免疫沉淀反应

染色质免疫沉淀ChIP

染色质免疫沉淀(ChIP)实验指南及技术总结

ChIP是一项比较流行的研究转录因子(transcriptionfactor,TF)与启动子(promoter)相互结合的实验技术。由于ChIP采用甲醛固定活细胞或者组织的方法,所以能比较真实的反映细胞内TF与Promoter的结合情况。当用甲醛处理时,相互靠近的蛋白与蛋白,蛋白与核酸(DNA或RNA)之间会产生共价键。细胞内,当TF与Promoter相互结合(生物意义上的结合)时,它们必然靠的比较近,或者契合在一起,这个时候用甲醛处理,能使它们之间产生共价键。

染色质免疫沉淀分析(ChiP)是基于体内分析发展起来的方法,它的基本原理是在活细胞状态下固定蛋白质-DNA复合物,并通过超声或酶处理将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段,然后通过抗原抗体的特异性识别反应沉淀此复合体,特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段,通过对目的片断的纯化与检测,从而获得蛋白质与DNA相互作用的信息。它能真实、完整地反映结合在DNA序列上的调控蛋白,是目前确定与特定蛋白结合的基因组区域或确定与特定基因组区域结合的蛋白质的一种很好的方法。CHIP不仅可以检测体内反式因子与DNA的动态作用,还可以用来研究组蛋白的各种共价修饰与基因表达的关系。而且,CHIP与其他方法的结合,扩大了其应用范围:CHIP与基因芯片相结合建立的CHIP-on-chip方法已广泛用于特定反式因子靶基因的高通量筛选;CHIP与体内足迹法相结合,用于寻找反式因子的体内结合位点;RNA-CHIP用于研究RNA在基因表达调控中的作用。

一般ChIP的流程是:甲醛处理细胞---收集细胞,超声破碎---加入目的蛋白的抗体,与靶蛋白-DNA复合物相互结合---加入ProteinA,结合抗体-靶蛋白-DNA复合物,并沉淀---对沉淀下来的复合物进行清洗,除去一些非特异性结合---洗脱,得到富集的靶蛋白-DNA复合物---解交联,纯化富集的DNA-片断---PCR分析。

在PCR分析这一块,比较传统的做法是半定量-PCR。但是现在随着荧光定量PCR的普及,大家也越来越倾向于Q-PCR了。此外还有一些由ChIP衍生出来的方法。例如RIP(其实就是用ChIP的方法研究细胞内蛋白与RNA的相互结合,具体方法和ChIP差不多,只是实验过程中要注意防止RNase,最后分析的时候需要先将RNA逆转录成为cDNA);还有ChIP-chip(其实就是ChIP富集得到的DNA-片段,拿去做芯片分析,做法在ChIP的基础上有所改变,不同的公司有不同的做法,要根据公司的要求来准备样品)。

第一天:

(一)、细胞的甲醛交联与超声破碎。

1、取出1平皿细胞(10cm平皿),加入243 ul 37%甲醛,使得甲醛的终浓度为1%(培养基共有9ml)。

2、37摄氏度孵育10min。

3、终止交联:加甘氨酸至终浓度为0.125M。450 ul 2.5M甘氨酸于平皿中。混匀后,在室温下放置5min即可。

4、吸尽培养基,用冰冷的PBS清洗细胞2次。

5、细胞刮刀收集细胞于15ml离心管中(PBS依次为5ml,3ml和3ml)。预冷后2000rpm

5min收集细胞。

6、倒去上清。按照细胞量,加入SDS Lysis Buffer。使得细胞终浓度为每200ul含2×106个细胞。这样每100ul溶液含1×106个细胞。再加入蛋白酶抑制剂复合物。假设MCF7长满板为5×106个细胞。本次细胞长得约为80%。即为4×106个细胞。因此每管加入400ul SDS Lysis Buffer。将2管混在一起,共800ul。

7、超声破碎:VCX750,25%功率,4.5S冲击,9S间隙。共14次。

(二)、除杂及抗体哺育。

8、超声破碎结束后,10,000g 4oC离心10min。去除不溶物质。

留取300ul做实验,其余保存于-80oC。

300ul中,100ul加抗体做为实验组;100ul不加抗体做为对照组;100ul加入4ul5MNaCl(NaCl终浓度为0.2M),65oC处理3h解交联,跑电泳,检测超声破碎的效果。

9、在100ul的超声破碎产物中,加入900ulChIPDilutionBuffer和20ul的50×PIC。 再各加入60ulProteinAAgarose/SalmonSpermDNA。4oC颠转混匀1h。

10、1h后,在4oC静置10min沉淀,700rpm离心1min。

11、取上清。各留取20ul做为input。一管中加入1ul抗体,另一管中则不加抗体。4oC颠转过夜。

(三)、检验超声破碎的效果。

取100ul超声破碎后产物,加入4ul5MNaCl,65oC处理2h解交联。分出一半用酚/氯仿抽提。电泳检测超声效果。

第二天:

(一)、免疫复合物的沉淀及清洗。

12、孵育过夜后,每管中加入60ulProteinAAgarose/SalmonSpermDNA。4oC颠转2h。 13、4oC静置10min后,700rpm离心1min。除去上清。

14、依次用下列溶液清洗沉淀复合物。清洗的步骤:加入溶液,在4oC颠转10min,4oC静置10min沉淀,700rpm离心1min,除去上清。

洗涤溶液:a.low salt wash buffer-one wash

b.highsalt wash buffer-one wash

c.LiCl wash buffer-one wash

d.TE buffer-two wash

15、清洗完毕后,开始洗脱。洗脱液的配方:100ul10%SDS,100ul1MNaHCO3,800ulddH2O,共1ml。

每管加入250ul洗脱buffer,室温下颠转15min,静置离心后,收集上清。重复洗涤一次。最终的洗脱液为每管500ul。

16、解交联:每管中加入20ul 5M NaCl(NaCl终浓度为0.2M)。

混匀,65oC解交联过夜。

第三天:

(一)、DNA样品的回收

17、解交联结束后,每管加入1ulRNaseA(MBI),37oC孵育1h。

18、每管加入10ul0.5MEDTA,20ul1MTris.HCl(PH6.5),2ul10mg/ml蛋白酶K。 45oC处理2h。

19、DNA片段的回收----omega胶回收试剂盒。最终的样品溶于100ulddH2O。

(二)、PCR分析

不同反应条件对免疫沉淀分离膜蛋白的影响

【中图分类号】R684【文献标识码】A【文章编号】1672-3783(2011)08-0306-01   【摘要】目的:探讨不同条件对免疫沉淀方法分离纯化膜蛋白时的影响。方法:分别应用磷酸盐缓冲液(PBS)和溶膜缓冲液(含去垢剂)作为反应系统,单克隆抗体PD4与胃癌细胞系MGC803细胞膜溶液进行免疫沉淀反应以获得PD4相关抗原,用Western blot检测膜蛋白的得量。结果:分离纯化PD4相关抗原时,用CNBr-Sepharose 4B-PD4进行免疫沉淀效果优于Protein A Sepharose 4B;溶膜缓冲液作为反应系统效果优于磷酸盐缓冲液。结论:免疫沉淀纯化膜蛋白时,应用抗体直接交联于Sepharose 4B和溶膜缓冲液作为反应系统效果更佳。   【关键词】免疫沉淀 去垢剂 蛋白质   Effect of different reactive condition on purification of membrane protein with immunoprecipitation   【Abstract】aim, To explore the effect of different condition on isolation and purification of membrane protein using immunoprecipitation. Method, monoclonal antibody PD4 immunoprecipitated PD4 associated antigen from detergent lysates of cell membrane of gastric cancer cell line MGC803 in phosphate buffered saline(PBS)or lysis buffer. Quantity of protein was measured with Western blot. Results, during isolation and purification of PD4 antigen, CNBr-Sepharose 4B-PD4 immunoprecipitated better than Protein A Sepharose 4B, lysis buffer was as reactive system better than phosphate buffered saline(PBS). Conclution, it was better that antibody-conjugeted Sepharose 4B and lysis buffer were as reactive systerm using immunoprecipitation for isolation and purification of PD4 antigen.   单克隆抗体PD4是用胃癌细胞系MGC803免疫BALB/c小鼠,经筛选而得到的。前期工作表明,此抗体诱导MGC803细胞凋亡,明显抑制转化细胞Rat3-3在体外的增殖及在软琼脂中的集落形成能力,并能使该转化细胞在裸鼠中的致瘤能力丧失,其相关抗原在ras转化细胞表面呈高表达(1,2,3)。这些结果提示,单克隆抗体PD4相关抗原与肿瘤密切相关。因此,克隆单克隆抗体PD4相关抗原的基因,了解其结构及功能,将有助于我们认识肿瘤的发生、发展及转归规律。    抗体相关抗原的分子克隆,常用两种方法,一是用抗体直接筛选cDNA表达(或DNA)文库,以获得基因片段,二是纯化单克隆抗体相关抗原蛋白多肽,进行测序,根据氨基酸序列,合成兼并引物,通过PCR扩增获得基因片段,然后通过染色体步移或者RACE-PCR得到全长基因(4,5,6,7,8)。免疫学方法是分离纯化蛋白最常用,同时也是最为有效的方法。我们应用不同的反应体系,探讨用免疫沉淀方法分离纯化膜蛋白的优化方案,为得到可测序的膜蛋白,进一步得到全长基因奠定基础。�   1 材料与方法�   一 细胞膜溶液的制备   收取2×108细胞,PBS洗3次,加入PMSF,使其终浓度为100μg/mL,液氮和37℃反复冻融4-5次以破碎细胞,4000rpm离心15分钟,收集上清,于100000g4℃离心1小时,去上清,向沉淀加1-2mL溶膜缓冲液(20mmol/L Tris,0.15mol/L NaCl, 2mmol/L EDTA,1% NP-40, 0.5%脱氧胆酸钠, pH7.5, 终浓度为100μg/mL的PMSF和2μg/mL的Aprotinin用时现加)悬浮细胞膜碎片, 4℃摇动30分钟,4℃10000g离心1小时,上清为细胞膜溶液,分装,-80℃保存备用。�   二 ELISA   消化收集培养细胞加入96孔培养板,培养24小时至细胞在孔底长为一层,用4℃预冷的0.25%戊二醛固定15分钟,含0.05%Tween-20的PBS洗涤细胞,每孔用200μL1%牛血清白蛋白封闭,4℃过夜。弃封闭液,含0.05%Tween-20的PBS洗涤3次,加1%BSA适当稀释的单克隆抗体PD4,室温放置2小时,弃上清,含0.05%Tween-20的PBS洗涤3次,加1%BSA适当稀释的二抗,室温放置1小时,弃上清,含0.05%Tween-20的PBS洗涤3次,加底物200μL/孔(17mg邻苯二胺,25μLH2O2,50mLPBS),反应10-15分钟,加12.5%H2SO450μL/孔终止反应,置酶标仪,波长492nm读数。�   三 PD4与CNBr-Sepharose 4B交联    取适量PD4抗体对0.1mol/L碳酸缓冲液(含0.5mol/LNaCl pH8.9)透析过夜;1gCNBr-Sepharose 4B用1mmol/lHCl浸泡,4℃过夜。用1mmol/lHCl流洗CNBr-Sepharose 4B,再用0.1mol/L碳酸缓冲液流洗,将CNBr-Sepharose 4B刮入PD4(OD280nm=1.326)6ml中,4℃摇动过夜,1000rpm离心10分钟,取上清测OD280nm(0.175),计算交联率(87%),向沉淀中加入11mL1mol/L乙醇胺(含0.5mol/LNaCl pH9.0),室温混合2小时,1000rpm离心10分钟,弃上清,加10mL0.1mol/L醋酸缓冲液(含0.5mol/LNaCl pH4.0)洗涤抽滤,加10mL碳酸缓冲液洗涤抽滤,然后用PBS洗涤,1000rpm离心10分钟,弃上清,加10mL0.1mol/L甘氨酸缓冲液(pH2.8),室温摇动20分钟,1000rpm离心10分钟,弃上清,PBS洗涤致pH为中性,加0.1%NaN3,4℃保存。�   四 Western blot    取待测样品进行SDS-PAGE分析(7),电泳完毕,恒压100mV电转1.5小时,将蛋白转移至膜上(电转移缓冲液:10mmol/L Tris, 15mmol/L 甘氨酸, 10% 甲醇)。电转完毕,用0.5%丽春红染色,蒸馏水脱色至蛋白带清晰可见,做好标记,继续脱色至蛋白条带消失,用5%的脱脂奶粉/TBS(TBS缓冲液配制,20mmol/L Tris,0.8% NaCl,pH7.4)室温封闭2-3小时,0.05% Tween-20/TBS洗膜,加用5%的脱脂奶粉/TBS适当稀释的一抗4℃过夜,0.05% Tween-20/TBS洗膜,加用5%的脱脂奶粉/TBS适当稀释的辣根过氧化物酶标记的二抗,室温孵育1-2小时,0.05% Tween-20/TBS洗膜,加0.05% DAB(10mmol/L Tris-HCl,pH7.6配制,含0.1% H2O2)显色,待显色清楚时,用去离子水漂洗以终止反应(8)。�

