A sapharose用1-5ul血清)。旋转1-2h,混匀后,再离心1-2s

去上清后,加PBS,vortex混合,离心去上清,重复二次

加含0.02%NaN3的PBS到原来体积,冷存。避免长期保存。

2.抗原的检出

以下操作全在冰面或4度进行

去除细胞培养液,用冷PBS洗一次。加RIPA,溶解后,转移到eppentube中用vortex混匀。RIPA的量:6cm的培养皿加1 ml(蛋白质的量为500mg/ml),组织块用液氮粉碎,在缓冲剂中捣匀,蛋白定量。

30m,15000rpm离心,上清转移到新tube 。不用移液枪,直接从tube倒进另一个tube

往上清加抗体,1ml加2-5ul抗体,冷室内旋转混匀1h

加protein A sapharose50ul,再混匀1h

5000rpm离心1s,使sapharose沉淀,去上清。往sapharose加RIPA,vortex 混匀,离心,去上清。重复4次洗净。

加电泳用 sample 缓冲液40ul,2m煮沸,泳动后,固定/干燥胶,现像。

3.注意点

A:不熟练使用移液枪,会混入沉淀的不溶性蛋白,使实验失败。对无论怎么也除不去的混入蛋白,只使用上清的上半部,或用超速离心机。

B:对电泳的非特异条带,最后可依次用含300mM,1omMNaCl的RIPA洗净各一次。(完)

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免疫共沉淀技术路线

准备工作:

预冷PBS,RIPA Buffer,细胞刮子(用保鲜膜包好后,埋冰下),离心机

1. 用预冷的PBS洗涤细胞两次,最后一次吸干PBS;

2. 加入预冷的RIPA Buffer(1ml/107个细胞、10cm培养皿或150cm2培养瓶,0.5ml/5×106个细胞、6cm培养皿、75cm2培养瓶)

3. 用预冷的细胞刮子将细胞从培养皿或培养瓶上刮下,把悬液转到1.5EP管中,4℃,缓慢晃动15min(EP管插冰上,置水平摇床上)

4. 4℃,14000g离心15min,立即将上清转移到一个新的离心管中

5. 准备Protein A agarose,用PBS 洗两遍珠子,然后用PBS配制成50%浓度,建议减掉枪尖部分,避免在涉及琼脂糖珠的操作中破坏琼脂糖珠

6. 每1ml总蛋白中加入100μl Protein A琼脂糖珠(50%),4℃摇晃10min(EP管插冰上,置水平摇床上),以去除非特异性杂蛋白,降低背景

7. 4℃,14000g离心15min,将上清转移到一个新的离心管中,去除Protein A珠子

8. (Bradford 法)做蛋白标准曲线,测定蛋白浓度,测前将总蛋白至少稀释1:10倍以上,以减少细胞裂解液中去垢剂的影响(定量,分装后,可以在-20℃保存一个月)

9. 用PBS将总蛋白稀释到约1 μg/μl,以降低裂解液中去垢剂的浓度,如果兴趣蛋白在细胞中含量较低,则总蛋白浓度应该稍高(如10 μg/μl)

10. 加入一定体积的兔抗到500μl总蛋白中,抗体的稀释比例因兴趣蛋白在不同细胞系中的多少而异

11. 4℃缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或室温2h,激酶或磷酸酯酶活性分析建议用2 h室温孵育

12. 加入100μl Protein A琼脂糖珠来捕捉抗原抗体复合物,4℃缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或室温1h,如果所用抗体为鼠抗或鸡抗,建议加2 μl“过渡抗体”(兔抗鼠IgG,兔抗鸡IgG)

13. 14000rpm瞬时离心5s,收集琼脂糖珠-抗原抗体复合物,去上清,用预冷的RIPA buffer洗3遍,800μl/遍,RIPA buffer有时候会破坏琼脂糖珠-抗原抗体复合物内部的结合,可以使用PBS

14. 用60μl 2×上样缓冲液将琼脂糖珠-抗原抗体复合物悬起,轻轻混匀,缓冲液的量依据上样多少的需要而定(60 μl足够上三道)

15. 将上样样品煮5min,以游离抗原,抗体,珠子,离心,将上清电泳,收集剩余琼脂糖珠,上清也可以暂时冻-20℃,留待以后电泳,电泳前应再次煮5min变性。

RIPA Buffer配制:

基础成分:

Tris-HCl(缓冲液成分,防止蛋白变性)

NaCl(盐份,防止非特异蛋白聚集)

NP-40(非离子去污剂,提取蛋白;用H2O配制成10%储存液) 去氧胆酸钠(离子去污剂,提取蛋白;用H2O配制成10%储存液;避光保存)

注意:准备激酶(致活酶)实验时,不要加去氧胆酸钠,因为离子型去污剂能够使酶变性,导致活性丧失。

RIPA蛋白酶抑制剂

苯甲基磺酰氟(PMSF)(用异丙醇配制成200mM的储存液,室温保存)

EDTA(钙螯合剂;用H2O配制成100mM的储存液,PH 7.4)

亮抑酶肽(Leupeptin)(用H2O配制成1mg/ml的储存液,分装,-20℃保存)

抑蛋白酶肽(Aprotinin)(用H2O配制成1mg/ml的储存液,分装,-20℃保存)

胃蛋白酶抑制剂(Pepstatin)(用甲醇配制成1mg/ml的储存液,分装,-20℃保存)

RIPA磷酸(酯)酶抑制剂

激活的Na3VO4(用H2O配制成200mM的储存液,见Sodium Orthovanadate Activation Protoco)

NaF(200mM的储存液,室温保存)

注意:在准备做磷酸(酯)酶实验的时候,不加磷酸酯酶抑制剂

工作液配制:

配制100ml的modified RIPA buffe:

1. 称取790mg 的Tris-Base,加到75ml 去离子水中,加入900mg的NaCl,搅拌,直到全部溶解,用HCl调节PH值到7.4

2. 加10 ml 10%的NP-40

3. 加2.5 ml 10%的去氧胆酸钠,搅拌,直到溶液澄清

4. 加1 ml 100mM的EDTA,用量筒定容到100ml,2-8℃保存

5. 理论上,蛋白酶和磷酸酯酶抑制剂应该在使用当天同时加入(抑蛋白酶肽,亮抑酶肽,胃蛋白酶抑制剂各100 µl; PMSF, Na3VO4, NaF各500 µl),但是PMSF在水溶液中很不稳定,30分钟就会降解一半,所以PMSF应该在使用前现加,其他抑制剂成分可以在水溶液中稳定5天。

各种成分在工作液中的终浓度:

• Tris-HCl: 50 mM, pH 7.4

• NP-40: 1%

• 去氧胆酸钠:0.25%

• NaCl: 150 mM

• EDTA: 1 mM

• PMSF: 1 mM

• 抑蛋白酶肽,亮抑酶肽,胃蛋白酶抑制剂: 各1 µg/ml

• Na3VO4: 1 mM

• NaF: 1 mM

通过免疫共沉淀确定结合蛋白

1.用磷酸盐缓冲液洗30块10 cm培养板上的适宜细胞。刮去每块板上的细胞到1 ml冰冷的EBC裂解缓冲液中。

2.将每毫升细胞悬液转移到微量离心管中,在微量离心机上4℃以最大速度离心15 min。

3.收集上清(约30 ml)并加入30μg的适当抗体,4℃摇动免疫沉淀物1 h。

4.加入0.9 ml的蛋白质A-Sepharose 悬液,4℃摇动免疫沉淀物30 min。

5.用含900 mmol/L NaCl的NETN洗蛋白A-Sepharose混合物,再重复洗5次。最后,用NETN洗一次。

6.吸出混合物的液体部分。加入800μl的1×SDS胶加样缓冲液到球珠中,煮沸4 min。

7.将样品加入到大孔的不连续SDS-PAGE梯度胶中,在10 mA的恒定电流下电泳过夜。

8.通过考马斯蓝染色观察蛋白质泳带。

9.从胶上切下目标带,将其放到微量离心管中,用1ml 50%乙腈洗两次,每次3 min。

10. 用胰蛋白酶消化胶中的蛋白质,再将肽电洗脱。

11. 通过窄孔高效液相色谱分离肽。将收集的肽在ABI 477A或494A机器上进行自动Edman降解测序。

免疫共沉淀

一 原理:

IP是利用抗原蛋白质和抗体的特异性结合以及细菌蛋白质的“prorein A"特异性地结合到免疫球蛋白的FC片段的现象活用开发出来的方法。目前多用精制的prorein A预先结合固化在argarose的beads上,使之与含有抗原的溶液及抗体反应后,beads上的prorein A就能吸附抗原达到精制的目的。

实验最需要注意点就是抗体的性质。抗体不同和抗原结合能力也不同,免染能结合未必能用在IP反应。建议仔细检查抗体的说明书。特别是多抗的特异性是问题。

其次,要注意溶解抗原的缓冲液的性质。多数的抗原是细胞构成的蛋白,特别是骨架蛋白,缓冲液必须要使其溶解。为此,必须使用含有强界面活性剂的缓冲液,尽管它有可能影响一部分抗原抗体的结合。另一面,如用弱界面活性剂溶解细胞,就不能充分溶解细胞蛋白。即便溶解也产生与其它的蛋白结合的结果,抗原决定族被封闭,影响与抗体的结合,即使IP成功,也是很多蛋白与抗体共沉的悲惨结果。

再次,为防止蛋白的分解,修饰,溶解抗原的缓冲液必须加蛋白每抑制剂,低温下进行实验。

每次实验之前,首先考虑抗体/缓冲液的比例。抗体过少就不能检出抗原,过多则就不能沉降在beads上,残存在上清。缓冲剂太少则不能溶解抗原,过多则抗原被稀释。欲速则不达,确定好比例很必要。

二 准备:

器械

#微量高速冷冻离心机

#移液枪

#旋转盘

#电泳设备

#vortex震荡器

#液氮及组织粉碎器 #eppentube

试剂

#细胞或组织

#蛋白定量kit

#SDS电泳试剂

#抗体(单抗时选择protein G,二抗选择抗鼠Ig兔血清)

#PBS

#NaN3 #proteinA sapharose

试剂配制

抗原蛋白溶解缓冲液

1.RIPA缓冲液 (最终浓度)

1MTris-HCL(PH7.4) 5ml (10mM) 5MNacl 15ml (150mM)

0.5M EDTA(PH7.4) 5ml (5mM)

20%TritonX-100 25ml (1%) 10% DOC 50ml (1%) 10%SDS 5ml ( o.1%)

TLCK 18.5mg (0.1mM) TPCK 35mg (0.2mM) DDW 395ml toal 500ml

另外,使用之前加1mMPMSF(PMSF溶在酒精,浓度100mM,-20度遮光保存。注意不易溶于水)

2.NP40 lysis 缓冲液

1MTris-HCL(PH7.4) 5ml (10mM) 5MNacl 15ml (150mM)

0.5M EDTA(PH7.4) 5ml (5mM) 20%NP40 25ml (1%)

TLCK 18.5mg (0.1mM) TPCK 35mg (0.2mM) DDW 450ml toal 500ml

使用前加1mM的PMSF

注意点:

*Tris缓冲剂PH随温度变化,高浓度盐酸滴定时发热,冷却后PH增高。

*反复使用PMSF要注意保管方法。

*1和2的缓冲剂的区别在于界面活性剂。TritonX-100,NP40是非离子界面活性剂,作用温和,,DOC

*两方都有EDTA,对抗原而言,二价离子Mg,Ca等是必要的。根据自己需要调节。EDTA用NaOH滴定。

Protocol

1 调制protein A sapharose

protein A sapharose 5ml 溶于20ml含0.02%NaN3的PBS

离心2000转2分,去上清,在沉淀加0.02%NaN3的PBS,离心后去上清,重复2次,最后沉淀加20ml含0.02%NaN3的PBS,冷藏保存

用单抗做一抗时,把protein A sapharose先用抗鼠Ig兔血清处理(每50ulprotein A sapharose用1-5ul血清)。旋转1-2h,

混匀后,再离心1-2s

去上清后,加PBS,vortex混合,离心去上清,重复二次

加含0.02%NaN3的PBS到原来体积,冷存。避免长期保存。

2.抗原的检出

以下操作全在冰面或4度进行

去除细胞培养液,用冷PBS洗一次。加RIPA,溶解后,转移到eppentube中用vortex混匀。RIPA的量:6cm的培养皿加1 ml(蛋白质的量为500mg/ml),组织块用液氮粉碎,在缓冲剂中捣匀,蛋白定量。

