染色质免疫共沉淀

染色质免疫共沉淀实验

一、 染色质免疫共沉淀简介

真核生物的基因组DNA以染色质的形式存在。因此,研究蛋白质与DNA在染色质环境下的相互作用是阐明真核生物基因表达机制的基本途径。染色质免疫沉淀技术

(chromatin immunoprecipitation assay, CHIP)是目前唯一研究体内DNA与蛋白质相互作用的方法。它的基本原理是在活细胞状态下固定蛋白质-DNA复合物,并将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段,然后通过免疫学方法沉淀此复合体,特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段,通过对目的片断的纯化与检测,从而获得蛋白质与DNA相互作用的信息。CHIP不仅可以检测体内反式因子与DNA的动态作用,还可以用来研究组蛋白的各种共价修饰与基因表达的关系。而且,CHIP与其他方法的结合,扩大了其应用范围:CHIP与基因芯片相结合建立的CHIP-on-chip方法已广泛用于特定反式因子靶基因的高通量筛选;CHIP与体内足迹法相结合,用于寻找反式因子的体内结合位点;RNA-CHIP用于研究RNA在基因表达调控中的作用。由此可见,随着CHIP的进一步完善,它必将会在基因表达调控研究中发挥越来越重要的作用。

染色质免疫共沉淀可以:(1)组蛋白修饰酶的抗体作为“生物标记”;(2)转录调控分析;(3)药物开发研究;(4)DNA损失与凋亡分析。 二、ChIP的一般流程

甲醛处理细胞---收集细胞,超声破碎---加入目的蛋白的抗体,与靶蛋白-DNA复合物相互结合---加入ProteinA,结合抗体-靶蛋白-DNA复合物,并沉淀---对沉淀下来的复合物进行清洗,除去一些非特异性结合---洗脱,得到富集的靶蛋白-DNA复合物---解交联,纯化富集的DNA-片断---PCR分析。

三、PCR分析

ChIP-chip技术对于大规模挖掘顺式调控信息成绩卓著,同时它可以用于胚胎干细胞和一些疾病如癌症、心血管疾病和中央神经紊乱的发生的机制。研究人员还可以利用这项技术开发一些治疗方法。目前ChIP-chip技术研究主要集中于两个领域:及转录因子的结合和条件特异性;组蛋白的修饰,组蛋白修饰蛋白和染色体重建。

ChIP-chip在描述转录结合因子动力学中的研究、染色体结构组分的分布、在组蛋白的修饰、组蛋白修饰蛋白和染色体重建中的应用也十分广泛。ChIP-chip 技术的优点是,可以在体内进行反应;在给定的检验细胞环境的模式下得到DNA相互关系的简单影像;使用

特异性修正抗体鉴定与包含有一个特异性后转录修正的蛋白质的相关位点;直接或者间接(通过蛋白质与蛋白质的相互作用)的鉴别基因组与蛋白质的相关位点。缺点是:需要一个特异性蛋白质抗体,有时难于获得;为了获得高丰度的结合片段,必须实验演示胞内条件下靶标蛋白质的表达情况;调控蛋白质的基因的获取可能需要限制在组织来源中。

总之,ChIP-chip 技术的发展为析活细胞或组织中DNA与蛋白质的相互关系提供了一个极为有力的工具。在未来的研究中,将对芯片的构建进行改进,提高其实用性。使用易于获得抗体,增加这种方法的可用性。

在PCR分析这一块,比较传统的做法是半定量-PCR。但是现在随着荧光定量PCR的普及,大家也越来越倾向于Q-PCR了。此外还有一些由ChIP衍生出来的方法。例如RIP(其实就是用ChIP的方法研究细胞内蛋白与RNA的相互结合,具体方法和ChIP差不多,只是实验过程中要注意防止RNase,最后分析的时候需要先将RNA逆转录成为cDNA);还有ChIP-chip(其实就是ChIP富集得到的DNA-片段,拿去做芯片分析,做法在ChIP的基础上有所改变,不同的公司有不同的做法,要根据公司的要求来准备样品)。