五 免疫沉淀    取5μLProtein A Sepharose 4B,用400μLPBS(或溶膜缓冲液)悬浮,4℃摇动10分钟,12000rpm离心5秒,弃上清,重复3次,加入1.3mg/mL的PD410μL,PBS(或溶膜缓冲液)稀释至100μL,4℃摇动3小时,12000rpm离心5秒,弃上清,200μLPBS(或溶膜缓冲液)悬浮,4℃摇动10分钟,12000rpm离心5秒,弃上清,重复3次。取10μLSepharose 4B-PD4,PBS(或溶膜缓冲液)洗涤3次,加MGC803细胞膜溶液10μL,用PBS(或溶膜缓冲液)稀释至100μL,4℃摇动过夜,12000rpm离心5秒,弃上清,用PBS(或溶膜缓冲液)400μL悬浮沉淀,4℃摇动10分钟,12000rpm离心5秒,弃上清,重复3次,加1XSDS-PAGE加样缓冲液20μL,100℃5分钟,12000rpm离心5分钟,取上清电泳。�   六 结果   单克隆抗体PD4相关抗原表达于胃癌细胞系MGC803和膀胱癌细胞系EJ单克隆抗体PD4与胃癌细胞系MGC803和膀胱癌细胞系EJ呈阳性反应,说明单克隆抗体PD4相关抗原不但表达于MGC803细胞,同时也表达于EJ细胞(表1)。进一步分离细胞膜,溶解后行Western blot检测,PD4与MGC803和EJ细胞膜溶液呈阳性反应,说明PD4相关抗原相关抗原具有较广泛的肿瘤特异性。并且此反应条带分子量为40kD,即单克隆抗体PD4相关抗原的分子量为40kD(图1)。�   1:marks;2:MGC803细胞膜溶液与PD4反应;3:EJ细胞膜溶液与PD4反应;4:MGC803细胞膜溶液与正鼠血清反应;5:EJ细胞膜溶液与正鼠血清反应用Protein A Sepharose 4B对MGC803细胞膜溶液进行免疫沉淀取2等份Protein A Sepharose 4B分别与等量的PD4反应后,再与10μLmgc803细胞膜溶液反应,其中一份用PBS稀释,另一份用溶膜缓冲液稀释,反应完毕,将所得物进行SDS-PAGE电泳(分离胶10%),然后用Western blot检测。用溶膜缓冲液稀释组免疫沉淀反应条带明显多于用PBS稀释组(图2)。   用Sepharose 4B-PD4对MGC803细胞膜溶液进行免疫沉淀    取2等份Sepharose 4B-PD4与10μLMGC803细胞膜溶液反应,其中一份用PBS稀释,另一份用溶膜缓冲液稀释,反应完毕,将所得物进行SDS-PAGE电泳(分离胶10%),然后用Western blot检测。用溶膜缓冲液稀释组免疫沉淀反应条带明显多于用PBS稀释组(图2)。   �   图2 两种不同免疫沉淀方法分离纯化PD4相关抗原�   1:MGC803细胞膜溶液与PD4反应;2、4:用细胞膜溶解缓冲液进行免疫沉淀;   3、5:用PBS进行免疫沉淀;2、3:用Protein A Sepharose 4B进行免疫沉淀;   4、5:用CNSr Sepharose 4B-PD4进行免疫沉淀�   讨论    蛋白质的分离纯化,首先要确定目的蛋白存在于何种组织,及亚细胞结构的定位情况,然后建立有效的检测方法。ELISA检测结果表明,单克隆抗体PD4相关抗原存在于胃癌细胞系MGC803和膀胱癌细胞系EJ。分离细胞膜,Western Blot证明该蛋白存在于肿瘤细胞膜,分子量为40kDa(p40)。因此,将MGC803细胞膜溶液作为样品,进行p40蛋白的分离纯化。    免疫沉淀和免疫亲和层析是蛋白分离纯化最常用、也是最有效的方法(4,5)。在进行免疫反应过程中,反应体系的选择,对实验结果有较大影响。用PBS稀释的反应体系所得蛋白量明显低于用溶膜缓冲液作为稀释的反应体系。这与膜蛋白的疏水性相关。在PBS稀释的反应体系中,蛋白的疏水域倾向形成蛋白的核心,或是蛋白分子间疏水域相互作用,形成疏水核心,而外周则是亲水残基占据优势,这样,膜蛋白更易于以多聚体形式存在,这种存在方式影响抗原抗体的反应。膜蛋白在在去垢剂的存在下,具有更好的溶解性,这种溶解状态,有利于抗原抗体反应,因此,在免疫沉淀中能得到更多的蛋白质。    单克隆抗体PD4相关抗原p40的多肽链分子量为40kD,与PD4重链分子量较接近。在用protein A-Sepharose 4B进行免疫沉淀时,欲得到足够进行氨基酸测序用的p40,PD4的用量就要相应加大,其重链含量就大,免疫沉淀后。电转移至PVDF膜上的p40和重链将会有部分重叠,要切下p40进行氨基酸测序,将是困难的。为了解决这个问题,将PD4与CNBr-Sephrose 4B交联(交联率为87%),然后进行免疫沉淀,以便得到了足够进行氨基酸测序的蛋白质。      参考文献�   [1] 董志伟,万文徽,李振甫,邱万荣,魏淑敏. 抗胃癌细胞系单克隆抗体PD4的初步研究'. 生物化学杂志,1985,1:52-58�   [2] 肖海,寿成超,董志伟 单克隆抗体PD4诱导人胃癌细胞系MGC-803的凋亡。中华肿瘤杂志,1998,20(1):31-33�   [3] 殷卫宁,董志伟,邓国仁单克隆抗体PD4对Ha―ras转化细胞Rat3―3抑制效应的研究。中华肿瘤杂志,1991,13(2):82-86�   [4] Christian S, Ahorn H, Koehler A, Eisenhaber F, Rodi HP, Garin-Chesa P, Park JE, Rettig WJ, Lenter MC. Molecular cloning and characterization of endosialin, a C-type lectin-like cell surface receptor of tumor endothelium. J Biol Chem. 2001 9;276(10):7408-14. �   [5] Isogai Z, Shinomura T, Yamakawa N, Takeuchi J, Tsuji T, Heineg?rd D, Kimata K. 2B1 antigen characteristically expressed on extracellular matrices of human m alignant tumors is a large chondroitin sulfate proteoglycan, PG-M/versican. Cancer Res. 1996 1;56(17):3902-3908.�   [6] Blotta S, Tassone P, Prabhala RH, Tagliaferri P, Cervi D, Amin S, Jakubikova J, Tai YT, Podar K, Mitsiades CS, Zullo A, Franco B, Anderson KC, Munshi NC. Identification of novel antigens with induced immune response in monoclonal gammopathy of undetermined significance.Blood. 2009 8;114(15):3276-84. �   [7] Powell F, Lawson M, Rothwell L, Kaiser P. Development of reagents to study the turkey's immune response: Identification and molecular cloning of turkey CD4, CD8alpha and CD28.Dev Comp Immunol. 2009 33(4):540-546. �   [8] Tsai LC, Peng HJ, Lee CS, Chao PL, Tang RB, Tsai JJ, Shen HD, Hung MW, Han SH. Molecular cloning and characterization of full-length cDNAs encoding a novel high-molecular-weight Dermatophagoides pteronyssinus mite allergen, Der p 11. Allergy. 2005 Jul;60(7):927-937.�      作者单位:150000 哈尔滨医科大学

免疫沉淀IP免疫共沉淀coIP染色体免疫沉淀ChIP

楼上说的准确的叫Co-IP。IP就是免疫沉淀,没有“共”,哈哈。 其实楼主的意思是既然有Pyk2 and p-Pyk2的抗体,直接检测western,就可以了,为什么还要用IP以后的样品来检测,这是因为p-Pyk2商业化的抗体特异性不好,可能对p-FAK或其他类似的磷酸化蛋白有交叉,所以我们一般为了准确性,看其磷酸化的变化,就先单独把这个蛋白免疫沉淀出来,在用4G10抗体来检测。而且这个方法看的是Pyk2蛋白全部的磷酸化位点的情况,而p-Pyk2商业化抗体一般都是识别某一格Tyr磷酸化位点的,所以这两种试验是有本质区别的,这种方法还应用于很多Tyrosine kinase receptor磷酸化的检测,因为这些蛋白磷酸化位点都特别多哈:)

免疫沉淀是指用抗体把抗原(包括单体、复合物)沉淀下来 ,是一种抗原纯化、浓集的方法;免疫共沉淀 指用抗体把抗原复合物沉淀下来,常用来研究蛋白质的相互作用

免疫沉淀(Immunoprecipitation, IP)

免疫沉淀是利用抗体特异性反应纯化富集目的蛋白的一种方法。抗体与细胞裂解液或表达上清中相应的蛋白结合后,再与蛋白A/G(ProteinA/G)或二抗偶联的agaose或Sepharose珠子孵育,通过离心得到珠子-蛋白A/G或二抗-抗体-目的蛋白复合物,沉淀经过洗涤后,重悬于电泳上样缓冲液,煮沸5-10min,在高温及还原剂的作用下,抗原与抗体解离,离心收集上清,上清中包括抗体、目的蛋白和少量的杂蛋白。

基本实验步骤

(1)收获细胞,加入适量细胞IP裂解缓冲液(含蛋白酶抑制剂),冰上或者4℃裂解30min, 12,000g离心30 min后取上清;

(2) 取少量裂解液以备Western blot分析,剩余裂解液将1μg相应的抗体和10-50 μl protein A/G-beads加入到细胞裂解液,4°C缓慢摇晃孵育过夜;

(3)免疫沉淀反应后,在4°C 以3,000 g速度离心5 min,将protein A/G-beads离心至管底;将上清小心吸去,protein A/G-beads用1ml裂解缓冲液洗3-4次;最后加入15μl的2×SDS 加样缓冲液,沸水煮10分钟;

(4)SDS-PAGE, Western blotting或进行质谱分析。

一、 样品处理:

免疫沉淀实验成功与否,第一步处理样品非常关键。免疫沉淀实验本质上是处于天然构象状态的抗原和抗体之间的反应,而样品处理的质量决定了抗原抗体反应中的抗原的质量,浓度以及抗原是否处于天然构象状态。所以制备高质量的样品以用于后续的抗体-agarose beads孵育对免疫沉淀实验是否成功非常关键。在这个环节中,除了要控制所有操作尽量在冰上或者4°完成外,最为关键的是裂解液的成份。