30m,15000rpm离心,上清转移到新tube 。不用移液枪,直接从tube倒进另一个tube

往上清加抗体,1ml加2-5ul抗体,冷室内旋转混匀1h

加protein A sapharose50ul,再混匀1h

5000rpm离心1s,使sapharose沉淀,去上清。往sapharose加RIPA,vortex 混匀,离心,去上清。重复4次洗净。

加电泳用 sample 缓冲液40ul,2m煮沸,泳动后,固定/干燥胶,现像。

3.注意点

A:不熟练使用移液枪,会混入沉淀的不溶性蛋白,使实验失败。对无论怎么也除不去的混入蛋白,只使用上清的上半部,或用超速离心机。

B:对电泳的非特异条带,最后可依次用含300mM,1omMNaCl的RIPA洗净各一次。(完)

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免疫共沉淀技术路线

准备工作:

预冷PBS,RIPA Buffer,细胞刮子(用保鲜膜包好后,埋冰下),离心机

1. 用预冷的PBS洗涤细胞两次,最后一次吸干PBS;

2. 加入预冷的RIPA Buffer(1ml/107个细胞、10cm培养皿或150cm2培养瓶,0.5ml/5×106个细胞、6cm培养皿、75cm2培养瓶)

3. 用预冷的细胞刮子将细胞从培养皿或培养瓶上刮下,把悬液转到1.5EP管中,4℃,缓慢晃动15min(EP管插冰上,置水平摇床上)

4. 4℃,14000g离心15min,立即将上清转移到一个新的离心管中

5. 准备Protein A agarose,用PBS 洗两遍珠子,然后用PBS配制成50%浓度,建议减掉枪尖部分,避免在涉及琼脂糖珠的操作中破坏琼脂糖珠

6. 每1ml总蛋白中加入100μl Protein A琼脂糖珠(50%),4℃摇晃10min(EP管插冰上,置水平摇床上),以去除非特异性杂蛋白,降低背景

7. 4℃,14000g离心15min,将上清转移到一个新的离心管中,去除Protein A珠子

8. (Bradford 法)做蛋白标准曲线,测定蛋白浓度,测前将总蛋白至少稀释1:10倍以上,以减少细胞裂解液中去垢剂的影响(定量,分装后,可以在-20℃保存一个月)

9. 用PBS将总蛋白稀释到约1 μg/μl,以降低裂解液中去垢剂的浓度,如果兴趣蛋白在细胞中含量较低,则总蛋白浓度应该稍高(如10 μg/μl)

10. 加入一定体积的兔抗到500μl总蛋白中,抗体的稀释比例因兴趣蛋白在不同细胞系中的多少而异

11. 4℃缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或室温2h,激酶或磷酸酯酶活性分析建议用2 h室温孵育

12. 加入100μl Protein A琼脂糖珠来捕捉抗原抗体复合物,4℃缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或室温1h,如果所用抗体为鼠抗或鸡抗,建议加2 μl“过渡抗体”(兔抗鼠IgG,兔抗鸡IgG)

13. 14000rpm瞬时离心5s,收集琼脂糖珠-抗原抗体复合物,去上清,用预冷的RIPA buffer洗3遍,800μl/遍,RIPA buffer有时候会破坏琼脂糖珠-抗原抗体复合物内部的结合,可以使用PBS

14. 用60μl 2×上样缓冲液将琼脂糖珠-抗原抗体复合物悬起,轻轻混匀,缓冲液的量依据上样多少的需要而定(60 μl足够上三道)

15. 将上样样品煮5min,以游离抗原,抗体,珠子,离心,将上清电泳,收集剩余琼脂糖珠,上清也可以暂时冻-20℃,留待以后电泳,电泳前应再次煮5min变性。

RIPA Buffer配制:

基础成分:

Tris-HCl(缓冲液成分,防止蛋白变性)

NaCl(盐份,防止非特异蛋白聚集)

NP-40(非离子去污剂,提取蛋白;用H2O配制成10%储存液) 去氧胆酸钠(离子去污剂,提取蛋白;用H2O配制成10%储存液;避光保存)

注意:准备激酶(致活酶)实验时,不要加去氧胆酸钠,因为离子型去污剂能够使酶变性,导致活性丧失。

RIPA蛋白酶抑制剂

苯甲基磺酰氟(PMSF)(用异丙醇配制成200mM的储存液,室温保存)

EDTA(钙螯合剂;用H2O配制成100mM的储存液,PH 7.4)

亮抑酶肽(Leupeptin)(用H2O配制成1mg/ml的储存液,分装,-20℃保存)

抑蛋白酶肽(Aprotinin)(用H2O配制成1mg/ml的储存液,分装,-20℃保存)

胃蛋白酶抑制剂(Pepstatin)(用甲醇配制成1mg/ml的储存液,分装,-20℃保存)

RIPA磷酸(酯)酶抑制剂

激活的Na3VO4(用H2O配制成200mM的储存液,见Sodium Orthovanadate Activation Protoco)

NaF(200mM的储存液,室温保存)

注意:在准备做磷酸(酯)酶实验的时候,不加磷酸酯酶抑制剂

工作液配制:

配制100ml的modified RIPA buffe:

1. 称取790mg 的Tris-Base,加到75ml 去离子水中,加入900mg的NaCl,搅拌,直到全部溶解,用HCl调节PH值到7.4

2. 加10 ml 10%的NP-40

3. 加2.5 ml 10%的去氧胆酸钠,搅拌,直到溶液澄清

4. 加1 ml 100mM的EDTA,用量筒定容到100ml,2-8℃保存

5. 理论上,蛋白酶和磷酸酯酶抑制剂应该在使用当天同时加入(抑蛋白酶肽,亮抑酶肽,胃蛋白酶抑制剂各100 µl; PMSF, Na3VO4, NaF各500 µl),但是PMSF在水溶液中很不稳定,30分钟就会降解一半,所以PMSF应该在使用前现加,其他抑制剂成分可以在水溶液中稳定5天。

各种成分在工作液中的终浓度:

• Tris-HCl: 50 mM, pH 7.4

• NP-40: 1%

• 去氧胆酸钠:0.25%

• NaCl: 150 mM

• EDTA: 1 mM

• PMSF: 1 mM

• 抑蛋白酶肽,亮抑酶肽,胃蛋白酶抑制剂: 各1 µg/ml

• Na3VO4: 1 mM

• NaF: 1 mM

通过免疫共沉淀确定结合蛋白

1.用磷酸盐缓冲液洗30块10 cm培养板上的适宜细胞。刮去每块板上的细胞到1 ml冰冷的EBC裂解缓冲液中。

2.将每毫升细胞悬液转移到微量离心管中,在微量离心机上4℃以最大速度离心15 min。

3.收集上清(约30 ml)并加入30μg的适当抗体,4℃摇动免疫沉淀物1 h。

4.加入0.9 ml的蛋白质A-Sepharose 悬液,4℃摇动免疫沉淀物30 min。

5.用含900 mmol/L NaCl的NETN洗蛋白A-Sepharose混合物,再重复洗5次。最后,用NETN洗一次。

6.吸出混合物的液体部分。加入800μl的1×SDS胶加样缓冲液到球珠中,煮沸4 min。

7.将样品加入到大孔的不连续SDS-PAGE梯度胶中,在10 mA的恒定电流下电泳过夜。

8.通过考马斯蓝染色观察蛋白质泳带。

9.从胶上切下目标带,将其放到微量离心管中,用1ml 50%乙腈洗两次,每次3 min。

10. 用胰蛋白酶消化胶中的蛋白质,再将肽电洗脱。

11. 通过窄孔高效液相色谱分离肽。将收集的肽在ABI 477A或494A机器上进行自动Edman降解测序。

范文四:免疫共沉淀

原理:免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation)是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。 其原理是:当细胞在非变性条件下被裂解时,完整细胞内存在的许多蛋白质-蛋白质间的相互作用被保留了下来。如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X,那么与X在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。目前多用精制的protein A预先结合固化在argarose的beads上,使之与含有抗原的溶液及抗体反应后,beads上的protein A就能吸附抗原达到精制的目的。这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合;也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档。

二、准备工作:

预冷PBS,RIPA Buffer,细胞刮子(用保鲜膜包好后,埋冰下),离心机

1. 用预冷的PBS洗涤细胞两次,最后一次吸干PBS;

2. 加入预冷的200ul RIPA Buffer (10cm培养皿)

3. 用预冷的细胞刮子将细胞从培养皿或培养瓶上刮下,把悬液转到2.0 EP管中,4℃,缓慢晃动15min(EP管插冰上,置水平摇床上)

4. 4℃,14000g离心15min,立即将上清转移到一个新的离心管中

5. 准备Protein A agarose,用PBS 洗两遍珠子,然后用PBS配制成50%浓度,建议减掉枪尖部分,避免在涉及琼脂糖珠的操作中破坏琼脂糖珠

6. 取30μl protein A 琼脂糖珠,用冷PBS洗3 次,每次3,000 rpm离心3 min;

7. 将预处理过的30μl protein A 琼脂糖珠加入到和抗体孵育过夜的细胞裂解液中4°C缓慢摇晃孵育过夜,使抗体与protein A琼脂糖珠偶连;

8. 免疫沉淀反应后,在4°C 以3,000 rpm 速度离心3 min,将琼脂糖珠离心至管底;将上清小心吸去,琼脂糖珠用1ml裂解缓冲液洗3-4次;最后加入的5×上样缓冲液,沸水煮10分钟;

9. Western blotting

实验第一步验证nemo与pidd的相互作用关系:

(1)5个10cm培养皿培养BV-2细胞

(2)每个皿加入200ul的中等强度的RIPA裂解液,裂解细胞

a Input组

b IgG组

c pidd抗体protein A 琼脂糖珠组孵育过夜

加入5×上样缓冲液煮10分钟

a、b、c组孵育nemo抗体,来证明nemo可以拉出pidd

a Input组

b IgG组

c nemo抗体protein A 琼脂糖珠组孵育过夜

加入5×上样缓冲液煮10分钟

a、b、c组孵育pidd抗体,来证明pidd可以拉出nemo

实验第二步分别转染带flag-空载体与flag-pidd-c

flag-空载体按上述提取细胞分两组,分别加入flag抗体与protein A 琼脂糖珠孵育过夜,分别用flag抗体与nemo抗体

flag-pidd-c按上述提取细胞分两组,分别加入flag抗体与protein A 琼脂糖珠孵育过夜,分别加入flag抗体与nemo抗体

实验第三步分别转染带flag-空载体与flag-pidd-cc

flag-空载体按上述提取细胞分两组,分别加入flag抗体与protein A 琼脂糖珠孵育过夜,分别用flag抗体与nemo抗体

flag-pidd-cc按上述提取细胞分两组,分别加入flag抗体与protein A 琼脂糖珠孵育过夜,分别加入flag抗体与nemo抗体

范文五:免疫沉淀IP

免疫沉淀(Immunoprecipitation, IP)原理

IP是利用抗原蛋白质和抗体的特异性结合以及细菌蛋白质的“protein A/G"特异性地结合到抗体(免疫球蛋白)的FC片段的现象开发出来的方法。目前多用protein A/G预先结合在argarose beads上,使之与含有抗原的溶液及抗体反应后,beads上的prorein A/G就能达到吸附抗原的目的。通过低速离心,可以从含有目的抗原的溶液中将目的抗原与其它抗原分离。

免疫沉淀实验的操作步骤比较多,同时由于在非变性条件下进行实验,所以要得到一个完美的实验结果,不仅需要高质量的抗体,同时对免疫沉淀体系也需要有严格的控制指标。免疫沉淀实验从:蛋白样品处理;抗体-agarose beads孵育;抗体-agarose beads复合物洗涤到最后的鉴定,每步都非常关键,需要严格控制实验流程中每个关键步骤的质量,才能最终达到你的实验目的。

IP实验步骤

基本实验步骤

(1)收获细胞,加入适量细胞 (含蛋白酶抑制剂),冰上或者4℃裂解30min, 12,000g离心30 min后取上清;

(2) 取少量裂解液以备Western blot分析,剩余裂解液将1μg相应的抗体和10-50 μl protein A/G-beads加入到细胞裂解液,4°C缓慢摇晃孵育过夜;

(3)免疫沉淀反应后,在4°C 以3,000 g速度离心5 min,将protein A/G-beads离心至管底;将上清小心吸去,protein A/G-beads用1ml裂解缓冲液洗3-4次;最后加入15μl的2×SDS 加样缓冲液,沸水煮10分钟;