实验方法

原理 在保持组蛋白和DNA联合的同时,通过运用对应于一个特定组蛋白标记的生物抗体,染色质被切成很小的片断,并沉淀下来。

IP是利用抗原蛋白质和抗体的特异性结合以及细菌蛋白质的“prorein A”特异性地结合到免疫球蛋白的FC片段的现象活用开发出来的方法。

目前多用精制的prorein A预先结合固化在argarose的beads上,使之与含有抗原的溶液及抗体反应后,beads上的prorein A就能吸附抗原达到精制的目的。

实验材料 细胞样品

试剂、试

剂盒 甲醛甘氨酸PBSSDS Lysis Buffer洗脱液RNaseA蛋白酶Komega胶回收试剂盒

仪器、耗

材 离心管超声仪电泳仪离心机

实验步骤 一、细胞的甲醛交联与超声破碎( 第一天)

1. 取出1平皿细胞(10 cm平皿),加入243 ul 37%甲醛,使得甲醛的终浓度为1%(培养基共有9 ml)。

5. 细胞刮刀收集细胞于15 ml离心管中(PBS依次为5 ml,3 ml和3 ml)。预冷后2 000 rpm 5 min收集细胞。

6. 倒去上清。按照细胞量,加入SDS Lysis Buffer。使得细胞终浓度为每200ul含2×106个细胞。这样每100 ul溶液含1×106个细胞。再加入蛋白酶抑制剂复合物。假设MCF7长满板为5×106个细胞。本次细胞长得约为80%。即为4×106个细胞。因此每管加入400 ul SDS Lysis Buffer。将2管混在一起,共800 ul。

7. 超声破碎:VCX750,25%功率,4.5 s冲击,9 s间隙。共14次。

二、除杂及抗体哺育 ( 第一天)

1. 超声破碎结束后,10 000 g 4℃离心10 min。去除不溶物质。

2. 留取300ul做实验,其余保存于-80℃。

3. 300 ul中,100 ul加抗体做为实验组;100 ul不加抗体做为对照组;100 ul加入4 ul 5 M NaCl(NaCl终浓度为0.2 M),65℃处理3 h解交联,跑电泳,检测超声破碎的效果。

4. 在100 ul的超声破碎产物中,加入900 ul ChIP DilutionBuffer和20 ul的50×PIC。

再各加入60 ul ProteinA Agarose/SalmonSpermDNA。4℃颠转混匀1 h。

5. 1 h后,在4℃静置10 min沉淀,700 rpm离心1 min。

6. 取上清。各留取20 ul做为input。一管中加入1 ul抗体,另一管中则不加抗体。4℃颠转过夜。

三、检验超声破碎的效果 ( 第一天)

1. 取100 ul超声破碎后产物,加入4 ul 5M NaCl,65℃处理2 h解交联。

2. 分出一半用酚/氯仿抽提。电泳检测超声效果。

四、免疫复合物的沉淀及清洗( 第二天)

1. 孵育过夜后,每管中加入60 ul ProteinA Agarose/SalmonSperm DNA。4℃颠转2 h。

2. 4℃静置10 min后,700 rpm离心1 min。除去上清。

3. 依次用下列溶液清洗沉淀复合物。清洗的步骤:加入溶液,在4℃颠转10 min,4℃静置10 min沉淀,700 rpm离心1 min,除去上清。

洗涤溶液:

(1)low salt wash buffer-one wash

(2)highsalt wash buffer-one wash

(3)LiCl wash buffer-one wash

(4)TE buffer-two wash

4. 清洗完毕后,开始洗脱。

洗脱液的配方:100 ul 10%SDS,100 ul1M NaHCO3,800 ul ddH2O,共1 ml。

每管加入250 ul洗脱buffer,室温下颠转15 min,静置离心后,收集上清。重复洗涤一次。最终的洗脱液为每管500 ul。

5. 解交联:每管中加入20 ul 5M NaCl(NaCl终浓度为0.2 M)。

6. 混匀,65℃解交联过夜。

五、DNA样品的回收(第三天)