用于免疫沉淀实验的样品一般是原代培养细胞裂解液或者细胞系裂解液。我们以常用的RIPA裂解液为例(主要含有pH7.4左右的离子缓冲液,接近生理浓度下的NaCl,一定比例的去垢剂和甘油以及各类蛋白酶抑制剂等)来说明其各主要成份的用途,进而帮助我们如何针对不同的实验目的和不同的蛋白质特性来选择最佳的裂解液。

a. 缓冲液:离子缓冲液常采用pH7.4的Hepes或者Tris-Cl。

b. NaCl浓度一般习惯用150 mM,这主要是因为150 mM接近生理浓度,不会破坏蛋白质之间的相互作用。然而细胞内部的NaCl浓度并不是均一的,局部NaCl的浓度可以低到50 mM,150 mM的NaCl有可能会破坏这个区域的蛋白质相互作用。因此裂解液配方最佳的NaCl浓度要

视所分析的蛋白的亚细胞定位而定。

c. 甘油由于其粘性,可以对蛋白质之间的相互作用起到一个很好的保护作用。一般添加10%的甘油有助于稳定蛋白质之间的相互作用。

d. 裂解液中的去垢剂可以裂解细胞质膜,也同时破坏了许多细胞器的膜,从而释放了其中储存的许多蛋白酶。而由于用于免疫沉淀实验的去垢剂作用比较温和,因此蛋白酶的活性大部分得以保存。还有一部分蛋白酶来自胞质中,主要由于其抑制蛋白或者其活性抑制环境受到改变后从而恢复了蛋白酶活性。因此,添加蛋白酶抑制剂对于防止目的蛋白的降解从而完成免疫沉淀实验非常关键。一般主要通过添加EDTA抑制金属蛋白酶,通过Protease Cocktail(多种蛋白酶抑制剂混合物)可以抑制蛋白酶。

e. 去垢剂对于免疫沉淀实验尤其是免疫共沉淀实验是一个非常关键的因素。不同的去垢剂种类和不同的去垢剂浓度主要通过影响以下三个因素来影响免疫沉淀效果:

- 细胞质/器膜的通透性:因为许多目的蛋白都定位在细胞器中,所以必须先将这些蛋白释放出来,抗体才能与之反应。

- 膜蛋白的释放:许多膜蛋白的构象对去垢剂种类和浓度非常敏感,因此针对这类蛋白的免疫沉淀实验,需要谨慎地尝试多种去垢剂以及不同浓度。

- 蛋白相互作用:不同去垢剂对不同性质的蛋白质的相互作用影响程度不一样,需要根据具体蛋白的特性进行分析选择去垢剂种类和浓度。而由于何种去垢剂适应作用于何种蛋白质现在很难精准预测,所以一个更为切实可行的办法就是通过具体实验筛选合适的去垢剂种类和浓度。

二、 抗体-agarose beads孵育

裂解细胞,离心并去除不可溶的膜组份后,上清可以储存在-80°保存3个月,但最好能够使用新鲜制备的细胞裂解液上清去进行抗体-agarose beads孵育实验。抗体可以先加入上清中与样品孵育数小时后再加入Protein A或者G beads孵育过夜,也可以同时加入抗体和Protein A或者G beads孵育过夜。一般选择1mg总蛋白(1mg/ml)对应添加1 ug抗体,最高可以添加至5 ug抗体,过多的抗体会产生假阳性。这个步骤中关键因素在于选择合适的阴性对照。一般选用加同样量的IgG,但更为妥当的方法是选择针对胞内其它无关目的蛋白的一抗做对照。例如,做膜蛋白A的免疫沉淀,选择膜蛋白B来做阴性对照,只要确认二者之间没有相互作用;而做胞质可溶性蛋白C的免疫沉淀,则选择另外一个可溶性蛋白D来做阴性对照。同时,为避免Protein A或者G beads有(非)特异性吸附从而造成免疫沉淀实验结果的假阳性,一般在加入目的蛋白抗体之前,预先将Protein A或者G beads与细胞裂解液孵育数小时,然后取上清用于后续的抗体-agarose beads孵育。

同时,Protein A或者G beads对不同类型的抗体亲和力不同,结合一抗的种属和Ig亚型,选择合适的Protein A或者G beads也是决定免疫沉淀实验成功与否的一个重要因素。一般推荐使用Protein A和Protein G beads的混合物,这样可以达到最佳实验效果,而且省去了许多选择的烦恼。

三、 抗体-agarose beads复合物洗涤:

除了选择特异性好的抗体以及选择合适的阴性对照外,去除免疫沉淀实验非特异性的一个办法是对抗体-agarose beads复合物进行多次洗涤。一般洗涤缓冲液使用和裂解液一样的配方,但去除甘油,以减少由于甘油的粘性带来的非特异性吸附。针对不同的实验要求,还可以通过更改NaCl的浓度以及去垢剂的比例,种类来达到去除非特异性吸附的效果。例如,针对单纯的免疫沉淀而非免疫共沉淀实验或者虽然是进行免疫共沉淀实验,但蛋白质之间的结合比较牢靠,可以考虑使用低浓度(0.2-0.5%)的SDS洗涤抗体-agarose beads复合物,这样可

以去除绝大部分非特异性相互作用。

四、 鉴定

免疫沉淀实验用途非常广泛(见IP: Q&A),而且基于最基本的免疫沉淀实验衍生出了许多免疫沉淀相关实验手段(比如免疫共沉淀,染色质免疫沉淀和RNA-蛋白免疫沉淀),因此,免疫沉淀实验的鉴定方法主要视实验目的而定。

我们在本手册中主要简单概述常见的免疫沉淀之后的WB检测需要注意的实验环节。由于免疫沉淀实验使用目的蛋白抗体加Protein A/G beads与样品孵育,因此在最后离心获得抗体-agarose beads复合物后,eppendorf管中主要含有抗体,目的蛋白,Protein A/G beads以及一些其它非特异性作用蛋白。其中,抗体和目的蛋白以及Protein A/G beads三者之间是以非共价健结合在一起,只有Protein A/G与agarose beads是共价结合在一起的。因此,最后经过添加含巯基乙醇的加样缓冲液以及煮沸变性并离心出去Protein A/G beads后,eppendorf管只有抗体和目的蛋白以及少量非特异性吸附蛋白。这样SDS-PAGE中就含有目的蛋白和抗体二种蛋白,由于加样缓冲液中含有巯基乙醇从而导致抗体的重链与轻链之间的二硫键被破坏从而使得抗体分子变成重链分子(55KD)和轻链分子(25KD)。因此,WB显色反应中除了能检测到目的蛋白外,如果所使用的二抗与用于免疫沉淀实验的抗体分子属于同一种属的话,还能检测到重链和轻链分子。通常用于免疫沉淀的抗体量非常大(1ug),所以当目的蛋白的大小接近重链或者轻链分子时,重链或者轻链分子的WB信号常常由于信号过强而导致影响对目的蛋白的WB结果判断。

针对上述情况,通常有二种解决办法:

a. 选择不同种属的抗体分别进行免疫沉淀实验和WB实验,这样再选择一个种属交叉反应比较弱或者无种属交叉反应的二抗进行WB实验,就可以大大减弱重链和轻链分子的WB信号。

b. 使用交联剂将抗体和Protein A/G beads交联,然后通过添加不含巯基乙醇的加样缓冲液处理目的蛋白-抗体-agarose beads复合物,最后离心去除抗体-agarose beads复合物,上清中只留下目的蛋白。

免疫共沉淀(Co- Immunoprecipitation, Co-IP)

是利用抗原和抗体的特异性结合以及细菌的Protein A或G特异性地结合到免疫球蛋白的Fc片段的现象开发出来的方法。其基本原理是,在细胞裂解液中加入抗兴趣蛋白的抗体,孵育后再加入与抗体特异结合的结合于Agarose珠上的Protein A或G,若细胞中有与兴趣蛋白结合的目的蛋白,就可以形成这样一种复合物:“目的蛋白—兴趣蛋白—抗兴趣蛋白抗体—Protein A或G”,经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,复合物又被分开。然后经免疫印迹或质谱检测目的蛋白。这种方法得到的目的蛋白是在细胞内与兴趣蛋白天然结合的,符合体内实际情况,得到的结果可信度高。这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合;也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档。

免疫共沉淀优点

(1)相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的,处于天然状态;

(2)蛋白的相互作用是在自然状态下进行的,可以避免人为的影响;

(3)可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物

免疫共沉淀缺点

(1)可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质-蛋白质相互作用;

(2)两种蛋白质的结合可能不是直接结合,而可能有第三者在中间起桥梁作用;

(3)必须在实验前预测目的蛋白是什么,以选择最后检测的抗体,所以,若预测不正确,实验就得不到结果,方法本身具有冒险性。

一 原理:免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation)是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。 其原理是:当细胞在非变性条件下被裂解时,完整细胞内存在的许多蛋白质-蛋白质间的相互作用被保留了下来。如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X,那么与X在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。目前多用精制的prorein A预先结合固化在argarose的beads上,使之与含有抗原的溶液及抗体反应后,beads上的prorein A就能吸附抗原达到精制的目的。这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合;也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档。

其优点为:(1)相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的,处于天然状态;(2)蛋白的相互作用是在自然状态下进行的,可以避免人为的影响;(3)可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物。缺点为:(1)可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质-蛋白质相互作用;

(2)两种蛋白质的结合可能不是直接结合,而可能有第三者在中间起桥梁作用; (3)必须在实验前预测目的蛋白是什么,以选择最后检测的抗体,所以,若预测不正确,实验就得不到结果,方法本身具有冒险性。

二、准备工作:

预冷PBS,RIPA Buffer,细胞刮子(用保鲜膜包好后,埋冰下),离心机

1. 用预冷的PBS洗涤细胞两次,最后一次吸干PBS;

2. 加入预冷的RIPA Buffer(1ml/107个细胞、10cm培养皿或150cm2培养瓶,0.5ml/5×106个细胞、6cm培养皿、75cm2培养瓶)

3. 用预冷的细胞刮子将细胞从培养皿或培养瓶上刮下,把悬液转到1.5EP管中,4℃,缓慢晃动15min(EP管插冰上,置水平摇床上)

4. 4℃,14000g离心15min,立即将上清转移到一个新的离心管中

5. 准备Protein A agarose,用PBS 洗两遍珠子,然后用PBS配制成50%浓度,建议减掉枪尖部分,避免在涉及琼脂糖珠的操作中破坏琼脂糖珠

6. 每1ml总蛋白中加入100μl Protein A琼脂糖珠(50%),4℃摇晃10min(EP管插冰上,置水平摇床上),以去除非特异性杂蛋白,降低背景

7. 4℃,14000g离心15min,将上清转移到一个新的离心管中,去除Protein A珠子

8. (Bradford 法)做蛋白标准曲线,测定蛋白浓度,测前将总蛋白至少稀释1:10倍以上,以减少细胞裂解液中去垢剂的影响(定量,分装后,可以在-20℃保存一个月)

9. 用PBS将总蛋白稀释到约1 μg/μl,以降低裂解液中去垢剂的浓度,如果兴趣蛋白在细胞中含量较低,则总蛋白浓度应该稍高(如10 μg/μl)

10. 加入一定体积的兔抗到500μl总蛋白中,抗体的稀释比例因兴趣蛋白在不同细胞系中的多少而异

11. 4℃缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或室温2h,激酶或磷酸酯酶活性分析建议用2 h室温孵育

12. 加入100μl Protein A琼脂糖珠来捕捉抗原抗体复合物,4℃缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或室温1h,如果所用抗体为鼠抗或鸡抗,建议加2 μl"过渡抗体"(兔抗鼠IgG,兔抗鸡IgG)

13. 14000rpm瞬时离心5s,收集琼脂糖珠-抗原抗体复合物,去上清,用预冷的RIPA buffer洗3遍,800μl/遍,RIPA buffer有时候会破坏琼脂糖珠-抗原抗体复合物内部的结合,可以使用PBS

14. 用60μl 2×上样缓冲液将琼脂糖珠-抗原抗体复合物悬起,轻轻混匀,缓冲液的量依据上样多少的需要而定(60 μl足够上三道)