(4)SDS-PAGE, Western blotting或进行质谱分析。

一、 样品处理:

免疫沉淀实验成功与否,第一步处理样品非常关键。免疫沉淀实验本质上是处于天然构象状态的抗原和抗体之间的反应,而样品处理的质量决定了抗原抗体反应中的抗原的质量,浓度以及抗原是否处于天然构象状态。所以制备高质量的样品以用于后续的抗体-agarose beads孵育对免疫沉淀实验是否成功非常关键。在这个环节中,除了要控制所有操作尽量在冰上或者4°完成外,最为关键的是裂解液的成份。

用于免疫沉淀实验的样品一般是原代培养细胞裂解液或者细胞系裂解液。我们以常用的RIPA裂解液为例(主要含有pH7.4左右的离子缓冲液,接近生理浓度下的NaCl,一定比例的去垢剂和甘油以及各类蛋白酶抑制剂等)来说明其各主要成份的用途,进而帮助我们如何针对不同的实验目的和不同的蛋白质特性来选择最佳的裂解液。

a缓冲液:离子缓冲液常采用pH7.4的Hepes或者Tris-Cl。

b NaCl浓度一般习惯用150 mM,这主要是因为150 mM接近生理浓度,不会破坏蛋白质之间的相互作用。然而细胞内部的NaCl浓度并不是均一的,局部NaCl的浓度可以低到50 mM,150 mM的NaCl有可能会破坏这个区域的蛋白质相互作用。因此裂解液配方最佳的NaCl浓度要视所分析的蛋白的亚细胞定位而定。

c甘油由于其粘性,可以对蛋白质之间的相互作用起到一个很好的保护作用。一般添加10%的甘油有助于稳定蛋白质之间的相互作用。

d裂解液中的去垢剂可以裂解细胞质膜,也同时破坏了许多细胞器的膜,从而释放了其中储存的许多蛋白酶。而由于用于免疫沉淀实验的去垢剂作用比较温和,因此蛋白酶的活性大部分得以保存。还有一部分蛋白酶来自胞质中,主要由于其抑制蛋白或者其活性抑制环境受到

改变后从而恢复了蛋白酶活性。因此,添加蛋白酶抑制剂对于防止目的蛋白的降解从而完成免疫沉淀实验非常关键。一般主要通过添加EDTA抑制金属蛋白酶,通过Protease Cocktail(多种蛋白酶抑制剂混合物)可以抑制蛋白酶。

e去垢剂对于免疫沉淀实验尤其是免疫共沉淀实验是一个非常关键的因素。不同的去垢剂种类和不同的去垢剂浓度主要通过影响以下三个因素来影响免疫沉淀效果:

细胞质/器膜的通透性:因为许多目的蛋白都定位在细胞器中,所以必须先将这些蛋白释放出来,抗体才能与之反应。

膜蛋白的释放:许多膜蛋白的构象对去垢剂种类和浓度非常敏感,因此针对这类蛋白的免疫沉淀实验,需要谨慎地尝试多种去垢剂以及不同浓度。

蛋白相互作用:不同去垢剂对不同性质的蛋白质的相互作用影响程度不一样,需要根据具体蛋白的特性进行分析选择去垢剂种类和浓度。而由于何种去垢剂适应作用于何种蛋白质现在很难精准预测,所以一个更为切实可行的办法就是通过具体实验筛选合适的去垢剂种类和浓度。

二、抗体-agarose beads孵育

裂解细胞,离心并去除不可溶的膜组份后,上清可以储存在-80°保存3个月,但最好能够使用新鲜制备的细胞裂解液上清去进行抗体-agarose beads孵育实验。抗体可以先加入上清中与样品孵育数小时后再加入Protein A或者G beads孵育过夜,也可以同时加入抗体和Protein A或者G beads孵育过夜。

一般选择1mg总蛋白(1mg/ml)对应添加1 ug抗体,最高可以添加至5 ug抗体,过多的抗体会产生假阳性。这个步骤中关键因素在于选择合适的阴性对照。一般选用加同样量的IgG,但更为妥当的方法是选择针对胞内其它无关目的蛋白的一抗做对照。例如,做膜蛋白A的免疫沉淀,选择膜蛋白B来做阴性对照,只要确认二者之间没有相互作用;而做胞质可溶性蛋白C的免疫沉淀,则选择另外一个可溶性蛋白D来做阴性对照。同时,为避免Protein A或者G beads有(非)特异性吸附从而造成免疫沉淀实验结果的假阳性,一般在加入目的蛋白抗体之前,预先将Protein A或者G beads与细胞裂解液孵育数小时,然后取上清用于后续的抗体-agarose beads孵育。

同时,Protein A或者G beads对不同类型的抗体亲和力不同,结合一抗的种属和Ig亚型,选择合适的Protein A或者G beads也是决定免疫沉淀实验成功与否的一个重要因素。一般推荐使用Protein A和Protein G beads的混合物,这样可以达到最佳实验效果,而且省去了许多选择的烦恼。

三、抗体-agarose beads复合物洗涤:

除了选择特异性好的抗体以及选择合适的阴性对照外,去除免疫沉淀实验非特异性的一个办法是对抗体-agarose beads复合物进行多次洗涤。一般洗涤缓冲液使用和裂解液一样的配方,但去除甘油,以减少由于甘油的粘性带来的非特异性吸附。针对不同的实验要求,还可以通过更改NaCl的浓度以及去垢剂的比例,种类来达到去除非特异性吸附的效果。例如,针对单纯的免疫沉淀而非免疫共沉淀实验或者虽然是进行免疫共沉淀实验,但蛋白质之间的结合比较牢靠,可以考虑使用低浓度(0.2-0.5%)的SDS洗涤抗体-agarose beads复合物,这样可以去除绝大部分非特异性相互作用。

四、 鉴定

免疫沉淀实验用途非常广泛(见IP: Q&A),而且基于最基本的免疫沉淀实验衍生出了许多免疫沉淀相关实验手段(比如免疫共沉淀,染色质免疫沉淀和RNA-蛋白免疫沉淀),因此,免疫沉淀实验的鉴定方法主要视实验目的而定。

我们在本手册中主要简单概述常见的免疫沉淀之后的WB检测需要注意的实验环节。由于免疫沉淀实验使用目的蛋白抗体加Protein A/G beads与样品孵育,因此在最后离心获得抗体-agarose beads复合物后,eppendorf管中主要含有抗体,目的蛋白,Protein A/G beads以及一些其它非特异性作用蛋白。其中,抗体和目的蛋白以及Protein A/G beads三者之间是以非共价健结合在一起,只有Protein A/G与agarose beads是共价结合在一起的。因此,最后经过添加含巯基乙醇的加样缓冲液以及煮沸变性并离心出去Protein A/G beads后,eppendorf管只有抗体和目的蛋白以及少量非特异性吸附蛋白。这样SDS-PAGE中就含有目的蛋白和抗体二种蛋白,由于加样缓冲液中含有巯基乙醇从而导致抗体的重链与轻链之间的二硫键被破坏从而使得抗体分子变成重链分子(55KD)和轻链分子(25KD)。因此,WB显色反应中除了能检测到目的蛋白外,如果所使用的二抗与用于免疫沉淀实验的抗体分子属于同一种属的话,还能检测到重链和轻链分子。通常用于免疫沉淀的抗体量非常大(1ug),所以当目的蛋白的大小接近重链或者轻链分子时,重链或者轻链分子的WB信号常常由于信号过强而导致影响对目的蛋白的WB结果判断。

针对上述情况,通常有二种解决办法:

a. 选择不同种属的抗体分别进行免疫沉淀实验和WB实验,这样再选择一个种属交叉反应比较弱或者无种属交叉反应的二抗进行WB实验,就可以大大减弱重链和轻链分子的WB信号。

b. 使用交联剂将抗体和Protein A/G beads交联,然后通过添加不含巯基乙醇的加样缓冲液处理目的蛋白-抗体-agarose beads复合物,最后离心去除抗体-agarose beads复合物,上清中只留下目的蛋白。

免疫共沉淀

免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation)是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。

其原理是:当细胞在非变性条件下被裂解时,完整细胞内存在的许多蛋白质-蛋白质间的相互作用被保留了下来。如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X,那么与X在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合;也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档。

其优点为:(1)相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的,处于天然状态;(2)蛋白的相互作用是在自然状态下进行的,可以避免人为的影响;(3)可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物。缺点为:(1)可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质-蛋白质相互作用;(2)两种蛋白质的结合可能不是直接结合,而可能有第三者在中间起桥梁作用; (3)必须在实验前预测目的蛋白是什么,以选择最后检测的抗体,所以,若预测不正确,实验就得不到结果,方法本身具有冒险性。

实验流程为:

(1)转染后24-48 h 可收获细胞,加入适量细胞裂解缓冲液(含蛋白酶抑制剂),冰上裂解30min, 细胞裂解液于4°C, 最大转速离心30 min后取上清;

(2)取少量裂解液以备Western blot分析,剩余裂解液加1μg相应的抗体加入到细胞裂

解液,4°C缓慢摇晃孵育过夜;

(3)取10μl protein A 琼脂糖珠,用适量裂解缓冲液洗3 次,每次3,000 rpm离心3 min;

(4)将预处理过的10μl protein A 琼脂糖珠加入到和抗体孵育过夜的细胞裂解液中4°C缓慢摇晃孵育2-4h,使抗体与protein A琼脂糖珠偶连;

(5)免疫沉淀反应后,在4°C 以3,000 rpm 速度离心3 min,将琼脂糖珠离心至管底;将上清小心吸去,琼脂糖珠用1ml裂解缓冲液洗3-4次;最后加入15μl的2×SDS 上样缓冲液,沸水煮5分钟;

(6)SDS-PAGE, Western blotting或质谱仪分析。

注意的问题:

(1)细胞裂解采用温和的裂解条件,不能破坏细胞内存在的所有蛋白质-蛋白质相互作用,多采用非离子变性剂(NP40或Triton X-100)。每种细胞的裂解条件是不一样的,通过经验确定。不能用高浓度的变性剂(0.2%SDS),细胞裂解液中要加各种酶抑制剂,如商品化的cocktailer。

(2)使用明确的抗体,可以将几种抗体共同使用

(3)使用对照抗体:

单克隆抗体:正常小鼠的IgG或另一类单抗

兔多克隆抗体:正常兔IgG

在免疫共沉淀实验中要保证实验结果的真实性,应注意以下几点:

(1) 确保共沉淀的蛋白是由所加入的抗体沉淀得到的,而并非外源非特异蛋白,单克隆抗体的使用有助于避免污染的发生;

(2) 要确保抗体的特异性,即在不表达抗原的细胞溶解物中添加抗体后不会引起共沉淀;

(3) 确定蛋白间的相互作用是发生在细胞中,而不是由于细胞的溶解才发生的,这需要进行蛋白质的定位来确定。

范文六:不同反应条件对免疫沉淀分离膜蛋白的影响

【中图分类号】R684【文献标识码】A【文章编号】1672-3783(2011)08-0306-01

【摘要】目的:探讨不同条件对免疫沉淀方法分离纯化膜蛋白时的影响。方法:分别应用磷酸盐缓冲液(PBS)和溶膜缓冲液(含去垢剂)作为反应系统,单克隆抗体PD4与胃癌细胞系MGC803细胞膜溶液进行免疫沉淀反应以获得PD4相关抗原,用Western blot检测膜蛋白的得量。结果:分离纯化PD4相关抗原时,用CNBr-Sepharose 4B-PD4进行免疫沉淀效果优于Protein A Sepharose 4B;溶膜缓冲液作为反应系统效果优于磷酸盐缓冲液。结论:免疫沉淀纯化膜蛋白时,应用抗体直接交联于Sepharose 4B和溶膜缓冲液作为反应系统效果更佳。

【关键词】免疫沉淀 去垢剂 蛋白质

Effect of different reactive condition on purification of membrane protein with immunoprecipitation

【Abstract】aim, To explore the effect of different condition on isolation and purification of membrane protein using immunoprecipitation. Method, monoclonal antibody PD4 immunoprecipitated PD4 associated antigen from detergent lysates of cell membrane of gastric cancer cell line MGC803 in phosphate buffered saline(PBS)or lysis buffer. Quantity of protein was measured with Western blot. Results, during isolation and purification of PD4 antigen, CNBr-Sepharose 4B-PD4 immunoprecipitated better than Protein A Sepharose 4B, lysis buffer was as reactive system better than phosphate buffered saline(PBS). Conclution, it was better that antibody-conjugeted Sepharose 4B and lysis buffer were as reactive systerm using immunoprecipitation for isolation and purification of PD4 antigen.