1. 解交联结束后,每管加入1 ul RNaseA(MBI),37℃孵育1 h。

2. 每管加入10 ul 0.5 M EDTA,20 ul1M Tris.HCl(PH6.5),2 ul 10 mg/ml蛋白酶K。45℃处理2 h。

3. DNA片段的回收----omega胶回收试剂盒。最终的样品溶于100 ul ddH2O。

六、PCR分析(第三天)

注意事项 1. 注意抗体的性质。抗体不同和抗原结合能力也不同,免染能结合未必能用在IP反

应。建议仔细检查抗体的说明书。特别是多抗的特异性是问题。

2. 注意溶解抗原的缓冲液的性质。多数的抗原是细胞构成的蛋白,特别是骨架蛋白,缓冲液必须要使其溶解。为此,必须使用含有强界面活性剂的缓冲液,尽管它有可能影响一部分抗原抗体的结合。另一面,如用弱界面活性剂溶解细胞,就不能充分溶解细胞蛋白。即便溶解也产生与其它的蛋白结合的结果,抗原决定族被封闭,影响与抗体的结合,即使IP成功,也是很多蛋白与抗体共沉的悲惨结果。

3. 为防止蛋白的分解,修饰,溶解抗原的缓冲液必须加蛋白每抑制剂,低温下进行实验。每次实验之前,首先考虑抗体/缓冲液的比例。抗体过少就不能检出抗原,过多则就不能沉降在beads上,残存在上清。缓冲剂太少则不能溶解抗原,过多则抗原被稀释。

染色质免疫共沉淀技术(ChIP)

染色质免疫共沉淀技术(ChIP)

真核生物的基因组DNA以染色质的形式存在。因此,研究蛋白质与DNA在染色质环境下的相互作用是阐明真核生物基因表达机制的基本途径。染色质免疫沉淀技术(chromatin immunoprecipitation assay, CHIP)是目前唯一研究体内DNA与蛋白质相互作用的方法。它的基本原理是在活细胞状态下固定蛋白质-DNA复合物,并将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段,然后通过免疫学方法沉淀此复合体,特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段,通过对目的片断的纯化与检测,从而获得蛋白质与DNA相互作用的信息。CHIP不仅可以检测体内反式因子与DNA的动态作用,还可以用来研究组蛋白的各种共价修饰与基因表达的关系。而且,CHIP与其他方法的结合,扩大了其应用范围:CHIP与基因芯片相结合建立的CHIP-on-chip方法已广泛用于特定反式因子靶基因的高通量筛选;CHIP与体内足迹法相结合,用于寻找反式因子的体内结合位点;RNA-CHIP用于研究RNA在基因表达调控中的作用。由此可见,随着CHIP的进一步完善,它必将会在基因表达调控研究中发挥越来越重要的作用。

染色体免疫共沉淀(Chromatin Immunoprecipitation,ChIP)是基于体内分析发展起来的方法,也称结合位点分析法,在过去十年已经成为表观遗传信息研究的主要方法。这项技术帮助研究者判断在细胞核中基因组的某一特定位置会出现何种组蛋白修饰。ChIP不仅可以检测体内反式因子与DNA的动态作用,还可以用来研究组蛋白的各种共价修饰与基因表达的关系。近年来,这种技术得到不断的发展和完善。采用结合微阵列技术在染色体基因表达调控区域检查染色体活性,是深入分析癌症、心血管疾病以及中央神经系统紊乱等疾病的主要代谢通路的一种非常有效的工具。

它的原理是在保持组蛋白和DNA联合的同时,通过运用对应于一个特定组蛋白标记的生物抗体,染色质被切成很小的片断,并沉淀下来。IP是利用抗原蛋白质和抗体的特异性结合以及细菌蛋白质的“prorein A”特异性地结合到免疫球蛋白的FC片段的现象活用开发出来的方法。目前多用精制的prorein A预先结合固化在argarose的beads上,使之与含有抗原的溶液及抗体反应后,beads上的prorein A就能吸附抗原达到精制的目的。实验最需要注意点就是抗体的性质。抗体不同和抗原结合能力也不同,免染能结合未必能用在IP反应。建议仔细检查抗体的说明书。特别是多抗的特异性是问题。其次,要注意溶解抗原的缓冲液