15. 将上样样品煮5min,以游离抗原,抗体,珠子,离心,将上清电泳,收集剩余琼脂糖珠,上清也可以暂时冻-20℃,留待以后电泳,电泳前应再次煮5min变性。

RIPA Buffer配制:

基础成分:

Tris-HCl(缓冲液成分,防止蛋白变性)

NaCl(盐份,防止非特异蛋白聚集)

NP-40(非离子去污剂,提取蛋白;用H2O配制成10%储存液)

去氧胆酸钠(离子去污剂,提取蛋白;用H2O配制成10%储存液;避光保存)

注意:准备激酶(致活酶)实验时,不要加去氧胆酸钠,因为离子型去污剂能够使酶变性,导致活性丧失。

RIPA蛋白酶抑制剂

苯甲基磺酰氟(PMSF)(用异丙醇配制成200mM的储存液,室温保存)

EDTA(钙螯合剂;用H2O配制成100mM的储存液,PH 7.4)

亮抑酶肽(Leupeptin)(用H2O配制成1mg/ml的储存液,分装,-20℃保存)

抑蛋白酶肽(Aprotinin)(用H2O配制成1mg/ml的储存液,分装,-20℃保存)

胃蛋白酶抑制剂(Pepstatin)(用甲醇配制成1mg/ml的储存液,分装,-20℃保存) RIPA磷酸(酯)酶抑制剂

激活的Na3VO4(用H2O配制成200mM的储存液,见Sodium Orthovanadate Activation Protoco)

NaF(200mM的储存液,室温保存)

注意:在准备做磷酸(酯)酶实验的时候,不加磷酸酯酶抑制剂

工作液配制:

配制100ml的modified RIPA buffe:

1. 称取790mg 的Tris-Base,加到75ml 去离子水中,加入900mg的NaCl,搅拌,直到全部溶解,用HCl调节PH值到7.4

2. 加10 ml 10%的NP-40

3. 加2.5 ml 10%的去氧胆酸钠,搅拌,直到溶液澄清

4. 加1 ml 100mM的EDTA,用量筒定容到100ml,2-8℃保存

5. 理论上,蛋白酶和磷酸酯酶抑制剂应该在使用当天同时加入(抑蛋白酶肽,亮抑酶肽,胃蛋白酶抑制剂各100 μl; PMSF, Na3VO4, NaF各500 μl),但是PMSF在水溶液中很不稳定,30分钟就会降解一半,所以PMSF应该在使用前现加,其他抑制剂成分可以在水溶液中稳定5天。

各种成分在工作液中的终浓度:

* Tris-HCl: 50 mM, pH 7.4

* NP-40: 1%

* 去氧胆酸钠:0.25%

* NaCl: 150 mM

* EDTA: 1 mM

* PMSF: 1 mM

* 抑蛋白酶肽,亮抑酶肽,胃蛋白酶抑制剂: 各1 μg/ml

* Na3VO4: 1 mM

* NaF: 1 mM

三、实验流程为:

(1)转染后24-48 h 可收获细胞,加入适量细胞裂解缓冲液(含蛋白酶抑制剂),冰上裂解30min, 细胞裂解液于4°C, 最大转速离心30 min后取上清;

(2)取少量裂解液以备Western blot分析,剩余裂解液加1μg相应的抗体加入到细胞裂解液,4°C缓慢摇晃孵育过夜;

(3)取10μl protein A 琼脂糖珠,用适量裂解缓冲液洗3 次,每次3,000 rpm离心3 min;

(4)将预处理过的10μl protein A 琼脂糖珠加入到和抗体孵育过夜的细胞裂解液中4°C缓慢摇晃孵育2-4h,使抗体与protein A琼脂糖珠偶连;

(5)免疫沉淀反应后,在4°C 以3,000 rpm 速度离心3 min,将琼脂糖珠离心至管底;将上清小心吸去,琼脂糖珠用1ml裂解缓冲液洗3-4次;最后加入15μl的2×SDS 上样缓冲液,沸水煮5分钟;

(6)SDS-PAGE, Western blotting或质谱仪分析。通过免疫共沉淀确定结合蛋白

1.用磷酸盐缓冲液洗30块10 cm培养板上的适宜细胞。刮去每块板上的细胞到1 ml冰冷的EBC裂解缓冲液中。

2.将每毫升细胞悬液转移到微量离心管中,在微量离心机上4℃以最大速度离心15 min。

3.收集上清(约30 ml)并加入30μg的适当抗体,4℃摇动免疫沉淀物1 h。

4.加入0.9 ml的蛋白质A-Sepharose 悬液,4℃摇动免疫沉淀物30 min。

5.用含900 mmol/L NaCl的NETN洗蛋白A-Sepharose混合物,再重复洗5次。最后,用

NETN洗一次。

6.吸出混合物的液体部分。加入800μl的1×SDS胶加样缓冲液到球珠中,煮沸4 min。

7.将样品加入到大孔的不连续SDS-PAGE梯度胶中,在10 mA的恒定电流下电泳过夜。

8.通过考马斯蓝染色观察蛋白质泳带。

9.从胶上切下目标带,将其放到微量离心管中,用1ml 50%乙腈洗两次,每次3 min。

10. 用胰蛋白酶消化胶中的蛋白质,再将肽电洗脱。

11. 通过窄孔高效液相色谱分离肽。将收集的肽在ABI 477A或494A机器上进行自动Edman降解测序。

四、注意的问题:

(1)细胞裂解采用温和的裂解条件,不能破坏细胞内存在的所有蛋白质-蛋白质相互作用,多采用非离子变性剂(NP40 或Triton X-100)。每种细胞的裂解条件是不一样的,通过经验确定。不能用高浓度的变性剂(0.2%SDS),细胞裂解液中要加各种酶抑制剂,如商品化的 cocktailer。

(2)使用明确的抗体,可以将几种抗体共同使用

(3)使用对照抗体:

单克隆抗体:正常小鼠的IgG或另一类单抗

兔多克隆抗体:正常兔IgG

在免疫共沉淀实验中要保证实验结果的真实性,应注意以下几点:

(1) 确保共沉淀的蛋白是由所加入的抗体沉淀得到的,而并非外源非特异蛋白,单克隆抗体的使用有助于避免污染的发生;

(2) 要确保抗体的特异性,即在不表达抗原的细胞溶解物中添加抗体后不会引起共沉淀;

(3) 确定蛋白间的相互作用是发生在细胞中,而不是由于细胞的溶解才发生的,这需要进行蛋白质的定位来确定。

染色质免疫共沉淀技术(ChIP)

真核生物的基因组DNA以染色质的形式存在。因此,研究蛋白质与DNA在染色质环境下的相互作用是阐明真核生物基因表达机制的基本途径。染色质免疫沉淀技术(chromatin immunoprecipitation assay, CHIP)是目前唯一研究体内DNA与蛋白质相互作用的方法。它的基本原理是在活细胞状态下固定蛋白质-DNA复合物,并将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段,然后通过免疫学方法沉淀此复合体,特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段,通过对目的片断的纯化与检测,从而获得蛋白质与DNA相互作用的信息。CHIP不仅可以检测体内反式因子与DNA的动态作用,还可以用来研究组蛋白的各种共价修饰与基因表达的关系。而且,CHIP与其他方法的结合,扩大了其应用范围:CHIP与基因芯片相结合建立的CHIP-on-chip方法已广泛用于特定反式因子靶基因的高通量筛选;CHIP与体内足迹法相结合,用于寻找反式因子的体内结合位点;RNA-CHIP用于研究RNA在基因表达调控中的作用。由此可见,随着CHIP的进一步完善,它必将会在基因表达调控研究中发挥越来越重要的作用。

染色体免疫共沉淀(Chromatin Immunoprecipitation,ChIP)是基于体内分析发展起来的方法,也称结合位点分析法,在过去十年已经成为表观遗传信息研究的主要方法。这项技术帮助研究者判断在细胞核中基因组的某一特定位置会出现何种组蛋白修饰。ChIP不仅可以检测体内反式因子与DNA的动态作用,还可以用来研究组蛋白的各种共价修饰与基因表达的关系。近年来,这种技术得到不断的发展和完善。采用结合微阵列技术在染色体基因表达调控区域检查染色体活性,是深入分析癌症、心血管疾病以及中央神经系统紊乱等疾病的主要代谢通路的一种非常有效的工具。

染色质免疫共沉淀原理

它的原理是在保持组蛋白和DNA联合的同时,通过运用对应于一个特定组蛋白标记的生物抗体,染色质被切成很小的片断,并沉淀下来。IP是利用抗原蛋白质和抗体的特异性结合以及细菌蛋白质的“prorein A”特异性地结合到免疫球蛋白的FC片段的现象活用开发出来的方法。目前多用精制的prorein A预先结合固化在argarose的beads上,使之与含有抗原的溶液及抗体反应后,beads上的prorein A就能吸附抗原达到精制的目的。实验最需要注意点就是抗体的性质。抗体不同和抗原结合能力也不同,免染能结合未必能用在IP反应。建议仔细检查抗体的说明书。特别是多抗的特异性是问题。其次,要注意溶解抗原的缓冲液的性质。多数的抗原是细胞构成的蛋白,特别是骨架蛋白,缓冲液必须要使其溶解。为此,必须使用含有强界面活性剂的缓冲液,尽管它有可能影响一部分抗原抗体的结合。另一面,如用弱界面活性剂溶解细胞,就不能充分溶解细胞蛋白。即便溶解也产生与其它的蛋白结合的结果,抗原决定族被封闭,影响与抗体的结合,即使IP成功,也是很多蛋白与抗体共沉的悲惨结果。再次,为防止蛋白的分解,修饰,溶解抗原的缓冲液必须加蛋白每抑制剂,低温下进行实验。每次实验之前,首先考虑抗体/缓冲液的比例。抗体过少就不能检出抗原,过多则就不能沉降在beads上,残存在上清。缓冲剂太少则不能溶解抗原,过多则抗原被稀释。

ChIP的一般流程

ChIP的一般流程:

甲醛处理细胞---收集细胞,超声破碎---加入目的蛋白的抗体,与靶蛋白-DNA复合物相互结合---加入ProteinA,结合抗体-靶蛋白-DNA复合物,并沉淀---对沉淀下来的复合物进行清洗,除去一些非特异性结合---洗脱,得到富集的靶蛋白-DNA复合物---解交联,纯化富集

的DNA-片断---PCR分析。

在PCR分析这一块,比较传统的做法是半定量-PCR。但是现在随着荧光定量PCR的普及,大家也越来越倾向于Q-PCR了。此外还有一些由ChIP衍生出来的方法。例如RIP(其实就是用ChIP的方法研究细胞内蛋白与RNA的相互结合,具体方法和ChIP差不多,只是实验过程中要注意防止RNase,最后分析的时候需要先将RNA逆转录成为cDNA);还有ChIP-chip(其实就是ChIP富集得到的DNA-片段,拿去做芯片分析,做法在ChIP的基础上有所改变,不同的公司有不同的做法,要根据公司的要求来准备样品)。

具体操作流程:

第一天:

(一)、细胞的甲醛交联与超声破碎。

1、取出1平皿细胞(10cm平皿),加入243 ul 37%甲醛,使得甲醛的终浓度为1%(培养基共有9ml)。

2、37摄氏度孵育10min。

3、终止交联:加甘氨酸至终浓度为0.125M。450 ul 2.5M甘氨酸于平皿中。混匀后,在室温下放置5min即可。

4、吸尽培养基,用冰冷的PBS清洗细胞2次。

5、细胞刮刀收集细胞于15ml离心管中(PBS依次为5ml,3ml和3ml)。预冷后2000rpm 5min收集细胞。

6、倒去上清。按照细胞量,加入SDS Lysis Buffer。使得细胞终浓度为每200ul含2×106个细胞。这样每100ul溶液含1×106个细胞。再加入蛋白酶抑制剂复合物。假设MCF7长满板为5×106个细胞。本次细胞长得约为80%。即为4×106个细胞。因此每管加入400ul SDS Lysis Buffer。将2管混在一起,共800ul。