单克隆抗体PD4是用胃癌细胞系MGC803免疫BALB/c小鼠,经筛选而得到的。前期工作表明,此抗体诱导MGC803细胞凋亡,明显抑制转化细胞Rat3-3在体外的增殖及在软琼脂中的集落形成能力,并能使该转化细胞在裸鼠中的致瘤能力丧失,其相关抗原在ras转化细胞表面呈高表达(1,2,3)。这些结果提示,单克隆抗体PD4相关抗原与肿瘤密切相关。因此,克隆单克隆抗体PD4相关抗原的基因,了解其结构及功能,将有助于我们认识肿瘤的发生、发展及转归规律。

抗体相关抗原的分子克隆,常用两种方法,一是用抗体直接筛选cDNA表达(或DNA)文库,以获得基因片段,二是纯化单克隆抗体相关抗原蛋白多肽,进行测序,根据氨基酸序列,合成兼并引物,通过PCR扩增获得基因片段,然后通过染色体步移或者RACE-PCR得到全长基因(4,5,6,7,8)。免疫学方法是分离纯化蛋白最常用,同时也是最为有效的方法。我们应用不同的反应体系,探讨用免疫沉淀方法分离纯化膜蛋白的优化方案,为得到可测序的膜蛋白,进一步得到全长基因奠定基础。�

1 材料与方法�

一 细胞膜溶液的制备

收取2×108细胞,PBS洗3次,加入PMSF,使其终浓度为100μg/mL,液氮和37℃反复冻融4-5次以破碎细胞,4000rpm离心15分钟,收集上清,于100000g4℃离心1小时,去上清,向沉淀加1-2mL溶膜缓冲液(20mmol/L Tris,0.15mol/L NaCl, 2mmol/L EDTA,1% NP-40, 0.5%脱氧胆酸钠, pH7.5, 终浓度为100μg/mL的PMSF和2μg/mL的Aprotinin用时现加)悬浮细胞膜碎片, 4℃摇动30分钟,4℃10000g离心1小时,上清为细胞膜溶液,分装,-80℃保存备用。�

二 ELISA

消化收集培养细胞加入96孔培养板,培养24小时至细胞在孔底长为一层,用4℃预冷的0.25%戊二醛固定15分钟,含0.05%Tween-20的PBS洗涤细胞,每孔用200μL1%牛血清白蛋白封闭,4℃过夜。弃封闭液,含0.05%Tween-20的PBS洗涤3次,加1%BSA适当稀释的单克隆抗体PD4,室温放置2小时,弃上清,含0.05%Tween-20的PBS洗涤3次,加1%BSA适当稀释的二抗,室温放置1小时,弃上清,含0.05%Tween-20的PBS洗涤3次,加底物200μL/孔(17mg邻苯二胺,25μLH2O2,50mLPBS),反应10-15分钟,加12.5%H2SO450μL/孔终止反应,置酶标仪,波长492nm读数。�

三 PD4与CNBr-Sepharose 4B交联

取适量PD4抗体对0.1mol/L碳酸缓冲液(含0.5mol/LNaCl pH8.9)透析过夜;1gCNBr-Sepharose 4B用1mmol/lHCl浸泡,4℃过夜。用1mmol/lHCl流洗CNBr-Sepharose 4B,再用0.1mol/L碳酸缓冲液流洗,将CNBr-Sepharose 4B刮入PD4(OD280nm=1.326)6ml中,4℃摇动过夜,1000rpm离心10分钟,取上清测OD280nm(0.175),计算交联率(87%),向沉淀中加入11mL1mol/L乙醇胺(含0.5mol/LNaCl pH9.0),室温混合2小时,1000rpm离心10分钟,弃上清,加10mL0.1mol/L醋酸缓冲液(含0.5mol/LNaCl pH4.0)洗涤抽滤,加10mL碳酸缓冲液洗涤抽滤,然后用PBS洗涤,1000rpm离心10分钟,弃上清,加10mL0.1mol/L甘氨酸缓冲液(pH2.8),室温摇动20分钟,1000rpm离心10分钟,弃上清,PBS洗涤致pH为中性,加0.1%NaN3,4℃保存。�

四 Western blot

取待测样品进行SDS-PAGE分析(7),电泳完毕,恒压100mV电转1.5小时,将蛋白转移至膜上(电转移缓冲液:10mmol/L Tris, 15mmol/L 甘氨酸, 10% 甲醇)。电转完毕,用0.5%丽春红染色,蒸馏水脱色至蛋白带清晰可见,做好标记,继续脱色至蛋白条带消失,用5%的脱脂奶粉/TBS(TBS缓冲液配制,20mmol/L Tris,0.8% NaCl,pH7.4)室温封闭2-3小时,0.05% Tween-20/TBS洗膜,加用5%的脱脂奶粉/TBS适当稀释的一抗4℃过夜,0.05% Tween-20/TBS洗膜,加用5%的脱脂奶粉/TBS适当稀释的辣根过氧化物酶标记的二抗,室温孵育1-2小时,0.05% Tween-20/TBS洗膜,加0.05% DAB(10mmol/L Tris-HCl,pH7.6配制,含0.1% H2O2)显色,待显色清楚时,用去离子水漂洗以终止反应(8)。�

五 免疫沉淀

取5μLProtein A Sepharose 4B,用400μLPBS(或溶膜缓冲液)悬浮,4℃摇动10分钟,12000rpm离心5秒,弃上清,重复3次,加入1.3mg/mL的PD410μL,PBS(或溶膜缓冲液)稀释至100μL,4℃摇动3小时,12000rpm离心5秒,弃上清,200μLPBS(或溶膜缓冲液)悬浮,4℃摇动10分钟,12000rpm离心5秒,弃上清,重复3次。取10μLSepharose 4B-PD4,PBS(或溶膜缓冲液)洗涤3次,加MGC803细胞膜溶液10μL,用PBS(或溶膜缓冲液)稀释至100μL,4℃摇动过夜,12000rpm离心5秒,弃上清,用PBS(或溶膜缓冲液)400μL悬浮沉淀,4℃摇动10分钟,12000rpm离心5秒,弃上清,重复3次,加1XSDS-PAGE加样缓冲液20μL,100℃5分钟,12000rpm离心5分钟,取上清电泳。�

六 结果

单克隆抗体PD4相关抗原表达于胃癌细胞系MGC803和膀胱癌细胞系EJ单克隆抗体PD4与胃癌细胞系MGC803和膀胱癌细胞系EJ呈阳性反应,说明单克隆抗体PD4相关抗原不但表达于MGC803细胞,同时也表达于EJ细胞(表1)。进一步分离细胞膜,溶解后行Western blot检测,PD4与MGC803和EJ细胞膜溶液呈阳性反应,说明PD4相关抗原相关抗原具有较广泛的肿瘤特异性。并且此反应条带分子量为40kD,即单克隆抗体PD4相关抗原的分子量为40kD(图1)。�

1:marks;2:MGC803细胞膜溶液与PD4反应;3:EJ细胞膜溶液与PD4反应;4:MGC803细胞膜溶液与正鼠血清反应;5:EJ细胞膜溶液与正鼠血清反应用Protein A Sepharose 4B对MGC803细胞膜溶液进行免疫沉淀取2等份Protein A Sepharose 4B分别与等量的PD4反应后,再与10μLmgc803细胞膜溶液反应,其中一份用PBS稀释,另一份用溶膜缓冲液稀释,反应完毕,将所得物进行SDS-PAGE电泳(分离胶10%),然后用Western blot检测。用溶膜缓冲液稀释组免疫沉淀反应条带明显多于用PBS稀释组(图2)。

用Sepharose 4B-PD4对MGC803细胞膜溶液进行免疫沉淀

取2等份Sepharose 4B-PD4与10μLMGC803细胞膜溶液反应,其中一份用PBS稀释,另一份用溶膜缓冲液稀释,反应完毕,将所得物进行SDS-PAGE电泳(分离胶10%),然后用Western blot检测。用溶膜缓冲液稀释组免疫沉淀反应条带明显多于用PBS稀释组(图2)。

图2 两种不同免疫沉淀方法分离纯化PD4相关抗原�

1:MGC803细胞膜溶液与PD4反应;2、4:用细胞膜溶解缓冲液进行免疫沉淀;

3、5:用PBS进行免疫沉淀;2、3:用Protein A Sepharose 4B进行免疫沉淀;

4、5:用CNSr Sepharose 4B-PD4进行免疫沉淀�

讨论

蛋白质的分离纯化,首先要确定目的蛋白存在于何种组织,及亚细胞结构的定位情况,然后建立有效的检测方法。ELISA检测结果表明,单克隆抗体PD4相关抗原存在于胃癌细胞系MGC803和膀胱癌细胞系EJ。分离细胞膜,Western Blot证明该蛋白存在于肿瘤细胞膜,分子量为40kDa(p40)。因此,将MGC803细胞膜溶液作为样品,进行p40蛋白的分离纯化。

免疫沉淀和免疫亲和层析是蛋白分离纯化最常用、也是最有效的方法(4,5)。在进行免疫反应过程中,反应体系的选择,对实验结果有较大影响。用PBS稀释的反应体系所得蛋白量明显低于用溶膜缓冲液作为稀释的反应体系。这与膜蛋白的疏水性相关。在PBS稀释的反应体系中,蛋白的疏水域倾向形成蛋白的核心,或是蛋白分子间疏水域相互作用,形成疏水核心,而外周则是亲水残基占据优势,这样,膜蛋白更易于以多聚体形式存在,这种存在方式影响抗原抗体的反应。膜蛋白在在去垢剂的存在下,具有更好的溶解性,这种溶解状态,有利于抗原抗体反应,因此,在免疫沉淀中能得到更多的蛋白质。

单克隆抗体PD4相关抗原p40的多肽链分子量为40kD,与PD4重链分子量较接近。在用protein A-Sepharose 4B进行免疫沉淀时,欲得到足够进行氨基酸测序用的p40,PD4的用量就要相应加大,其重链含量就大,免疫沉淀后。电转移至PVDF膜上的p40和重链将会有部分重叠,要切下p40进行氨基酸测序,将是困难的。为了解决这个问题,将PD4与CNBr-Sephrose 4B交联(交联率为87%),然后进行免疫沉淀,以便得到了足够进行氨基酸测序的蛋白质。

参考文献�

[1] 董志伟,万文徽,李振甫,邱万荣,魏淑敏. 抗胃癌细胞系单克隆抗体PD4的初步研究'. 生物化学杂志,1985,1:52-58�

[2] 肖海,寿成超,董志伟 单克隆抗体PD4诱导人胃癌细胞系MGC-803的凋亡。中华肿瘤杂志,1998,20(1):31-33�

[3] 殷卫宁,董志伟,邓国仁单克隆抗体PD4对Ha―ras转化细胞Rat3―3抑制效应的研究。中华肿瘤杂志,1991,13(2):82-86�

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作者单位:150000 哈尔滨医科大学

范文七:不同反应条件对免疫沉淀分离膜蛋白影响论文

不同反应条件对免疫沉淀分离膜蛋白的影响

【中图分类号】r684【文献标识码】a【文章编号】1672-

3783(2011)08-0306-01

【摘要】目的:探讨不同条件对免疫沉淀方法分离纯化膜蛋白时的影响。方法:分别应用磷酸盐缓冲液(pbs)和溶膜缓冲液(含去垢剂)作为反应系统,单克隆抗体pd4与胃癌细胞系mgc803细胞膜溶液进行免疫沉淀反应以获得pd4相关抗原,用western blot检测膜蛋白的得量。结果:分离纯化pd4相关抗原时,用

cnbr-sepharose 4b-pd4进行免疫沉淀效果优于protein a

sepharose 4b;溶膜缓冲液作为反应系统效果优于磷酸盐缓冲液。结论:免疫沉淀纯化膜蛋白时,应用抗体直接交联于sepharose 4b和溶膜缓冲液作为反应系统效果更佳。

【关键词】免疫沉淀 去垢剂 蛋白质

effect of different reactive condition on purification of membrane protein with immunoprecipitation