7、超声破碎:VCX750,25%功率,4.5S冲击,9S间隙。共14次。

(二)、除杂及抗体哺育。

8、超声破碎结束后,10,000g 4oC离心10min。去除不溶物质。

留取300ul做实验,其余保存于-80oC。

300ul中,100ul加抗体做为实验组;100ul不加抗体做为对照组;100ul加入4ul5MNaCl(NaCl终浓度为0.2M),65oC处理3h解交联,跑电泳,检测超声破碎的效果。

9、在100ul的超声破碎产物中,加入900ulChIPDilutionBuffer和20ul的50×PIC。 再各加入60ulProteinAAgarose/SalmonSpermDNA。4oC颠转混匀1h。

10、1h后,在4oC静置10min沉淀,700rpm离心1min。

11、取上清。各留取20ul做为input。一管中加入1ul抗体,另一管中则不加抗体。4oC颠转过夜。

(三)、检验超声破碎的效果。

取100ul超声破碎后产物,加入4ul5

MNaCl,65oC处理2h解交联。分出一半用酚/氯仿抽提。电泳检测超声效果。

第二天:

(一)、免疫复合物的沉淀及清洗。

12、孵育过夜后,每管中加入60ulProteinAAgarose/SalmonSpermDNA。4oC颠转2h。 13、4oC静置10min后,700rpm离心1min。除去上清。

14、依次用下列溶液清洗沉淀复合物。清洗的步骤:加入溶液,在4oC颠转10min,4oC

静置10min沉淀,700rpm离心1min,除去上清。

洗涤溶液:a.low salt wash buffer-one wash

b.highsalt wash buffer-one wash

c.LiCl wash buffer-one wash

d.TE buffer-two wash

15、清洗完毕后,开始洗脱。洗脱液的配方:100ul10%SDS,100ul1MNaHCO3,800ulddH2O,共1ml。

每管加入250ul洗脱buffer,室温下颠转15min,静置离心后,收集上清。重复洗涤一次。最终的洗脱液为每管500ul。

16、解交联:每管中加入20ul 5M NaCl(NaCl终浓度为0.2M)。

混匀,65oC解交联过夜。

第三天:

(一)、DNA样品的回收

17、解交联结束后,每管加入1ulRNaseA(MBI),37oC孵育1h。

18、每管加入10ul0.5MEDTA,20ul1MTris.HCl(PH6.5),2ul10mg/ml蛋白酶K。 45oC处理2h。

19、DNA片段的回收----omega胶回收试剂盒。最终的样品溶于100ulddH2O。

(二)、PCR分析

ChIP-chip技术对于大规模挖掘顺式调控信息成绩卓著,同时它可以用于胚胎干细胞和一些疾病如癌症、心血管疾病和中央神经紊乱的发生的机制。研究人员还可以利用这项技术开发一些治疗方法。目前ChIP-chip技术研究主要集中于两个领域:及转录因子的结合和条件特异性;组蛋白的修饰,组蛋白修饰蛋白和染色体重建。

ChIP-chip在描述转录结合因子动力学中的研究、染色体结构组分的分布、在组蛋白的修饰、组蛋白修饰蛋白和染色体重建中的应用也十分广泛。ChIP-chip 技术的优点是,可以在体内进行反应;在给定的检验细胞环境的模式下得到DNA相互关系的简单影像;使用特异性修正抗体鉴定与包含有一个特异性后转录修正的蛋白质的相关位点;直接或者间接(通过蛋白质与蛋白质的相互作用)的鉴别基因组与蛋白质的相关位点。缺点是:需要一个特异性蛋白质抗体,有时难于获得;为了获得高丰度的结合片段,必须实验演示胞内条件下靶标蛋白质的表达情况;调控蛋白质的基因的获取可能需要限制在组织来源中。

总之,ChIP-chip 技术的发展为析活细胞或组织中DNA与蛋白质的相互关系提供了一个极为有力的工具。在未来的研究中,将对芯片的构建进行改进,提高其实用性。使用易于获得抗体,增加这种方法的可用性。

CHIP-seq

染色质免疫共沉淀技术(Chromatin Immunoprecipitation,ChIP)也称结合位点分析法,是研究体内蛋白质与DNA相互作用的有力工具,通常用于转录因子结合位点或组蛋白特异性修饰位点的研究。将ChIP与第二代测序技术相结合的ChIP-Seq技术,能够高效地在全基因组范围内检测与组蛋白、转录因子等互作的DNA区段。

ChIP-Seq的原理是:首先通过染色质免疫共沉淀技术(ChIP)特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段,并对其进行纯化与文库构建;然后对富集得到的DNA片段进行高通量测序。研究人员通过将获得的数百万条序列标签精确定位到基因组上,从而获得全基因组范围内与组蛋白、转录因子等互作的DNA区段信息。

技术应用

该技术主要应用于:

1.组蛋白修饰酶的抗体作为“生物标记”

2.转录调控分析

3.药物开发研究

4.有丝分裂研究

5.DNA损失与凋亡分析

免疫沉淀技术

免疫沉淀技术

技术简介:

蛋白质作为生命形态中最重要的分子,一直以来都是全球科学家们研究的焦点。免疫沉淀技术是以抗体与抗原间的专一性为基础用于研究蛋白质相互作用的经典方法,也是确定两种蛋白质在细胞内相互性生理作用的有效方法。表现为可溶性抗原与相应抗体在液相或凝胶中特异性结合后,形成的免疫复合物在一定条件下出现蛋白质析出。免疫沉淀与凝集反应、中和反应、补体参与的抗原抗体反应并称经典免疫学技术。随着对蛋白质研究的不断深入,人们将免疫沉淀方法与其他方法相结合,在其基础上衍生出很多更为复杂的技术,使蛋白质分析方法更为多样化,应用范围更为广泛。该技术现已广泛应用于基因、蛋白质以及其相互作用等研究领域。

免疫沉淀技术的发展 :

免疫沉淀技术的基本策略就是利用抗体与相应抗原的高亲和力特性检出和结合溶液中靶分子。免疫沉淀技术从诞生起就一直随着科技的发展而进步。早期,研究人员利用凝胶电泳分辨免疫沉淀蛋白,将抗原溶液加入琼脂糖之类的可渗透基质的小孔内,并在邻近孔内加入抗血清,随着抗原抗体扩散,大分子进入凝胶内,两者相互作用,形成由多个抗体分子与抗原桥联组成的复合物,通过抗体和抗原的扩散形成浓度梯度,并在最适浓度处形成多分子网络复合物,最终大分子蛋白复合物从溶液中析出形成肉眼可见的沉淀线。免疫沉淀的早期改进方向是促进多聚体反应,使免疫复合物从溶液中析出。随后,研究人员发现利用第二抗体与免疫复合物中的抗体形成网络结构,可以不必对每种抗原的第一抗体进行滴定实验,这种方法一直沿用至今。20世纪70年代中期,人们开始采用固相反应,利用固定在金黄色葡萄球菌表面的蛋白A吸附抗体,再与相应抗原结合。随着科技的发展,目前这种方法已改进为利用表面固定了蛋白A或蛋白G的微球来分离抗原抗体复合物,以达到检测抗原或目标蛋白的目的。

免疫沉淀技术的分类 :

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狸”的口号是把高端产品做成常规,把常规产品做到极致。海狸公司的

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清样品中分离出纯度大于90%的抗体。 海狸纳米市场部

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免疫沉淀原理

免疫沉淀(Immunoprecipitation, IP)原理

IP是利用抗原蛋白质和抗体的特异性结合以及细菌蛋白质的“protein A/G

免疫沉淀实验的操作步骤比较多,同时由于在非变性条件下进行实验,所以要得到一个完美的实验结果,不仅需要高质量的抗体,同时对免疫沉淀体系也需要有严格的控制指标。免疫沉淀实验从:蛋白样品处理;抗体-agarose beads孵育;抗体-agarose beads复合物洗涤到最后的鉴定,每步都非常关键,需要严格控制实验流程中每个关键步骤的质量,才能最终达到你的实验目的。

IP实验步骤

基本实验步骤

(1)收获细胞,加入适量细胞IP裂解缓冲液(含蛋白酶抑制剂),冰上或者4℃裂解30min, 12,000g离心30 min后取上清;

(2) 取少量裂解液以备Western blot分析,剩余裂解液将1μg相应的抗体和10-50 μl protein A/G-beads加入到细胞裂解液,4°C缓慢摇晃孵育过夜;

(3)免疫沉淀反应后,在4°C 以3,000 g速度离心5 min,将protein A/G-beads离心至管底;将上清小心吸去,protein A/G-beads用1ml裂解缓冲液洗3-4次;最后加入15μl的2×SDS 加样缓冲液,沸水煮10分钟;

(4)SDS-PAGE, Western blotting或进行质谱分析。一、 样品处理:

免疫沉淀实验成功与否,第一步处理样品非常关键。免疫沉淀实验本质上是处于天然构象状态的抗原和抗体之间的反应,而样品处理的质量决定了抗原抗体反应中的抗原的质量,浓度以及抗原是否处于天然构象状态。所以制备高质量的样品以用于后续的抗体-agarose beads孵育对免疫沉淀实验是否成功非常关键。在这个环节中,除了要控制所有操作尽量在冰上或者4°完成外,最为关键的是裂解液的成份。

用于免疫沉淀实验的样品一般是原代培养细胞裂解液或者细胞系裂解液。我们以常用的RIPA裂解液为例(主要含有pH7.4左右的离子缓冲液,接近生理浓度下的NaCl,一定比例的去垢剂和甘油以及各类蛋白酶抑制剂等)来说明其各主要成份的用途,进而帮助我们如何针对不同的实验目的和不同的蛋白质特性来选择最佳的裂解液。

a. 缓冲液:离子缓冲液常采用pH7.4的Hepes或者Tris-Cl。

b. NaCl浓度一般习惯用150 mM,这主要是因为150 mM接近生理浓度,不会破坏蛋白质之间的相互作用。然而细胞内部的NaCl浓度并不是均一的,局部NaCl的浓度可以低到50 mM,150 mM的NaCl有可能会破坏这个区域的蛋白质相互作用。因此裂解液配方最佳的NaCl浓度要视所分析的蛋白的亚细胞定位而定。

c. 甘油由于其粘性,可以对蛋白质之间的相互作用起到一个很好的保护作用。一般添加10%的甘油有助于稳定蛋白质之间的相互作用。

d. 裂解液中的去垢剂可以裂解细胞质膜,也同时破坏了许多细胞器的膜,从而释放了其中储存的许多蛋白酶。而由于用于免疫沉淀实验的去垢剂作用比较温和,因此蛋白酶的活性大部分得以保存。还有一部分蛋白酶来自胞质中,主要由于其抑制蛋白或者其活性抑制环境受到改变后从而恢复了蛋白酶活性。因此,添加蛋白酶抑制剂对于防止目的蛋白的降解从而完成免疫沉淀实验非常关键。一般主要通过添加EDTA抑制金属蛋白酶,通过Protease Cocktail(多种蛋白酶抑制剂混合物)可以抑制蛋白酶。

e. 去垢剂对于免疫沉淀实验尤其是免疫共沉淀实验是一个非常关键的因素。不同的去垢剂种类和不同的去垢剂浓度主要通过影响以下三个因素来影响免疫沉淀效果:

- 细胞质/器膜的通透性:因为许多目的蛋白都定位在细胞器中,所以必须先将这些蛋白释放出来,抗体才能与之反应。

- 膜蛋白的释放:许多膜蛋白的构象对去垢剂种类和浓度非常敏感,因此针对这类蛋白的免疫沉淀实验,需要谨慎地尝试多种去垢剂以及不同浓度。

- 蛋白相互作用:不同去垢剂对不同性质的蛋白质的相互作用影响程度不一样,需要根据具体蛋白的特性进行分析选择去垢剂种类和浓度。而由于何种去垢剂适应作用于何种蛋白质现在很难精准预测,所以一个更为切实可行的办法就是通过具体实验筛选合适的去垢剂种类和浓度。

二、 抗体-agarose beads孵育

裂解细胞,离心并去除不可溶的膜组份后,上清可以储存在-80°保存3个月,但最好能够使用新鲜制备的细胞裂解液上清去进行抗体-agarose beads孵育实验。抗体可以先加入上清中与样品孵育数小时后再加入Protein A或者G beads孵育过夜,也可以同时加入抗体和Protein A或者G beads孵育过夜。一般选择1mg总蛋白(1mg/ml)对应添加1 ug抗体,最高可以添加至5 ug抗体,过多的抗体会产生假阳性。这个步骤中关键因素在于选择合适的阴性对照。一般选用加同样量的IgG,但更为妥当的方法是选择针对胞内其它无关目的蛋白的一抗做对照。例如,做膜蛋白A的免疫沉淀,选择膜蛋白B来做阴性对照,只要确认二者之间没有相互作用;而做胞质可溶性蛋白C的免疫沉淀,则选择另外一个可溶性蛋白D来做阴性对照。同时,为避免Protein A或者G beads有(非)特异性吸附从而造成免疫沉淀实验结果的假阳性,一般在加入目的蛋白抗体之前,预先将Protein A或者G beads与细胞裂解液孵育数小时,然后取上清用于后续的抗体-agarose beads孵育。

同时,Protein A或者G beads对不同类型的抗体亲和力不同,结合一抗的种属和Ig亚型,选择合适的Protein A或者G beads也是决定免疫沉淀实验成功与否的一个重要因素。一般推荐使用Protein A和Protein G beads的混合物,这样可以达到最佳实验效果,而且省去了许多选择

的烦恼。三、 抗体-agarose beads复合物洗涤:

除了选择特异性好的抗体以及选择合适的阴性对照外,去除免疫沉淀实验非特异性的一个办法是对抗体-agarose beads复合物进行多次洗涤。一般洗涤缓冲液使用和裂解液一样的配方,但去除甘油,以减少由于甘油的粘性带来的非特异性吸附。针对不同的实验要求,还可以通过更改NaCl的浓度以及去垢剂的比例,种类来达到去除非特异性吸附的效果。例如,针对单纯的免疫沉淀而非免疫共沉淀实验或者虽然是进行免疫共沉淀实验,但蛋白质之间的结合比较牢靠,可以考虑使用低浓度(0.2-0.5%)的SDS洗涤抗体-agarose beads复合物,这样可以去除绝大部分非特异性相互作用。四、 鉴定

免疫沉淀实验用途非常广泛(见IP: Q&A),而且基于最基本的免疫沉淀实验衍生出了许多免疫沉淀相关实验手段(比如免疫共沉淀,染色质免疫沉淀和RNA-蛋白免疫沉淀),因此,免疫沉淀实验的鉴定方法主要视实验目的而定。

我们在本手册中主要简单概述常见的免疫沉淀之后的WB检测需要注意的实验环节。由于免疫沉淀实验使用目的蛋白抗体加Protein A/G beads与样品孵育,因此在最后离心获得抗体-agarose beads复合物后,eppendorf管中主要含有抗体,目的蛋白,Protein A/G beads以及一些其它非特异性作用蛋白。其中,抗体和目的蛋白以及Protein A/G beads三者之间是以非共价健结合在一起,只有Protein A/G与agarose beads是共价结合在一起的。因此,最后经过添加含巯基乙醇的加样缓冲液以及煮沸变性并离心出去Protein A/G beads后,eppendorf管只有抗体和目的蛋白以及少量非特异性吸附蛋白。这样SDS-PAGE中就含有目的蛋白和抗体二种蛋白,由于加样缓冲液中含有巯基乙醇从而导致抗体的重链与轻链之间的二硫键被破坏从而使得抗体分子变成重链分子(55KD)和轻链分子(25KD)。因此,WB显色反应中除了能检测到目的蛋白外,如果所使用的二抗与用于免疫沉淀实验的抗体分子属于同一种属的话,还能检测到重链和轻链分子。通常用于免疫沉淀的抗体量非常大(1ug),所以当目的蛋白的大小接近重链或者轻链分子时,重链或者轻链分子的WB信号常常由于信号过强而导致影响对目的蛋白的WB结果判断。 针对上述情况,通常有二种解决办法:

a. 选择不同种属的抗体分别进行免疫沉淀实验和WB实验,这样再选择一个种属交叉反应比较弱或者无种属交叉反应的二抗进行WB实验,就可以大大减弱重链和轻链分子的WB信号。

b. 使用交联剂将抗体和Protein A/G beads交联,然后通过添加不含巯基乙醇的加样缓冲液处理目的蛋白-抗体-agarose beads复合物,最后离心去除抗体-agarose beads复合物,上清中只留下目的蛋白。

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免疫沉淀反应(刘江涌)21段

免疫沉淀反应,Western印迹法和共免疫沉淀

根据厂商的指示,依靠Grb2, CrkII, Nck2或者PNRC抗体的抗体免疫沉淀反应实验的进行需要使用免疫沉淀试剂盒(蛋白A)(罗氏分子生化药剂,曼海姆,德国)。简单地说,细胞裂解液(冰冻, 50mM Tris-HCl, pH 7.5, 150mM NaCl,1% Nonidet P40, 0.5% 脱氧胆酸钠,以及整套蛋白酶抑制剂的混合物)被添加到经PBS洗过的细胞上。经过20分钟的冰敷后,将细胞刮下,转移至微量离心管,声波处理,然后在4摄氏度、12000的离心力下离心10分钟。用来进行免疫沉淀反应和共反应沉淀的细胞裂解物量分别为2mg,15mg。为了减少本底,将小份溶菌液和50微升蛋白A均匀琼脂悬浮液混合,然后在2至8摄氏度的摇摆平台上培育一夜。用12000g、4摄氏度的离心机离心20s来清除琼脂糖微球。接下来用上清液来培育特定抗体,这需要Grb2,CrkII, Nck2(1:1000稀释,圣克鲁斯生物技术公司,Inc.,Santa Cruz, CA, USA),或者PNRC抗血清(1:500稀释),或者非特异性的免疫球蛋白G(1:1000稀释,杰克逊Immunoresearch实验室),或者rabbit preserum(1:500稀释)作为一种control(control不知道是对照还是抑制还是调控),并且轻轻的在41度下摇晃1小时。在2-8度下,将五十微升的蛋白A的均质琼脂糖悬液添加到摇摆平台上来进一步培养。在4度下,用12000g的离心力离心20秒来收集免疫复合物。沉淀颗粒的洗涤每次都要用三种洗涤缓冲液,洗涤液1(和细胞裂解液相同),洗涤液2(冰冻,50mM Tris-HCl, pH 7.5, 500mM NaCl, 0.1% Nonidet P40, 0.05% 脱氧胆酸钠)。沉淀颗粒用凝胶加样缓冲液洗脱,在一个12% 的SDS– PAGE上进行分离,并用Western印迹法检验,使用Grab2抗体或者PNRC抗血清中的任意一个。免疫蛋白复合体被1:1000稀释的山羊抗兔辣根过氧化物酶共轭(皮尔斯化工有限公司)检测到,紧接着的是二氨基联苯胺(二氨基联苯胺盐酸盐,西格玛)的底物显谱。

免疫沉淀SOP

免疫沉淀(Immunoprecipitation)SOP

免疫沉淀技术通常是用于初步鉴定新蛋白抗原的方法之一。免疫沉淀、SDS-PAGE和免疫印迹结合,可以测量蛋白的相对分子量,观察蛋白质之间的相互作用,检测其翻译后修饰的调控,或确定蛋白质降解的速率。此方法是收集有关新抗原,为进一步分析其特性应用最为广泛的方法之一。

一、实验流程(以七鳃鳗血清为例)

1.将七鳃鳗血清放在冰水中融化

注:①在整个操作过程中,应尽量保证在冰水或4℃中进行。

②血清融化后,将血清10000 r/min,10min离心,因为血清中可能存在胶原蛋白,这样处理过以后,取上清以排除后续实验受到胶原蛋白的干扰。

2.取少量血清以备Western blot分析,剩余血清取出一部分与抗体混匀,并在4℃旋转混合孵育,2h~过夜(同时应该以同样条件设计一组空白对照和无关抗体的对照)。 注:①凭个人经验一般是5μl左右的血清混入10μg左右的抗体,这个比例是可以将血清中相应蛋白沉淀下来。当然,当遇到不同蛋白时还应当根据当时的情况具体分析。 ②有时候血清与抗体混合时,要加入一定比例的PBS来补充到一定的体系,所以在设置空白和无关抗体对照时,也应以加入相同比例的PBS,这样可以保持整个反应体系的一致性,以便于最终上样也保持一致。

③在设置无关抗体对照时,还应当保证抗体来源种属的一致,即如果你选择的特异性抗体为兔源的,那你无关抗体最好选用未免疫兔子的血清纯化的抗体。

3.在血清抗体混合液中加入proteinA/G agaroge beads, 4℃旋转混合孵育,4h~过夜。 注:①凭个人经验,按照上面的体系,加15μl-20μl beads珠即可。理论上1ml proteinA/G agaroge beads可以结合大于18mg的人IgG。即,按照上面的体系加1μl就行了,可是这在操作上是不便于进行的。那20μl的beads有多少呢?如图,箭头所指的位置就应该是20μl的beads大致的沉淀位置。

②由于agaroge beads特别容易沉底,所以在加beads之前,一定要将其先混匀,尽量不用枪吹,用手轻轻的将其晃或弹匀。如果用枪,可以使用剪去枪头尖的200μl枪头。 ③proteinA/G agaroge beads的保存液含有20%乙醇的PBS(不同厂家的beads可能不一样)

比较容易挥发,如果样品比较多的时候,会发现在加beads的过程中,液体挥发,所以要做好及时补充保存液的准备。

4.4℃,2000r/s,5min离心,去上清。

注:在去上清时,不要将上清吸得过干,否则会把beads也吸走,造成损失,这个道理同样

适用在洗beads,吸的程度如下图。

5.用预冷的PBS,将沉淀(即抗原、抗体、琼脂糖珠复合物),4℃,2000r/s,5min洗三遍。 注:

1.漂洗时,400μl-500μl PBS即可。

2.在洗的时候千万不要将上层液体倒出EP管,一定是用枪吸出,beads非常轻,如果是倒的

话,会将beads也倒出来。

6.将沉淀液与等体积buffer混合,沸水煮5min,8000 r/min,5min。

7.取上清上样。

注:取上清时,一定要保证取的是上清,即不要把沉淀也上样,否则会造成背景的过高。

二、免疫沉淀原理

IP是利用抗原蛋白质和抗体的特异性结合以及细菌蛋白质的“protein A/G"特异性地结合到抗体(免疫球蛋白)的FC片段的现象开发出来的方法。目前多用protein A/G预先结合在argarose beads上,使之与含有抗原的溶液及抗体反应后,beads上的prorein A/G就能达到吸附抗原的目的。通过低速离心,可以从含有目的抗原的溶液中将目的抗原与其它抗原分离。

免疫沉淀实验的操作步骤比较多,同时由于在非变性条件下进行实验,所以要得到一个完美的实验结果,不仅需要高质量的抗体,同时对免疫沉淀体系也需要有严格的控制指标。免疫沉淀实验从:蛋白样品处理;抗体-agarose beads孵育;抗体-agarose beads复合物洗涤到最后的鉴定,每步都非常关键,需要严格控制实验流程中每个关键步骤的质量,才能最终达到你的实验目的。