【abstract】aim, to explore the effect of different condition on isolation and purification of membrane protein using immunoprecipitation. method, monoclonal antibody pd4

immunoprecipitated pd4 associated antigen from detergent lysates of cell membrane of gastric cancer cell line mgc803 in phosphate buffered saline(pbs)or lysis buffer. quantity of protein was measured with western blot. results, during

范文八:免疫沉淀原理

免疫沉淀(Immunoprecipitation, IP)原理

IP是利用抗原蛋白质和抗体的特异性结合以及细菌蛋白质的“protein A/G

免疫沉淀实验的操作步骤比较多,同时由于在非变性条件下进行实验,所以要得到一个完美的实验结果,不仅需要高质量的抗体,同时对免疫沉淀体系也需要有严格的控制指标。免疫沉淀实验从:蛋白样品处理;抗体-agarose beads孵育;抗体-agarose beads复合物洗涤到最后的鉴定,每步都非常关键,需要严格控制实验流程中每个关键步骤的质量,才能最终达到你的实验目的。

IP实验步骤

基本实验步骤

(1)收获细胞,加入适量细胞IP裂解缓冲液(含蛋白酶抑制剂),冰上或者4℃裂解30min, 12,000g离心30 min后取上清;

(2) 取少量裂解液以备Western blot分析,剩余裂解液将1μg相应的抗体和10-50 μl protein A/G-beads加入到细胞裂解液,4°C缓慢摇晃孵育过夜;

(3)免疫沉淀反应后,在4°C 以3,000 g速度离心5 min,将protein A/G-beads离心至管底;将上清小心吸去,protein A/G-beads用1ml裂解缓冲液洗3-4次;最后加入15μl的2×SDS 加样缓冲液,沸水煮10分钟;

(4)SDS-PAGE, Western blotting或进行质谱分析。一、 样品处理:

免疫沉淀实验成功与否,第一步处理样品非常关键。免疫沉淀实验本质上是处于天然构象状态的抗原和抗体之间的反应,而样品处理的质量决定了抗原抗体反应中的抗原的质量,浓度以及抗原是否处于天然构象状态。所以制备高质量的样品以用于后续的抗体-agarose beads孵育对免疫沉淀实验是否成功非常关键。在这个环节中,除了要控制所有操作尽量在冰上或者4°完成外,最为关键的是裂解液的成份。

用于免疫沉淀实验的样品一般是原代培养细胞裂解液或者细胞系裂解液。我们以常用的RIPA裂解液为例(主要含有pH7.4左右的离子缓冲液,接近生理浓度下的NaCl,一定比例的去垢剂和甘油以及各类蛋白酶抑制剂等)来说明其各主要成份的用途,进而帮助我们如何针对不同的实验目的和不同的蛋白质特性来选择最佳的裂解液。

a. 缓冲液:离子缓冲液常采用pH7.4的Hepes或者Tris-Cl。

b. NaCl浓度一般习惯用150 mM,这主要是因为150 mM接近生理浓度,不会破坏蛋白质之间的相互作用。然而细胞内部的NaCl浓度并不是均一的,局部NaCl的浓度可以低到50 mM,150 mM的NaCl有可能会破坏这个区域的蛋白质相互作用。因此裂解液配方最佳的NaCl浓度要视所分析的蛋白的亚细胞定位而定。

c. 甘油由于其粘性,可以对蛋白质之间的相互作用起到一个很好的保护作用。一般添加10%的甘油有助于稳定蛋白质之间的相互作用。

d. 裂解液中的去垢剂可以裂解细胞质膜,也同时破坏了许多细胞器的膜,从而释放了其中储存的许多蛋白酶。而由于用于免疫沉淀实验的去垢剂作用比较温和,因此蛋白酶的活性大部分得以保存。还有一部分蛋白酶来自胞质中,主要由于其抑制蛋白或者其活性抑制环境受到改变后从而恢复了蛋白酶活性。因此,添加蛋白酶抑制剂对于防止目的蛋白的降解从而完成免疫沉淀实验非常关键。一般主要通过添加EDTA抑制金属蛋白酶,通过Protease Cocktail(多种蛋白酶抑制剂混合物)可以抑制蛋白酶。

e. 去垢剂对于免疫沉淀实验尤其是免疫共沉淀实验是一个非常关键的因素。不同的去垢剂种类和不同的去垢剂浓度主要通过影响以下三个因素来影响免疫沉淀效果:

- 细胞质/器膜的通透性:因为许多目的蛋白都定位在细胞器中,所以必须先将这些蛋白释放出来,抗体才能与之反应。

- 膜蛋白的释放:许多膜蛋白的构象对去垢剂种类和浓度非常敏感,因此针对这类蛋白的免疫沉淀实验,需要谨慎地尝试多种去垢剂以及不同浓度。

- 蛋白相互作用:不同去垢剂对不同性质的蛋白质的相互作用影响程度不一样,需要根据具体蛋白的特性进行分析选择去垢剂种类和浓度。而由于何种去垢剂适应作用于何种蛋白质现在很难精准预测,所以一个更为切实可行的办法就是通过具体实验筛选合适的去垢剂种类和浓度。

二、 抗体-agarose beads孵育

裂解细胞,离心并去除不可溶的膜组份后,上清可以储存在-80°保存3个月,但最好能够使用新鲜制备的细胞裂解液上清去进行抗体-agarose beads孵育实验。抗体可以先加入上清中与样品孵育数小时后再加入Protein A或者G beads孵育过夜,也可以同时加入抗体和Protein A或者G beads孵育过夜。一般选择1mg总蛋白(1mg/ml)对应添加1 ug抗体,最高可以添加至5 ug抗体,过多的抗体会产生假阳性。这个步骤中关键因素在于选择合适的阴性对照。一般选用加同样量的IgG,但更为妥当的方法是选择针对胞内其它无关目的蛋白的一抗做对照。例如,做膜蛋白A的免疫沉淀,选择膜蛋白B来做阴性对照,只要确认二者之间没有相互作用;而做胞质可溶性蛋白C的免疫沉淀,则选择另外一个可溶性蛋白D来做阴性对照。同时,为避免Protein A或者G beads有(非)特异性吸附从而造成免疫沉淀实验结果的假阳性,一般在加入目的蛋白抗体之前,预先将Protein A或者G beads与细胞裂解液孵育数小时,然后取上清用于后续的抗体-agarose beads孵育。

同时,Protein A或者G beads对不同类型的抗体亲和力不同,结合一抗的种属和Ig亚型,选择合适的Protein A或者G beads也是决定免疫沉淀实验成功与否的一个重要因素。一般推荐使用Protein A和Protein G beads的混合物,这样可以达到最佳实验效果,而且省去了许多选择

的烦恼。三、 抗体-agarose beads复合物洗涤:

除了选择特异性好的抗体以及选择合适的阴性对照外,去除免疫沉淀实验非特异性的一个办法是对抗体-agarose beads复合物进行多次洗涤。一般洗涤缓冲液使用和裂解液一样的配方,但去除甘油,以减少由于甘油的粘性带来的非特异性吸附。针对不同的实验要求,还可以通过更改NaCl的浓度以及去垢剂的比例,种类来达到去除非特异性吸附的效果。例如,针对单纯的免疫沉淀而非免疫共沉淀实验或者虽然是进行免疫共沉淀实验,但蛋白质之间的结合比较牢靠,可以考虑使用低浓度(0.2-0.5%)的SDS洗涤抗体-agarose beads复合物,这样可以去除绝大部分非特异性相互作用。四、 鉴定

免疫沉淀实验用途非常广泛(见IP: Q&A),而且基于最基本的免疫沉淀实验衍生出了许多免疫沉淀相关实验手段(比如免疫共沉淀,染色质免疫沉淀和RNA-蛋白免疫沉淀),因此,免疫沉淀实验的鉴定方法主要视实验目的而定。

我们在本手册中主要简单概述常见的免疫沉淀之后的WB检测需要注意的实验环节。由于免疫沉淀实验使用目的蛋白抗体加Protein A/G beads与样品孵育,因此在最后离心获得抗体-agarose beads复合物后,eppendorf管中主要含有抗体,目的蛋白,Protein A/G beads以及一些其它非特异性作用蛋白。其中,抗体和目的蛋白以及Protein A/G beads三者之间是以非共价健结合在一起,只有Protein A/G与agarose beads是共价结合在一起的。因此,最后经过添加含巯基乙醇的加样缓冲液以及煮沸变性并离心出去Protein A/G beads后,eppendorf管只有抗体和目的蛋白以及少量非特异性吸附蛋白。这样SDS-PAGE中就含有目的蛋白和抗体二种蛋白,由于加样缓冲液中含有巯基乙醇从而导致抗体的重链与轻链之间的二硫键被破坏从而使得抗体分子变成重链分子(55KD)和轻链分子(25KD)。因此,WB显色反应中除了能检测到目的蛋白外,如果所使用的二抗与用于免疫沉淀实验的抗体分子属于同一种属的话,还能检测到重链和轻链分子。通常用于免疫沉淀的抗体量非常大(1ug),所以当目的蛋白的大小接近重链或者轻链分子时,重链或者轻链分子的WB信号常常由于信号过强而导致影响对目的蛋白的WB结果判断。 针对上述情况,通常有二种解决办法:

a. 选择不同种属的抗体分别进行免疫沉淀实验和WB实验,这样再选择一个种属交叉反应比较弱或者无种属交叉反应的二抗进行WB实验,就可以大大减弱重链和轻链分子的WB信号。

b. 使用交联剂将抗体和Protein A/G beads交联,然后通过添加不含巯基乙醇的加样缓冲液处理目的蛋白-抗体-agarose beads复合物,最后离心去除抗体-agarose beads复合物,上清中只留下目的蛋白。

北京冬歌生物科技 www.dg-reagent.com

范文九:免疫共沉淀Immunoprecipitationprotocol

Immunoprecipitation protocol

General IP procedure including a list of reagents and a table to help you choose the correct protein beads

Immunoprecipitation is a method that enables the purification of a protein. An antibody for the protein of interest is incubated with a cell extract enabling the antibody to bind to the protein in solution. The antibody/antigen complex will then be pulled out of the sample using protein A/G-coupled agarose beads. This physically isolates the protein of interest from the rest of the sample. The sample can then be separated by SDS-PAGE for western blot analysis.

1. Lysis buffers and other reagents

2. Preparation of lysates

3. Preclearing the lysates

4. Immunoprecipitation

5. Wash

6. Elution

7. Choosing the correct beads - summary table

8. References

1. a. Lysis buffers

The ideal lysis buffer will leave proteins in their native conformation, minimizing denaturation of antibody binding sites while at the same time releasing adequate amounts of protein from the sample for subsequent analysis. Non-ionic detergents such as NP-40 and Triton X-100 are less harsh than ionic detergents such as SDS and sodium deoxycholate. Other variables that can affect the success of IP include salt concentration, divalent cation concentration, and pH. Therefore to optimize these variables

they should be tested within the following ranges (From Harlow and Lane, page 231; see References): Salts: 0-1 M

Detergent, non-ionic: 0.1-2%

Detergent, ionic: 0.01-0.5%

Divalent cations: 0-10 mM

EDTA: 0-5 mM

pH: 6 - 9

1. Non-denaturing lysis buffer

Use for antigens that are detergent soluble and can be recognised in native form by the antibody. Triton X-100 can be substituted for NP-40.

20 mM Tris HCl pH 8

137 mM NaCl

1% Nonidet P-40 (NP-40)

2 mM EDTA

Store up to 6 months at 4°C. Immediately before use add protease inhibitors

2. RIPA (RadioImmunoPrecipitation Assay) buffer

More denaturing than NP-40 or Triton X-100 lysis buffer, RIPA buffer contains the ionic detergents SDS and sodium deoxycholate as active constituents and is particularly useful for nuclear membrane disruption for nuclear extracts. RIPA buffer gives low background but can denature kinases.

50 mM Tris HCl pH 8

150 mM NaCl

1% NP-40

0.5% sodium deoxycholate

0.1% SDS

Store up to 6 months at 4°C. Immediately before use add protease inhibitors.

For convenience, a 10% sodium deoxycholate stock solution (5 g into 50 ml) may be prepared. It must be protected from light.

3. Detergent-free soluble protein lysis buffer

Some soluble proteins may not require use of detergents. Use this buffer with mechanical breakage of cells, e.g. repeated passage through a syringe or homogenization with a Dounce homogenizer. PBS containing:

5 mM EDTA

0.02 % Sodium Azide

Store up to 6 months at 4°C. Immediately before use add protease inhibitors

4. Denaturing lysis buffer/buffer for non-detergent soluble antigens:

Epitopes of native proteins are not accessible to antibodies that only recognise denatured proteins. When harvesting and lysing the cells, heat the cells in denaturing lysis buffer. This method can also be used for antigens that cannot be extracted from the cell with non-ionic detergents. Use of DNase1 will aid extraction of proteins from chromatin.