免疫沉淀IP

免疫沉淀(Immunoprecipitation, IP)原理

IP是利用抗原蛋白质和抗体的特异性结合以及细菌蛋白质的“protein A/G"特异性地结合到抗体(免疫球蛋白)的FC片段的现象开发出来的方法。目前多用protein A/G预先结合在argarose beads上,使之与含有抗原的溶液及抗体反应后,beads上的prorein A/G就能达到吸附抗原的目的。通过低速离心,可以从含有目的抗原的溶液中将目的抗原与其它抗原分离。

免疫沉淀实验的操作步骤比较多,同时由于在非变性条件下进行实验,所以要得到一个完美的实验结果,不仅需要高质量的抗体,同时对免疫沉淀体系也需要有严格的控制指标。免疫沉淀实验从:蛋白样品处理;抗体-agarose beads孵育;抗体-agarose beads复合物洗涤到最后的鉴定,每步都非常关键,需要严格控制实验流程中每个关键步骤的质量,才能最终达到你的实验目的。

IP实验步骤

基本实验步骤

(1)收获细胞,加入适量细胞 (含蛋白酶抑制剂),冰上或者4℃裂解30min, 12,000g离心30 min后取上清;

(2) 取少量裂解液以备Western blot分析,剩余裂解液将1μg相应的抗体和10-50 μl protein A/G-beads加入到细胞裂解液,4°C缓慢摇晃孵育过夜;

(3)免疫沉淀反应后,在4°C 以3,000 g速度离心5 min,将protein A/G-beads离心至管底;将上清小心吸去,protein A/G-beads用1ml裂解缓冲液洗3-4次;最后加入15μl的2×SDS 加样缓冲液,沸水煮10分钟;

(4)SDS-PAGE, Western blotting或进行质谱分析。

一、 样品处理:

免疫沉淀实验成功与否,第一步处理样品非常关键。免疫沉淀实验本质上是处于天然构象状态的抗原和抗体之间的反应,而样品处理的质量决定了抗原抗体反应中的抗原的质量,浓度以及抗原是否处于天然构象状态。所以制备高质量的样品以用于后续的抗体-agarose beads孵育对免疫沉淀实验是否成功非常关键。在这个环节中,除了要控制所有操作尽量在冰上或者4°完成外,最为关键的是裂解液的成份。

用于免疫沉淀实验的样品一般是原代培养细胞裂解液或者细胞系裂解液。我们以常用的RIPA裂解液为例(主要含有pH7.4左右的离子缓冲液,接近生理浓度下的NaCl,一定比例的去垢剂和甘油以及各类蛋白酶抑制剂等)来说明其各主要成份的用途,进而帮助我们如何针对不同的实验目的和不同的蛋白质特性来选择最佳的裂解液。

a缓冲液:离子缓冲液常采用pH7.4的Hepes或者Tris-Cl。

b NaCl浓度一般习惯用150 mM,这主要是因为150 mM接近生理浓度,不会破坏蛋白质之间的相互作用。然而细胞内部的NaCl浓度并不是均一的,局部NaCl的浓度可以低到50 mM,150 mM的NaCl有可能会破坏这个区域的蛋白质相互作用。因此裂解液配方最佳的NaCl浓度要视所分析的蛋白的亚细胞定位而定。

c甘油由于其粘性,可以对蛋白质之间的相互作用起到一个很好的保护作用。一般添加10%的甘油有助于稳定蛋白质之间的相互作用。

d裂解液中的去垢剂可以裂解细胞质膜,也同时破坏了许多细胞器的膜,从而释放了其中储存的许多蛋白酶。而由于用于免疫沉淀实验的去垢剂作用比较温和,因此蛋白酶的活性大部分得以保存。还有一部分蛋白酶来自胞质中,主要由于其抑制蛋白或者其活性抑制环境受到

改变后从而恢复了蛋白酶活性。因此,添加蛋白酶抑制剂对于防止目的蛋白的降解从而完成免疫沉淀实验非常关键。一般主要通过添加EDTA抑制金属蛋白酶,通过Protease Cocktail(多种蛋白酶抑制剂混合物)可以抑制蛋白酶。

e去垢剂对于免疫沉淀实验尤其是免疫共沉淀实验是一个非常关键的因素。不同的去垢剂种类和不同的去垢剂浓度主要通过影响以下三个因素来影响免疫沉淀效果:

细胞质/器膜的通透性:因为许多目的蛋白都定位在细胞器中,所以必须先将这些蛋白释放出来,抗体才能与之反应。

膜蛋白的释放:许多膜蛋白的构象对去垢剂种类和浓度非常敏感,因此针对这类蛋白的免疫沉淀实验,需要谨慎地尝试多种去垢剂以及不同浓度。

蛋白相互作用:不同去垢剂对不同性质的蛋白质的相互作用影响程度不一样,需要根据具体蛋白的特性进行分析选择去垢剂种类和浓度。而由于何种去垢剂适应作用于何种蛋白质现在很难精准预测,所以一个更为切实可行的办法就是通过具体实验筛选合适的去垢剂种类和浓度。

二、抗体-agarose beads孵育

裂解细胞,离心并去除不可溶的膜组份后,上清可以储存在-80°保存3个月,但最好能够使用新鲜制备的细胞裂解液上清去进行抗体-agarose beads孵育实验。抗体可以先加入上清中与样品孵育数小时后再加入Protein A或者G beads孵育过夜,也可以同时加入抗体和Protein A或者G beads孵育过夜。

一般选择1mg总蛋白(1mg/ml)对应添加1 ug抗体,最高可以添加至5 ug抗体,过多的抗体会产生假阳性。这个步骤中关键因素在于选择合适的阴性对照。一般选用加同样量的IgG,但更为妥当的方法是选择针对胞内其它无关目的蛋白的一抗做对照。例如,做膜蛋白A的免疫沉淀,选择膜蛋白B来做阴性对照,只要确认二者之间没有相互作用;而做胞质可溶性蛋白C的免疫沉淀,则选择另外一个可溶性蛋白D来做阴性对照。同时,为避免Protein A或者G beads有(非)特异性吸附从而造成免疫沉淀实验结果的假阳性,一般在加入目的蛋白抗体之前,预先将Protein A或者G beads与细胞裂解液孵育数小时,然后取上清用于后续的抗体-agarose beads孵育。

同时,Protein A或者G beads对不同类型的抗体亲和力不同,结合一抗的种属和Ig亚型,选择合适的Protein A或者G beads也是决定免疫沉淀实验成功与否的一个重要因素。一般推荐使用Protein A和Protein G beads的混合物,这样可以达到最佳实验效果,而且省去了许多选择的烦恼。

三、抗体-agarose beads复合物洗涤:

除了选择特异性好的抗体以及选择合适的阴性对照外,去除免疫沉淀实验非特异性的一个办法是对抗体-agarose beads复合物进行多次洗涤。一般洗涤缓冲液使用和裂解液一样的配方,但去除甘油,以减少由于甘油的粘性带来的非特异性吸附。针对不同的实验要求,还可以通过更改NaCl的浓度以及去垢剂的比例,种类来达到去除非特异性吸附的效果。例如,针对单纯的免疫沉淀而非免疫共沉淀实验或者虽然是进行免疫共沉淀实验,但蛋白质之间的结合比较牢靠,可以考虑使用低浓度(0.2-0.5%)的SDS洗涤抗体-agarose beads复合物,这样可以去除绝大部分非特异性相互作用。

四、 鉴定

免疫沉淀实验用途非常广泛(见IP: Q&A),而且基于最基本的免疫沉淀实验衍生出了许多免疫沉淀相关实验手段(比如免疫共沉淀,染色质免疫沉淀和RNA-蛋白免疫沉淀),因此,免疫沉淀实验的鉴定方法主要视实验目的而定。

我们在本手册中主要简单概述常见的免疫沉淀之后的WB检测需要注意的实验环节。由于免疫沉淀实验使用目的蛋白抗体加Protein A/G beads与样品孵育,因此在最后离心获得抗体-agarose beads复合物后,eppendorf管中主要含有抗体,目的蛋白,Protein A/G beads以及一些其它非特异性作用蛋白。其中,抗体和目的蛋白以及Protein A/G beads三者之间是以非共价健结合在一起,只有Protein A/G与agarose beads是共价结合在一起的。因此,最后经过添加含巯基乙醇的加样缓冲液以及煮沸变性并离心出去Protein A/G beads后,eppendorf管只有抗体和目的蛋白以及少量非特异性吸附蛋白。这样SDS-PAGE中就含有目的蛋白和抗体二种蛋白,由于加样缓冲液中含有巯基乙醇从而导致抗体的重链与轻链之间的二硫键被破坏从而使得抗体分子变成重链分子(55KD)和轻链分子(25KD)。因此,WB显色反应中除了能检测到目的蛋白外,如果所使用的二抗与用于免疫沉淀实验的抗体分子属于同一种属的话,还能检测到重链和轻链分子。通常用于免疫沉淀的抗体量非常大(1ug),所以当目的蛋白的大小接近重链或者轻链分子时,重链或者轻链分子的WB信号常常由于信号过强而导致影响对目的蛋白的WB结果判断。

针对上述情况,通常有二种解决办法:

a. 选择不同种属的抗体分别进行免疫沉淀实验和WB实验,这样再选择一个种属交叉反应比较弱或者无种属交叉反应的二抗进行WB实验,就可以大大减弱重链和轻链分子的WB信号。

b. 使用交联剂将抗体和Protein A/G beads交联,然后通过添加不含巯基乙醇的加样缓冲液处理目的蛋白-抗体-agarose beads复合物,最后离心去除抗体-agarose beads复合物,上清中只留下目的蛋白。

免疫共沉淀

免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation)是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。

其原理是:当细胞在非变性条件下被裂解时,完整细胞内存在的许多蛋白质-蛋白质间的相互作用被保留了下来。如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X,那么与X在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合;也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档。

其优点为:(1)相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的,处于天然状态;(2)蛋白的相互作用是在自然状态下进行的,可以避免人为的影响;(3)可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物。缺点为:(1)可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质-蛋白质相互作用;(2)两种蛋白质的结合可能不是直接结合,而可能有第三者在中间起桥梁作用; (3)必须在实验前预测目的蛋白是什么,以选择最后检测的抗体,所以,若预测不正确,实验就得不到结果,方法本身具有冒险性。

实验流程为:

(1)转染后24-48 h 可收获细胞,加入适量细胞裂解缓冲液(含蛋白酶抑制剂),冰上裂解30min, 细胞裂解液于4°C, 最大转速离心30 min后取上清;

(2)取少量裂解液以备Western blot分析,剩余裂解液加1μg相应的抗体加入到细胞裂

解液,4°C缓慢摇晃孵育过夜;

(3)取10μl protein A 琼脂糖珠,用适量裂解缓冲液洗3 次,每次3,000 rpm离心3 min;

(4)将预处理过的10μl protein A 琼脂糖珠加入到和抗体孵育过夜的细胞裂解液中4°C缓慢摇晃孵育2-4h,使抗体与protein A琼脂糖珠偶连;

(5)免疫沉淀反应后,在4°C 以3,000 rpm 速度离心3 min,将琼脂糖珠离心至管底;将上清小心吸去,琼脂糖珠用1ml裂解缓冲液洗3-4次;最后加入15μl的2×SDS 上样缓冲液,沸水煮5分钟;

(6)SDS-PAGE, Western blotting或质谱仪分析。

注意的问题:

(1)细胞裂解采用温和的裂解条件,不能破坏细胞内存在的所有蛋白质-蛋白质相互作用,多采用非离子变性剂(NP40或Triton X-100)。每种细胞的裂解条件是不一样的,通过经验确定。不能用高浓度的变性剂(0.2%SDS),细胞裂解液中要加各种酶抑制剂,如商品化的cocktailer。

(2)使用明确的抗体,可以将几种抗体共同使用

(3)使用对照抗体:

单克隆抗体:正常小鼠的IgG或另一类单抗

兔多克隆抗体:正常兔IgG

在免疫共沉淀实验中要保证实验结果的真实性,应注意以下几点:

(1) 确保共沉淀的蛋白是由所加入的抗体沉淀得到的,而并非外源非特异蛋白,单克隆抗体的使用有助于避免污染的发生;