1% SDS

5 mM EDTA

Store up to 1 week at room temperature

Immediately before use add:

10 mM dithiothreitol or beta-mercaptoethanol

Protease inhibitors

15 U/ml DNase1

5. Wash buffers

10mM Tris; adjust to pH 7.4

1mM EDTA

1mM EGTA; pH 8.0

150mM NaCl

1% Triton X-100

0.2mM sodium ortho-vanadate

Protease inhibitor cocktail

Store up to 6 months at 4°C. Immediately before use add protease inhibitors

1. b. Other reagents

Protease inhibitors

As soon as lysis occurs, proteolysis, dephosphorylation and denaturation begin. These events can be slowed down tremendously if samples are kept on ice or at 4°C at all times and appropriate inhibitors are added fresh to the lysis buffer. Mixtures (“cocktails”) of protease and phosphatase inhibitors are

commercially available. If not using a cocktail, two of the most commonly used protease inhibitors for IP are PMSF (50 μg/ml) and aprotinin (1 μg/ml). For more details of protease and phosphatase inhibitors, please see our western blot guide.

Other reagents required:

Sterile PBS pH 7.4

Sterile PBS-BSA 1% w/v (filtered)

TBST buffer

Loading/sample buffer for western blotting

100 mM EDTA stock solution is made with 1.86 g EDTA dissolved into 40 ml H2O. Add NaOH to adjust the pH to 7.4. Finally, adjust the total volume to 50 ml.

2. Preparation of lysates

2.1. Lysates from cell culture

2.1.a. Non denaturing:

1. Place the cell culture dish on ice and wash the cells with ice cold PBS.

2. Drain the PBS, then add ice cold lysis buffer (1 ml per 107 cells/100 mm2 dish/150 cm2 flask;

0.5 ml per 5x106cells/60 mm2 dish or 75cm2 flask).

3. Scrape adherent cells off the dish using a cold plastic cell scraper then gently transfer the cell

suspension into a pre-cooled micro centrifuge tube.

4. Maintain constant agitation for 30 min at 4°C.

5. Centrifuge in a micro centrifuge at 4°C.

You may need to vary the centrifugation force and time depending on the cell type. A guideline is 20 min at 12,000 rpm but this must be determined by the end user (e.g. leukocytes need a

very light centrifugation).

6. Gently remove the tubes from the centrifuge and place on ice. Aspirate the supernatant and

place in a fresh tube kept on ice, and discard the pellet.

2.1.b. Denaturing:

1. Add 100 μl denaturing lysis buffer to 0.5 to 2 x 107 cells.

2. Mix well by vortexing vigorously for 2 to 3 sec at maximum speed. Transfer the cell suspension to a micro centrifuge tube.

The solution can be viscous at this stage due to release of DNA.

3. Heat samples to 95°C for 5 min to denature.

4. Dilute the suspension with 0.9 ml non denaturing lysis buffer. Mix gently. (The excess 1% Triton X-100 in the non denaturing lysis buffer quenches the SDS in the original denaturing buffer).

5. Fragment the DNA by passing the lysed suspension 5 to 10 times through a needle attached to a 1 ml

syringe.

Repeat mechanical disruption until the viscosity is reduced to manageable levels.

If the DNA is not fully digested and fragmented, it can interfere with the separation

of the pellet and supernatant following centrifugation.

6. Incubate on ice for 5 min.

7. Proceed with the immunoprecipitation

2. 2 Lysates from tissue

1. Dissect the tissue of interest with clean tools, on ice preferably, and as quickly as possible to prevent degradation by proteases.

2. Place the tissue in round bottom micro centrifuge tubes and immerse in liquid nitrogen to “snap freeze”. Store samples at -80°C for later use or keep on ice for immediate homogenization.

3. For a ~5 mg piece of tissue, add ~300 μl lysis buffer rapidly to the tube and homogenize with an electric homogenizer.

4. Rinse the blade twice with another 300 μl lysis buffer per rinse and then maintain constant agitation for

2 hr at 4°C (e.g. place on an orbital shaker in the refrigerator).

Volumes of lysis buffer must be determined in relation to the amount of tissue present. Protein extract should not be too dilute in order to avoid loss of protein and to minimize the volume of samples to be

loaded onto gels. The minimum concentration is 0.1 mg/ml; optimal concentration is 1-5 mg/ml.

Note: If denatured samples are required, use denaturing lysis buffer and perform

steps 2 to 5 from the denaturing protocol above.

5. Centrifuge for 20 min at 12,000 rpm at 4°C in a micro centrifuge. Gently remove the tubes from the centrifuge and place on ice, aspirate the supernatant and place in a fresh tube kept on ice. Discard the pellet.

3. Pre-clearing the lysates

Pre-clearing the lysate can help reduce non specific binding of proteins to agarose or Sepharose beads. Pre-clearing with an irrelevant antibody or serum will remove proteins that bind immunoglobulins

non-specifically. The end result will have a lower level of background and an improved signal to noise ratio. However, if the final detection of the protein is by western blotting, pre-clearing may not be necessary, unless a contaminating protein is interfering with visualization of the protein of interest.

1. Add either 50 μl of irrelevant antibody of the same species and isotype as the IP antibody or

normal serum (rabbit is preferred by some researchers, see Harlow and Lane, page 243) to 1 ml of lysate. Incubate for 1 hr on ice.

2. Add 100 μl of bead slurry to the lysate.

3. Incubate for 10 to 30 min at 4°C with gentle agitation.

4. Spin in micro centrifuge at 14,000 x g at 4°C for 10 min.

5. Discard bead pellet and keep supernatant for immunoprecipitation.

To increase the yield, the beads can be washed 1 or 2 more times in lysis buffer, and the supernatants

collected together.

It is important to make sure that as much of the normal serum is removed as possible as this will compete with the specific antibody against the antigen of interest. To check for this, a test can be done with lysis buffer instead of sample, performing all pre-clearing steps as above. A coomassie stain of a gel in which the resulting supernatant is run will reveal if the serum Ig is being removed effectively. If serum has not been sufficiently removed, bands will be present at 50 and 25 kDa for heavy and light chains; its

presence may contribute to a weak IP. Consider either decreasing the amount of serum or increasing the amount of beads incubated with your samples in the pre-clearing

step.

4. Immunoprecipitation

Immunoprecipitation can be performed using antibodies by different methods. The use of these methods is based on the requirements of end users. The first approach (4.2 Method A) is to mix antibody with protein sample and allowing it to interact with protein followed by addition of Protein A/G support. This method yields high purity of protein however the antibodies are also co-eluted with protein of interest which sometime creates difficulties in western blot detection. The second approach (4.2 Method B) is to bind antibody to the Protein A/G beads and then mix with the antigen. This method gives lesser yield than first one and avoids the problem of co-elution of antibodies. The third approach is to mix antibody, antigen and beads together; this method gives lowest yield and purity.

4.1 Method A

Immunoprecipitation with antibodies in solution

1. On ice, in a micro centrifuge tube add 10-50 μg cell lysate plus the recommended amount of antibody (see below). These amounts will be chosen depending on the abundance of the protein and the affinity of the antibody for the protein. Typically in a pilot experiment a fixed amount of protein is precipitated by increasing amounts of antibody.

Check the antibody datasheet for recommended antibody concentration. As a guideline use:

1-5 μl polyclonal antiserum

1 μg affinity purified polyclonal antibody

0.2-1 μl ascites fluid (monoclonal antibody)

20-100 μl culture supernatant (monoclonal antibody)

2. Incubate the sample with the antibody between 1-12 hr (overnight) at 4°C, preferably under gentle agitation or rotation. The length of the incubation period depends on the amount of protein and affinity properties of the antibody.

3. Meanwhile prepare the Sepharose beads. If using a monoclonal antibody choose protein G-coupled Sepharose beads. If using a polyclonal antibody, protein A-coupled Sepharose beads are usually suitable (please refer to „Choosing the protein beads‟ table below).

If the beads come as a powder, incubate 100 mg of beads in 1 ml 0.1 M PBS, wash for 1 hr so they swell up, then centrifuge, remove the supernatant and discard. Add 1 ml PBS 0.1% BSA, mix for 1 hr using eppendorf rotator and rinse in PBS 2 X. Remove the supernatant and add 400 μl of buffer made with protease inhibitors (can be the same as the lysis buffer). The slurry is now ready for use. It can be stored at 4°C for a few days; for longer periods keep the beads in PBS with 0.02% azide (rinse the beads

extensively on the day of use and make up in fresh lysis buffer). You can also buy pre-swollen beads as

slurry ready for use.

It is advisable to use pipette tips with the end cut off to prevent damage to the

beads.

IgM antibody: Do not use protein-A or protein-G conjugated beads. Use anti IgM

coupled protein A or Protein G beads. The IgM will then bind to the beads by

binding to the anti-IgM antibody.

Click here to view the procedure using IgM antibodies:

4. Mix the slurry well and add 70-100 μl of the beads to each sample. Always keep samples on ice.

Beads will tend to stick to the sides of the tip so try to minimize the movement in the pipette and use a tip cut 5 mm from the top.

5. Incubate the lysate beads mixture at 4°C under rotary agitation for 4 hr (the optimal incubation time can be determined in a preliminary experiment).

6. Follow the steps in section 5 wash.

4.2. Method B

Immunoprecipitation with Antibody-Agarose conjugate

1. To prepare Protein A or G agarose/Sepharose beads, follow the step 3 in method A.

2. To the microcentrifuge tubes add approximately 70-100 µl of slurry of Protein A-, or G-, or

L-agarose conjugate.

3. Add 10 µl of primary antibody. Use the dilution recommended on the antibody datasheet for IP

as a guideline.

4. Incubate the antibody-beads mixture for 1-4 hours at 4°C by gently mixing the mixture on a

suitable shaker.

5. Centrifuge at 1,000-3,000 g for 2 minutes at 4°C and discard the supernatant.

6. Add 1 ml lysis buffer to the mixture by keeping gentle agitation and then centrifuge at 3,000 g for

2 minutes at 4°C. Repeat this washing step twice.

7. After washing the beads and antibody mixture, add 10-50 μg of cell lysates.

8. Incubate the lysate-beads/antibody conjugate mixture at 4°C under rotary agitation between 4

hours to overnight as required (The optimal incubation time can be determined in a preliminary experiment).

9. At the end of the incubation, continue with wash steps given in section 5.

5. Wash

1. When the lysate-beads/antibody incubation time is over centrifuge the tubes, remove the supernatant from the beads and discard. The complex of interest should now be specifically bound to the antibody coating the beads.

2. Wash the beads with washing buffer or lysis buffer 3 times, to remove non-specific binding. For each wash, mix the beads gently with wash buffer, centrifuge at 4°C and remove the supernatant which can be discarded.

3. Finally, ensure to carefully remove as much wash buffer as possible from the beads. The complex is

now ready for elution from beads.

Using loading buffer is the harshest elution method, and will also elute any

non-covalently bound antibodies and antibody fragments, which will appear on

western blot gels. Antigens can be gently eluted with a glycine gradient (up to 1

M) to reduce the amount of eluted antibody.

Click here to view separate procedure for cross-linking antibody to Sepharose.

6. Elution洗脱

One of the three common methods can be used to elute the complex from the beads. The SDS buffer is the harshest buffer which will also elute non-covalently bound antibodies and antibody fragments along with the protein of interest on the other hand Glycine buffer gently elutes the protein with reduced amount of eluted antibody.

6.1. Glycine Buffer Elution:

In this procedure the complex can be eluted from the beads by acidification. A glycine buffer containing 0.1-0.2 M Glycine pH 2.0-3.0 can be used. The low pH of glycine buffer helps to weaken the interaction between the antibody and the beads. This method is advantageous as beads can be reused after

removal of the glycine buffer. However the eluted sample should be immediately neutralized with Tris, pH

8.0-8.5. After standard IP, follow these steps for glycine elution:

1. Elute the beads (50 µl) 3 X with 150 µl 0.2 M glycine pH 2.6 (1:1) by incubating the sample for

10 minutes with frequent agitation before gentle centrifugation.

2. Pool the eluate and neutralize by adding equal volume of Tris pH 8.0.

3. Repeat these steps 1-2 times and collect all the eluate.

4. Neutralize the beads by washing 2 X with 150 µl lysis buffer (without detergent) and pool with

eluate.

5. Run the samples on a western blot to check the precipitation of proteins.

6.2. SDS Buffer Elution

In SDS elution the Ag-Ab complex is eluted from the beads by heating or boiling samples in loading buffer with denaturant SDS. This method is advantageous because the extraction method is highly efficient and the resulting sample is more concentrated.

1. Elute 50 µl of beads by heating in 50 µl of 2 X SDS without DTT for 10 min at 50°C.

2. Pellet beads, transfer supplement to a new tube and add DTT at 100 mM (Elution 1).

3. Add 50 µl 2 X SDS Buffer with DTT to pelleted beads (Elution 2).

4. Boil the elution samples for 5 min and analyze content of the sample by western blot.

Generally, there should be target protein in both elutions 1 and 2 collected above although amounts in each will be variable; Elution 2 will have more IgG contamination than Elution 1.

6.3. Urea Buffer Elution:

In this method the complex is eluted from the beads by the chaotrope urea. Beads should be

resuspended in 2-5 volumes of urea elution buffer (6 – 8 M Urea, 20 mM Tris pH 7.5, and 100 mM NaCl). The purified complexes have now been released into the supernatant which should be collected from above the beads. This method is advantageous for mass spectrometry because the sample can be digested by proteolytic enzymes.

1. Wash beads with pre-urea wash buffer (50 mM Tris pH 8.5, 1 mM EGTA, 75 mM

KCl). Remove all residual supernatant.

2. Add 100 µl urea elution buffer and rotate for 30 min at room temperature with frequent agitation

before gentle centrifugation.

3. Repeat this process at least twice more to ensure that the entire captured complex has been

released from the beads. Pellet beads and remove urea to a new tube.

4. Add 3 X sample buffer to run on a gel in western blot.

7. Choosing the correct beads- summary table

Key: +++ = Strong binding, ++ = Medium binding, + = Weak binding, - = No binding

8. References

Harlow, Ed, and David Lane. Using Antibodies. Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999.

Bonifacino, Juan S. et al. Current Protocols in Immunology 8.3.1-8.3.28, New York: John Wiley, 2001.

范文十:免疫共沉淀事项

最近我们实验室想做这个试验,以前也没有做过,如果有战友做过这个试验,希望介绍点经验和教训,谢谢乐。

应战友要求,在网上找乐一下基础资料,方便大家查看,虽然下面也列出了试验方法,但在实际实验室可能并不一样,希望战友们较少些自己的亲身体会,让大家和我本人在即将进行的试验中少走弯路。先谢谢各位了

免疫共沉淀 免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation)是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。 其原理是:当细胞在非变性条件下被裂解时,完整细胞内存在的许多蛋白质-蛋白质间的相互作用被保留了下来。如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X,那么与X在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合;也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档。

其优点为:(1)相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的,处于天然状态;(2)蛋白的相互作用是在自然状态下进行的,可以避免人为的影响;(3)可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物。缺点为:(1)可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质-蛋白质相互作用;(2)两种蛋白质的结合可能不是直接结合,而可能有第三者在中间起桥梁作用; (3)必须在实验前预测目的蛋白是什么,以选择最后检测的抗体,所以,若预测不正确,实验就得不到结果,方法本身具有冒险性。

实验流程为:

(1)转染后24-48 h 可收获细胞,加入适量细胞裂解缓冲液(含蛋白酶抑制剂),冰上裂解30min, 细胞裂解液于4°C, 最大转速离心30 min后取上清;

(2)取少量裂解液以备Western blot分析,剩余裂解液加1μg相应的抗体加入到细胞裂解液,4°C缓慢摇晃孵育过夜;

(3)取10μl protein A 琼脂糖珠,用适量裂解缓冲液洗3 次,每次3,000 rpm离心3 min;

(4)将预处理过的10μl protein A 琼脂糖珠加入到和抗体孵育过夜的细胞裂解液中4°C缓慢摇晃孵育2-4h,使抗体与protein A琼脂糖珠偶连;

(5)免疫沉淀反应后,在4°C 以3,000 rpm 速度离心3 min,将琼脂糖珠离心至管底;将上清小心吸去,琼脂糖珠用1ml裂解缓冲液洗3-4次;最后加入15μl的2×SDS 上样缓冲液,沸水煮5分钟;

(6)SDS-PAGE, Western blotting或质谱仪分析。

注意的问题:

(1)细胞裂解采用温和的裂解条件,不能破坏细胞内存在的所有蛋白质-蛋白质相互作用,多采用非离子变性剂(NP40或Triton X-100)。每种细胞的裂解条件是不一样的,通过经验确定。不能用高浓度的变性剂(0.2%SDS),细胞裂解液中要加各种酶抑制剂,如商品化的cocktailer。

(2)使用明确的抗体,可以将几种抗体共同使用

(3)使用对照抗体:

单克隆抗体:正常小鼠的IgG或另一类单抗

兔多克隆抗体:正常兔IgG

在免疫共沉淀实验中要保证实验结果的真实性,应注意以下几点:

(1) 确保共沉淀的蛋白是由所加入的抗体沉淀得到的,而并非外源非特异蛋白,单克隆抗体的使用有助于避免污染的发生;

(2) 要确保抗体的特异性,即在不表达抗原的细胞溶解物中添加抗体后不会引起共沉淀;

(3) 确定蛋白间的相互作用是发生在细胞中,而不是由于细胞的溶解才发生的,这需要

进行蛋白质的定位来确定。ChIP是个很郁闷的实验,时间花费N长,如果做的不好非常打击人,我也谈不上什么成功经验呢

1)显然抗体来源要可靠,很多在WB上很好的商业化抗体并不能成功使用到ChIP上。

2)超声处理要充分,处理完呢以后DNA一定要跑胶检测看看,如果片段都很大,结果受到的影响很大,特别是如果ChIP组蛋白谢谢 alixtardxy 现在好多大牛文章上面都用IP ,做的也很漂亮,摸索好了条件,应该是不难做的,有个疑问 ,为什么在WB上能用的 在IP上就不能用乐啊?对不起,我直接想到ChIP上去了,所以才出现了上面的那些说法。你的意思应该是 chip 用的抗体是特殊的吧?即便和WB试验一样,抗同样的抗原。楼主是否把免疫共沉淀的定义和实验目的说下,这样方便讨论,呵呵这个试验太陌生了,还望各位多多指教啊ChIP是ChIp(染色质免疫沉淀),不是楼主说的Co-IP(免疫共沉淀),二者是风马牛不相及的两个试验和概念,原理和目的都不一样,楼上很多人将二者搞混了.

染色质免疫沉淀的作用是鉴定蛋白与DNA的结合,相当于EMSA(凝胶滞留试验)的体内试验。

基本原理是用抗体将目标蛋白及其它可能结合的DNA沉淀下来,然后用引物扩增DNA的序列。因此这个目标蛋白通常具备转录调节功能,能够结合DNA,目前也有做结合RNA的Chip。

免疫共沉淀的作用是鉴定蛋白与蛋白的相互作用。用抗体将蛋白(A)及其可能结合的目标蛋白(B)沉淀下来。因此这个A蛋白可以是任何蛋白。“共”指反过来用B的抗体也能将A/B复合物沉下来。如果是单向的,通常叫免疫沉淀。楼主的帖子“免疫共沉淀的具体注意事项”不适合放在核酸版块,更适合放在蛋白质版块。

相反,“染色质免疫沉淀CHIP”适合在该版块。我做的不是很多,但是有几点提出来和大家讨论下。

我想这个试验最关键的就是细胞的处理和抗体来源。

如二楼所说,的确很多WB的抗体是不一定可以用到ChIP上的,这个应该是和抗体的制作过程有关系的。至于多抗还是单抗,我认为各有优缺点。比如说单抗是特异性的针对某种表位的,这样可以选择几种单抗混合使用效果会好些,而且背景也低很多。多抗虽然比较复杂,最主要的是非特异性反应比较多,导致试验结果不好判断,但是经过合理的纯化,应该会将这个缺点变小。做ChIP的抗体应该是能够针对空间表位的,虽然某些针对线性表位的抗体也能够运用其中,但是那只是小部分,所以我认为抗体的来源很关键,无论是购买还是自己制作,都需要对其的特性比较了解。

ChIP还有一个问题是细胞的处理,虽然很多公司都提供了现成的试剂可供选择,但是那只是通用性的试剂,真正适合自己细胞的还需要做预试验摸索下。其次是细胞内相互作用的蛋白,可能会由于处理导致不发生作用等等因素导致相应值变低,所以我觉得处理时间,温度等等外部条件还是很重要的。

以上是个人观点,仅供参考!看来我也看错了,不好意思!目前个人认为生物医学研究的瓶颈就是是否能制备高质量的适合多种用途的抗体。

很多所谓的主流研究方法都要依赖抗体。例如Western blot,免疫荧光,流式分析,ELISA,IP,CoIP, ChIP。个人对抗体制备的原理和方法不是很清楚,但是实际过程中很多并不想说明书上说的那样,结果是否漂亮,只有用了才知道。

Western blot应该是抗体的最基本功能,他的最后原理是抗体结合到膜上的抗原,然后通过二抗来显示其位置。免疫共沉淀的抗体就不一样了,他要保证能够将你的目标蛋白及其复合物牢固的结合并通过蛋白A或G将其沉下来。

举个简单的例子说明二者的不同,不知道是否正确,一男(抗体)与一女(抗原)热情的接吻,在床上(膜)可能很容易办到,上述过程类似WB,抗体的功能只是识别固定物(转膜)

上的抗原,风平浪静。相反,一男(抗体)与一女(抗原)热情的接吻,在激流中就不容易办到,上述过程类似免疫沉淀,是动态环境下的识别,而且必须特异性的牢固结合,这种接吻要求是热吻,紧密结合,并且最终用一个钩子(免疫沉淀中叫蛋白A或G)将男的勾下来后,要保证男的还热吻者那个女的(即抗原)。因此要求这个男的(抗体)要紧紧的抱住那个女的(抗原)。可想而知激流中(免疫沉淀)对男的质量要求更高,一定要保证不与女的分手。如果男的还三心二意,可能抱的是其他的女人,这在免疫沉淀中就会产生非特异性条带。因此,免疫沉淀一定要设置对照IG抗体来沉淀,如果随便一个男的(对照IG)也能将某个女的抱下来,那这个女的就是“博爱”,不是真正需要的最爱(特异条带)。

鉴于目前很多男的(抗体)质量不可靠或者不能满足,因此大量的文献喜欢采用标签蛋白(例如,HIS,HA,GFP,MYC等)作为“特异男”来勾引“女”的。

个人认为需要一个个试,看那个能够用于免疫沉淀,有的抗体是针对男的“嘴巴”来设计的,这种抗体当然能够容易将女的抱下来,相反有的是针对其他部位设计制备抗体的,功能也就不一样了。

Co-Ip成功的关键主要有两个:1)男的质量。2)男女接吻时的环境(例如是否有其他干扰因素,沉淀的时间,温度,比例,旋转强度等)

不对指正。tangdl2000的比喻很有意思,呵呵

再次建议楼主把免疫共沉淀的实验目的说下,这样方便讨论,呵呵

想说下免疫沉淀,免疫沉淀是用你的抗体富集目的抗原,然后用WESTERN显示,你的抗体是否结合抗原。

由于是富集了目的抗原,WESTERN不容易做出来的,用免疫沉淀可能容易出结果,但是也容易出杂带。

如果看两个分子是否相互作用,可以用免疫共沉淀。

染色质免疫沉淀(EMSA)主要用于研究转录因子的。

实验技巧是为了实验目的服务的,撇开实验目的,单纯讨论实验技巧,似不可取。

另外建议:发现很多战友发贴,不注明实验目的,这样讨论,可能最后发现所讨论的实验技术并不是为你的实验目的服务的。

GOOD LUCK呵呵,由于我的疏忽,把这个帖子置顶了。

关于抗体的问题,我的看法是。

1)对应WB而言,使用的抗体识别的抗原应该是线性化的抗原(SDS)的作用,因此它识别的不是蛋白在具有正常空间结构时的抗原决定簇,而是在蛋白一级结构上相临的几个AA组成的抗原决定簇。