(2) 要确保抗体的特异性,即在不表达抗原的细胞溶解物中添加抗体后不会引起共沉淀;

(3) 确定蛋白间的相互作用是发生在细胞中,而不是由于细胞的溶解才发生的,这需要进行蛋白质的定位来确定。

19免疫沉淀反应IP

免疫沉淀反应

IP-Immunoprecipitation

免疫沉淀是利用抗体特异性反应纯化富集目的蛋白的一种方法。抗体与细胞裂解液或表达上清中相应的蛋白结合后,再与蛋白A/G(ProteinA/G)或二抗偶联的agaose或Sepharose珠子孵育,通过离心得到珠子-蛋白A/G或二抗-抗体-目的蛋白复合物,沉淀经过洗涤后,重悬于电泳上样缓冲液,煮沸5-10min,在高温及还原剂的作用下,抗原与抗体解离,离心收集上清,上清中包括抗体、目的蛋白和少量的杂蛋白。

主要用于抗原或者抗体的定性检测。其原理是指可溶性抗原与相应抗体在有电解质存在的情况下,按适当比例所形成的可见沉淀物现象。据此现象设计的沉淀实验主要包括絮状沉淀试验,环状沉淀试验和凝胶内的沉淀试验。凝胶内的沉淀试验依所用的实验方法又可分为免疫扩散实验和免疫电泳技术2类。

材料:1. 蛋白A 或蛋白G

2. 一抗

3. 免疫沉淀缓冲液:20 mM 磷酸钠,pH 7.5,500 mM NaCl,0.1% SDS,1% NP40,0.5% 脱氧胆酸钠 and 0.02% 叠氮化钠. (> NOTE: 50 mM 醋酸钠缓冲液,pH 5.0,. 500 mM NaCl,0.1% SDS,1% NP-40 and 0.02%叠氮化钠也可作为免疫沉淀的缓冲液,能提高蛋白G的结合功效)

4. 洗脱液:0.1 M 甘氨酸-HCl buffer,pH 2.5

5.SDS-PAGE上样缓冲液 (pH 6.8):2% SDS,62.5 mM Tris 碱,10% 甘油,2-5%2-巯基乙醇

步骤:1. 用50 μl免疫沉淀缓冲液溶解抗原,向溶液中加入1倍过量的特异性一抗。加入免疫沉淀缓冲液至样品体积为0.2 ml。一般情况下,在此体积下2-5μg的纯化抗体能够较好地形成抗原抗体复合物。

2. 样品4℃.孵育过夜。

3. 将适量的蛋白A或蛋白G加到抗原抗体复合物中(~ 50 μl of gel per 5 μg of antibody)。

4. 室温下,轻柔混匀样品,孵育2小时。

5. 用0.5ml免疫沉淀缓冲液洗蛋白A或蛋白G连接的抗原抗体复合物,离心2-3分钟,弃上清。重复此步骤至少6次。

6. 用50 μl洗脱液孵育蛋白A或蛋白G连接的抗原抗体复合物5分钟,将抗原抗体复合物从蛋白A或蛋白G上洗脱下来,离心,收集上清。另用50 μl洗脱液孵育胶5分钟,离心,收上清。将两个上清混合。

7. 立即调节蛋白样品的pH至生理值,用一种合适的、多次离心的缓冲液调节,如1.0 M Tris,pH 7.5 (10 μl of this buffer to 100 μl of the supernatant should be sufficient).

8. 将洗脱成分除盐。

9. 准备好样品待定性。

NOTE: 如果用SDS-PAGE定性蛋白质,省去步骤6-9。在完成第5步之前,用0.5ml蒸馏水洗胶。离心蛋白A或蛋白G 2-3分钟,弃上清。用25μl SDS-PAGE上样缓冲液在95°C孵育蛋白A或蛋白G连接的抗原抗体复合物5分钟。样品离心,收集上清。重复一次,汇集上清至总体积50μl。由此样品则准备妥当。

特发性多神经炎idiopathic polyneuritis 潜伏期/孵育期incubation perioc

吞噬指数index of phagocytosis 预防感染,预防传染infection prevention

数字PCR(digital PCR) 让你能够直接数出DNA分子的个数,是对起始样品的绝对定量。因此ddPCR特别适用于依靠Ct值不能很好分辨的应用领域:拷贝数变异、突变检测、基因相对表达研究(如等位基因不平衡表达)、二代测序结果验证、miRNA表达分析、单细胞基因表达分析等。

ddPCR技术是通过将微量样品作大倍数稀释和分液(partitioning),直至每个样品中所含有的待测分子数不会超过1个,再将所有样品在相同条件下进行PCR扩增,并对发生了扩增反应的样品逐个进行计数的一种技术。

数字PCR原理:PCR实际上是一个在模板DNA、引物(模板片段两端的已知序列)和四种脱氧核苷酸等存在的情况下,DNA聚合酶依赖的酶促合成反应,扩增的特异性取决于引物与模板DNA的持异结合。

整个扩增过程分三步:

1、变性:使DNA双链解离,形成两条单链;

2、退火:温度下降后模板DNA与引物按碱基配对原则互补结合,也可能存在两条模板链之间的结合,但由于引物的高浓度、结构简单等特点,结合主要发生在模板与引物之间;

3、延伸:在DNA聚合酶及镁离子等存在的条件下,从引物的3"端开始,结合单核苷酸,形成与模板链互补的新DNA链。上述几步为一个循环,从理论上讲,每经过1个循环,样本中的DNA应该增加一倍,新形成的链又可成为新一轮循环的模板。第2个循环开始后,模板链增加—倍。

仪器:伯乐生命bio-rad QX200 微滴式数字PCR (ddPCR) 系统可对DNA或RNA分子进行绝对定量分析,适用于 EvaGreen 或基于探针的数字PCR应用领域。

QX200 Droplet数字PCR(Digital PCR) 系统的应用领域:癌症生物标志物研究和拷贝数变异分析。

PFU微型生物群落监测方法(以下简称PFU法)

是应用泡沫塑料块作为人工基质收集水体中的微型生物群落,测定该群落结构与功能的各种参数,以评价水质。此外,用室内毒性试验方法,以预报工业废水和化学品对受纳水体中微型生物群落的毒性强度,为制定其安全浓度和最高允许浓度提出群落级水平的基准。 原理:微型生物群落在水生态系统中客观存在。用PFU浸泡水中,曝露一定时间后,水体中大部分微型生物种类均可群集到PFU内,挤出的水样能代表该水体中的微型生物群落。

遗传异质性: 遗传异质性(genetic heterogeneity)是指某一种遗传疾病或表型可以由不同的等位基因或者基因座突变所引起的现象。与之相对反的是基因多效性,是由某一个基因突变引起多种疾病或表型。遗传异质性分为等位基因异质性和基因座异质性。

基因座异质性病是由不同基因座的基因突变引起的,如先天性聋哑有常染色体隐性遗传、常染色体显性遗传和X连锁隐性遗传3种遗传方式。属于场染色体隐性遗传的有35个基因座位,占病例总数的68%。因此,常可见到2

个先天性聋哑患者婚配后生出并不聋哑的孩子,就是由于父母的聋哑基因不在同一基因座位所致,即一个亲代的基因型为AAbb,另一个亲代的基因型为aaBB,两个亲代都是某基因座的纯合子患者,但他们子女的基因型为AaBb,在两个基因座位上均为杂合子,故表现正常。

等位基因异质性是指某一遗传病是由同一基因座上的不同突变引起的,如β地中海贫血,既可能是由于β珠蛋白基因点突变所致的RNA加工障碍或转录调控区改变引起的,也可能是由于β珠蛋白基因缺失引起的

骨髓增生异常综合症( myelodysplastic syndrome, MDS):是一组起源于造血髓系定向干细胞或多能干细胞的异质性克隆性疾患,主要特征是无效造血和高危演变为急性髓系白血病,临床表现为造血细胞在质和量上出现不同程度的异常变化。其具体临床表现为贫血,可伴有感染或出血,部分病人可无症状。部分患者可有肝,脾,淋巴结轻度肿大,少数患者可有胸骨压痛,肋骨或四肢关节痛。血象可呈全血细胞减少,或任何一系及二系血细胞减少。 1982年由FAB协作组建议确立病名,并将MDS分为五型:难治性贫血;难治性贫血伴环状铁粒幼细胞增多;难治性贫血伴原始细胞增多,转变中的难治性贫血伴原始细胞增多;慢性粒-单核细胞白血病。

MDS分型:1982年FAB协作组首先倡导MDS这一概念并将MDS分为五型:难治性贫血(refracrory aremia,RA);难治性贫血伴环状铁幼粒细胞增多(RA with ring sideroblst ,RAS);难治性贫血伴原始细胞增多(RA with an excess of blast, RAEB);转变中的难治性贫血伴原始细胞增多(RAEB in transformation,RAEB-T);慢性粒-单核细胞性白血病(chronic myelo-monocytic leukemia,CMML); MDS分型已由FAB标准过度到WHO标准,按照此标准将MDS分为以下八型:难治性贫血(RA);难治性贫血伴环状铁幼粒细胞增多(RARS);难治性血细胞减少症伴幼多系发育异常(RCMD);难治性血细胞减少症伴有多系发育异常和环状铁幼粒细胞(RCMD-RS);难治性贫血伴原始细胞增多-1(RAEB-1);难治性贫血伴原始细胞增多-2(RAEB-2);MDS,不能分类(MDS-U);MDS伴单纯del(5q);.WHO关于MDS的分类标准对于规范和同意MDS的诊断和治疗具有非常重要的意义,但WHO 分型标准面世,不久,目前尚未得到与FAB分型同样的认可与应用。 无效造血----ineffective hematopoiesis在骨髓内红细胞分裂成熟的过程中,由于某种原因使其在成熟和进入外周循环之前就被破坏,死亡,称之为无效造血,或者无效性红细胞生成,或原位溶血。

无效造血包括获得性和遗传性两种情况,前者如骨髓增生异常综合症,后者如先天性红系造血异常性贫血(congenital

dyserythropoietic anemia)。在巨幼红细胞性贫血,铁粒幼细胞性贫血和珠蛋白合成障碍性贫血(海洋性贫血或异常血红蛋白病)等,无效造血明显增加,导致释放到末梢血中的红细胞减少,是造成贫血的一个重要原因。

造血细胞(hematopoietic cell): 造血干细胞和定向干细胞的统称,是免疫细胞的来源。

不同反应条件对免疫沉淀分离膜蛋白影响论文

不同反应条件对免疫沉淀分离膜蛋白的影响

【中图分类号】r684【文献标识码】a【文章编号】1672-

3783(2011)08-0306-01

【摘要】目的:探讨不同条件对免疫沉淀方法分离纯化膜蛋白时的影响。方法:分别应用磷酸盐缓冲液(pbs)和溶膜缓冲液(含去垢剂)作为反应系统,单克隆抗体pd4与胃癌细胞系mgc803细胞膜溶液进行免疫沉淀反应以获得pd4相关抗原,用western blot检测膜蛋白的得量。结果:分离纯化pd4相关抗原时,用

cnbr-sepharose 4b-pd4进行免疫沉淀效果优于protein a

sepharose 4b;溶膜缓冲液作为反应系统效果优于磷酸盐缓冲液。结论:免疫沉淀纯化膜蛋白时,应用抗体直接交联于sepharose 4b和溶膜缓冲液作为反应系统效果更佳。

【关键词】免疫沉淀 去垢剂 蛋白质

effect of different reactive condition on purification of membrane protein with immunoprecipitation

【abstract】aim, to explore the effect of different condition on isolation and purification of membrane protein using immunoprecipitation. method, monoclonal antibody pd4

immunoprecipitated pd4 associated antigen from detergent lysates of cell membrane of gastric cancer cell line mgc803 in phosphate buffered saline(pbs)or lysis buffer. quantity of protein was measured with western blot. results, during