2)对应FACS而言,多数情况下,它识别的是具有正常高级结构的蛋白的抗原决定簇,这些抗原决定簇可能是由相邻近的AA组成的或者是由于蛋白折叠后原本在一级结构上相距比较远的几个AA组成的,因此WB和FACS的抗体有时能够通用,有时不能通用。

3) Co-IP的情况,我认为和FACS是相类似的。

4) ChIP的情况最为头痛,因为它涉及了一个crosslink的过程,这个可能造成一些抗原决定簇被封闭掉,而且在免疫共沉淀使用的buffer中含有一些变性剂,进一步影响了抗原抗体的结合,因此WB可以用的抗体并不一定能用于ChIP,按照现在的说法,如果不是被validated过的抗体,做ChIP可能需要对多个抗体进行优化评估灵敏性和特异性。

至于是固相杂交还是液像杂交我觉得到不是重点,事实上,和固态的蛋白芯片相比较,液态蛋白芯片(luminex)的效率更高,因为抗原抗体有更加充分的机会接触。我们一般都称之为 IP试验 ,这样就包括 染色质和蛋白 及蛋白和蛋白了谢谢 版主的建议 ,我也是进入实验室不到一年的时间,接触IP的时间更短,试验设计也是在完善阶段,现在主要是实验技术方面的知识太欠缺了

另外 实验的目的,不便说的太详细,因为这个实验有可能投今年的基金,请各位战友谅解谢谢LZ把你的经验拿出来大家分享,最近也在打算做免疫沉淀,学习了各位战友的经验,受益匪浅。我有个问题想请问大家,我的目的蛋白是个跨膜蛋白,表达在哺乳动物细胞膜上,我最终的目的是想把这个蛋白提出来作为抗原去检测患者血清中的抗体,所以对蛋白的量有一定要求。原来标书写的步骤是用免疫沉淀的方法来纯化蛋白,但我认为这个方案不可行,原因是一、哺乳动物细胞蛋白表达量少、膜蛋白提取的量也少,二、免疫沉淀其实就是用抗体去抓取目的蛋白,代价较大,不可能获得大量目的蛋白来作为抗原去行Elisa检测抗体。

三、就算我不惜花钱,免疫沉淀最后洗脱的是Beads,得到的是抗原抗体复合物,会不会影响目标蛋白的抗原性,因为目标蛋白的抗原表位已经被确定的一抗结合了。请各位战友帮忙看看,给些建议,谢谢了。IP本身的假阳性和假阴性和多,具体的操作过程上面的几位谈的挺多了。

我想说的是不管是co-IP还是ChIP,一定要有阴性control,也就是和一抗相同来源的normal IgG。因为珠子本身可以吸附一定的蛋白和DNA,包括一些抗原抗体的非特异性结合,所以很多时候阴性control和实验组时间是量的差别,而不是有或无的关系。这样的结果还是可信的吗?正好今天我也在第一次做这个实验,步骤按着这个程序做的,有经验的人帮我看看。

1、 Add 3 ml ice cold RIPA buffer to cell monolayer and incubate at 4° C for

10 minutes. For suspension cells, add the RIPA buffer to washed cell pellet

in a 15 ml conical centrifuge tube.

2、Disrupt cells by repeated aspiration through a 21 gauge needle and transfer to a 15 ml conical centrifuge tube.

3、Pellet cellular debris by centrifu gation at 10,000xg for 10 minutes at 4° C.

Transfer supernatant to a fresh 15 ml conical centrifuge tube on ice.

Preclear lysate (optional step) by adding 1.0 μg of the appropriate control

IgG (normal mouse, rat, rabbit or goat IgG, corresponding to the host

species of the primary antibody), together with 20 μl of resuspended

volume of Protein A/G PLUS-Agarose. Incubate at 4° C for 30 minutes.

Pellet beads by centrifu gation at 2,500 rpm (approximately 1,000xg) for 5

minutes at 4° C. Transfer supernatant (cell lysate) to a fresh 15 ml conical

centrifuge tube on ice.

4、Transfer 1 ml of the above cell lysate, or approximately 100–500 μg total

cellular protein, to a 1.5 ml microcentrifuge tube. Add 1–10 μl (i.e., 0.2–2

μg) primary antibody (optimal antibody concentration should be determined

by titration) and incubate for 1 hour at 4° C.

5、Add 20 μl of resuspended volume of Protein A/G PLUS-Agarose. Cap tubes and incubate at 4° C on a rocker platform or rotating device for 1 hour to

overnight.

6、Collect immunoprecipitates by centrifugation at 2,500 rpm (approx imately

1,000xg) for 5 minutes at 4° C. Carefully aspirate and discard radioactive

supernatant.

7、 Wash pellet 4 times with 1.0 ml RIPA buffer (more stringent) or PBS (less

stringent), each time repeating centrifugation step above.

8、After final wash, aspirate and discard supernatant and resuspend pellet in

40 μl of 1x electrophoresis sample buffer.

9、Boil samples for 2–3 minutes and analyze 20 μl aliquots by SDS-PAGE and

autoradiography. Unused samples may be stored at -20° C.

10、 Optional: After boiling, samples may be centrifuged to pellet the agarose

beads followed by SDS-PAGE analysis of the supernatant.

不能理解第三步中

Preclear lysate (optional step) by adding 1.0 μg of the appropriate control

IgG (normal mouse, rat, rabbit or goat IgG, corresponding to the host

species of the primary antibody), together with 20 μl of resuspended

volume of Protein A/G PLUS-Agarose. Incubate at 4° C for 30 minutes.

Pellet beads by centrifu gation at 2,500 rpm (approximately 1,000xg) for 5

minutes at 4° C. Transfer supernatant (cell lysate) to a fresh 15 ml conical

centrifuge tube on ice.

这是什么作用?肯定不是对照了啰!!!

第五步,照上面战友的说法孵育的温度、时间、摇床的转速都是很重要的哦?我还准备就在室温呢,会增加非特异性结合?

抗体的量以及总蛋白的量(或者说他们的比值)重要不?需要严格控制不?还是需要调整? 买的是santa cruz的抗体,听说是没有验证过的,但说明书上写明了是可以进行免疫共沉淀的。

心里没底阿。

谢谢Because some proteins such as complement components may bind to the Fc region of the IgG, step 3 can deplete these proteins from your samples.大家的发言都很精彩,我对IP的了解也是最近才开始的,受益匪浅啊这个protocol繁琐而且效果很差。

1.做co-IP是不宜采用变性能力强的去垢剂的lysis buffer,所以不能用RIPA,应采用NP40等弱去垢为基础的lysis buffer.而且,protocol中没有说明多少的细胞加入3ml的lysis buffer,我个人的经验是每组一个10cm plate的细胞足够了,加入1ml lysis buffer with complete protease inhibitor cocktails。

2.步骤3中的预处理需不需要的问题。我个人认为,如果抗体质量足够好(没有明显的杂带,或者杂带确实不会产生影响),则没有必要。

3.protocol中为什么有“radioactivesupernatant”?co-IP和CHIP都不会用同位素啊。而且protocol中离心的转速我感觉太低了,通常5000-10000rpm均可,10000rpm 30s或者5000rpm 2min都不会对抗体抗原-beads复合物产生影响。

4.所有的步骤均需要在4度,主要是抑制蛋白酶活性;抗体的量0.2ug-2ug之间可以,蛋白表达的量最好尽可能的高。santa cruz的抗体既然写了可以做IP,那说明还是没有问题的。呵呵,devil19840一棒子把这个操作步骤打得这么死啊。明天看看结果就知道了。建议:

1.有一种免疫沉淀的方案是有“radioactivesupernatant”,我们一般做的是不用同位素的免疫沉淀方案的,看具体的实验目的了。

2.santa cruz的抗体写了可以做IP,但是出厂不检验,看你的运气了,要多摸索条件。

3.你的抗原是在细胞膜上还是在细胞核上,可根据情况选择裂解液。

4.免疫沉淀的结果最好同时有WESTERN对照,这样可以知道是否成功沉淀了特异性条带。免疫沉淀本身还有个阴性对照。

5.实验注意低温,操作细心。

GOOD LUCK无以为报,投上一票,谢谢。

我做的目的蛋白是做成了转基因小鼠了,在肝细胞的胞浆和胞核均有表达的。

这次只是预试验一下,熟悉整个实验流程,沉淀得到的产物和提取的总蛋白一起做了个western看有没有特异性条带,但没有阴性对照。

沉淀得到的产物和提取的总蛋白sds-page电泳后考染效果还行,至少沉淀得到的产物除了抗体的两条粗条带还有一些细条带,尽管现在还不能排除是否为非特异性的。但好像在目的蛋白的位置没有条带哦,太少?太弱?

God bless me!!作了快半年IP了,都不好意思说,到现在也没得到好的结果,同样也是第一次接触这个实验,实验室没人做过,只好在网上找方法,**里比较少,只有几个帖子转贴的方法,未见有讨论的。

我的实验目的是检测细胞转染一种蛋白之后,培养基中的该蛋白分泌情况,在人体中这种蛋白分泌量极低,而且对培养基直接westernblot未见条带,但对细胞裂解物作western有很强的条带。该蛋白有信号肽,应该分泌出细胞,因无抗体,构建载体时在尾部加上了myc和his片段,我的大致试验过程是:

1。转染该蛋白入HepG2细胞,3小时之后换有或无血清培养基(担心血清里蛋白影响IP过程),24小时之后收集细胞和培养基。

2。westernblot检测细胞裂解物和培养基中表达情况,每次细胞中表达都很好。培养基中都没有见条带。

3。对培养基的IP:

a。1/1000的anti-myc50ul加入到1000ul培养基(直接1000ul,500ul培养基加500ulRIPAbuffer,500ul培养基加500ulTBS都试过),3小时和过夜都尝试过,

b。ProteinG凝胶50ul加入,1-3小时,(在加抗体之前preclear也试过)

c。TBS洗3次,每次离心去上清,小心不丢失凝胶

d。后面基本同western过程。

希望大家指教何处需要改进。

文献中的方法基本也是这样,但就是做不出来,教授不满意压力很大阿~~~谢谢大家贴出经验 一起分享最近我也准备做CO-IP.抗体是自己制备的,不太纯,但是检测抗原比较特异。请教各位,能否在昆虫组织匀浆里做,不用细胞?能否提供一份步骤,谢谢!顶一下。我也即将开始CoIP实验了,其他人没做过都,得自己摸索了,希望能在这获得帮助!!谢谢大家再次有问请教这里的前辈,

我把IP下来的蛋白进行SDS-PAGE电泳,然后进行WESTERN BLOT 或者考马斯亮蓝染色,WESTERN BOT可以明显看到我用于沉淀的蛋白,灰度几乎和抗体的重链差不多,可是考染的结果却只能看到重链和轻连,银染也是这样子,这可怎么办呢?我的目的就是要比较沉下来的东西有什么差别。

沉下来的东西直接进行质谱鉴定应该怎么处理呢?请教各位,本人也在用自己制备的单抗做IP实验,第一次做,很多东西不太明白,望赐教:

1)IP结果跑SDS-PAGE胶,考马染色后,出现抗体重链和轻链带,而且很浓很明显,然而目标蛋白处却很淡,不知是特异的目的带,还是非特异条带?怎么排出这种可能性?

2)我是用虫体组织加RIPA后直接匀浆抽提的总蛋白,但是不知RIPA与组织按照什么比例加,得到的蛋白浓度才适合做IP实验?

3)我已经用protein A做了预处理,但WB后背景比较暗?我也是第一次做coip,结果只有一抗的轻链和重链的地方有条带,目的蛋白或者杂蛋白的条带都没有。用我们提取的蛋白直接做western却能看到目的蛋白。有哪位高手能帮忙分析一下。我们的抗体也是senta的。步骤3是必需的,没有步骤3那么coIP的实验不是严谨的实验。如果没有步骤3那么你怎么排除你coIP下来的蛋白不是跟抗体本身(IgG)结合而下来的呢?如不处理,那么就必须将样品一分为二,增加一个只加对照IgG(抗体是什么源性的加什么)代替抗体的组,同

时进行余下步骤。

该实验细胞裂解液,蛋白酶抑制,低温都很重要。另外最好有同时有两种抗体,用mouse IP,用rabbit WB。或反之。这样可以避免出现IgG轻链和重链,这两条条带太浓,如果目的条带靠的近,你就不用指望能做出漂亮图了。现在有很多抗体都有自己包被好的beads。很方便。

另外IP前需要进行蛋白定量,最好在1mg/ML浓度内,太高了,容易出现假阳性。