的性质。多数的抗原是细胞构成的蛋白,特别是骨架蛋白,缓冲液必须要使其溶解。为此,必须使用含有强界面活性剂的缓冲液,尽管它有可能影响一部分抗原抗体的结合。另一面,如用弱界面活性剂溶解细胞,就不能充分溶解细胞蛋白。即便溶解也产生与其它的蛋白结合的结果,抗原决定族被封闭,影响与抗体的结合,即使IP成功,也是很多蛋白与抗体共沉的悲惨结果。再次,为防止蛋白的分解,修饰,溶解抗原的缓冲液必须加蛋白每抑制剂,低温下进行实验。每次实验之前,首先考虑抗体/缓冲液的比例。抗体过少就不能检出抗原,过多则就不能沉降在beads上,残存在上清。缓冲剂太少则不能溶解抗原,过多则抗原被稀释。

ChIP的一般流程:

甲醛处理细胞---收集细胞,超声破碎---加入目的蛋白的抗体,与靶蛋白-DNA复合物相互结合---加入ProteinA,结合抗体-靶蛋白-DNA复合物,并沉淀---对沉淀下来的复合物进行清洗,除去一些非特异性结合---洗脱,得到富集的靶蛋白-DNA复合物---解交联,纯化富集的DNA-片断---PCR分析。

在PCR分析这一块,比较传统的做法是半定量-PCR。但是现在随着荧光定量PCR的普及,大家也越来越倾向于Q-PCR了。此外还有一些由ChIP衍生出来的方法。例如RIP(其实就是用ChIP的方法研究细胞内蛋白与RNA的相互结合,具体方法和ChIP差不多,只是实验过程中要注意防止RNase,最后分析的时候需要先将RNA逆转录成为cDNA);还有ChIP-chip(其实就是ChIP富集得到的DNA-片段,拿去做芯片分析,做法在ChIP的基础上有所改变,不同的公司有不同的做法,要根据公司的要求来准备样品)。

具体操作流程:

第一天:

(一)、细胞的甲醛交联与超声破碎。

1、取出1平皿细胞(10cm平皿),加入243 ul 37%甲醛,使得甲醛的终浓度为1%(培养基共有9ml)。

2、37摄氏度孵育10min。

3、终止交联:加甘氨酸至终浓度为0.125M。450 ul 2.5M甘氨酸于平皿中。混匀后,在室温下放置5min即可。

4、吸尽培养基,用冰冷的PBS清洗细胞2次。

5、细胞刮刀收集细胞于15ml离心管中(PBS依次为5ml,3ml和3ml)。预冷后2000rpm 5min收集细胞。

6、倒去上清。按照细胞量,加入SDS Lysis Buffer。使得细胞终浓度为每200ul含2×106个细胞。这样每100ul溶液含1×106个细胞。再加入蛋白酶抑制剂复合物。假设MCF7长满板为5×106个细胞。本次细胞长得约为80%。即为4×106个细胞。因此每管加入400ul SDS Lysis Buffer。将2管混在一起,共800ul。

7、超声破碎:VCX750,25%功率,4.5S冲击,9S间隙。共14次。

(二)、除杂及抗体哺育。

8、超声破碎结束后,10,000g 4oC离心10min。去除不溶物质。

留取300ul做实验,其余保存于-80oC。

300ul中,100ul加抗体做为实验组;100ul不加抗体做为对照组;100ul加入4ul5MNaCl(NaCl终浓度为0.2M),65oC处理3h解交联,跑电泳,检测超声破碎的效果。

9、在100ul的超声破碎产物中,加入900ulChIPDilutionBuffer和20ul的50×PIC。

再各加入60ulProteinAAgarose/SalmonSpermDNA。4oC颠转混匀1h。

10、1h后,在4摄氏度静置10min沉淀,700rpm离心1min。

11、取上清。各留取20ul做为input。一管中加入1ul抗体,另一管中则不加抗体。4oC颠转过夜。

(三)、检验超声破碎的效果。

取100ul超声破碎后产物,加入4ul5MNaCl,65oC处理2h解交联。分出一半用酚/氯仿抽提。电泳检测超声效果。

第二天:

(一)、免疫复合物的沉淀及清洗。

12、孵育过夜后,每管中加入60ulProteinAAgarose/SalmonSpermDNA。4oC颠转2h。

13、4oC静置10min后,700rpm离心1min。除去上清。

14、依次用下列溶液清洗沉淀复合物。清洗的步骤:加入溶液,在4oC颠转10min,4oC静置10min沉淀,700rpm离心1min,除去上清。

洗涤溶液:a.low salt wash buffer-one wash

b.highsalt wash buffer-one wash

c.LiCl wash buffer-one wash

d.TE buffer-two wash

15、清洗完毕后,开始洗脱。洗脱液的配方:100ul10%SDS,100ul1MNaHCO3,800ulddH2O,共1ml。

每管加入250ul洗脱buffer,室温下颠转15min,静置离心后,收集上清。重复洗涤一次。最终的洗脱液为每管500ul。

16、解交联:每管中加入20ul 5M NaCl(NaCl终浓度为0.2M)。

混匀,65oC解交联过夜。

第三天:

(一)、DNA样品的回收

17、解交联结束后,每管加入1ulRNaseA(MBI),37oC孵育1h。

18、每管加入10ul0.5MEDTA,20ul1MTris.HCl(PH6.5),2ul10mg/ml蛋白酶K。

45oC处理2h。

19、DNA片段的回收----omega胶回收试剂盒。最终的样品溶于100ulddH2O。

(二)、PCR分析

ChIP-chip技术对于大规模挖掘顺式调控信息成绩卓著,同时它可以用于胚胎干细胞和一些疾病如癌症、心血管疾病和中央神经紊乱的发生的机制。研究人员还可以利用这项技术开发一些治疗方法。目前ChIP-chip技术研究主要集中于两个领域:及转录因子的结合和条件特异性;组蛋白的修饰,组蛋白修饰蛋白和染色体重建。

ChIP-chip在描述转录结合因子动力学中的研究、染色体结构组分的分布、在组蛋白的修饰、组蛋白修饰蛋白和染色体重建中的应用也十分广泛。ChIP-chip 技术的优点是,可以在体内进行反应;在给定的检验细胞环境的模式下得到DNA相互关系的简单影像;使用特异性修正抗体鉴定与包含有一个特异性后转录修正的蛋白质的相关位点;直接或者间接(通过蛋白质与蛋白质的相互作用)的鉴别基因组与蛋白质的相关位点。缺点是:需要一个特异性蛋白质抗体,有时难于获

得;为了获得高丰度的结合片段,必须实验演示胞内条件下靶标蛋白质的表达情况;调控蛋白质的基因的获取可能需要限制在组织来源中。

总之,ChIP-chip 技术的发展为析活细胞或组织中DNA与蛋白质的相互关系提供了一个极为有力的工具。在未来的研究中,将对芯片的构建进行改进,提高其实用性。使用易于获得抗体,增加这种方法的可用性。

CHIP(染色质免疫共沉淀)

一、超声剪切染色质

1.用37℃预温的1%PFA固定10-20min,使DNA与蛋白质交联

2.终止交联,加入终浓度为0.125M的甘氨酸

3.用预冷的PBS洗2次

4.用PBS将细胞刮下(5mlPBS+1mMPMSF+1mg/ml抑肽酶)

5.4500rpm5min(此阶段细胞沉淀可储存于-80℃)

6.弃上清,按200ul/106个细胞加入SDS lysis buffer(现加PMSF&coktail),冰上10min(4℃rotation 30min)

7.27G针头注射器吹打3遍,若有气泡离心

8.超声:不可有气泡,超两次后放到冰上

9.离心:4℃,12000rpm,20min,上清转移到15ml离心管

二、Ab沉淀目的染色质

1.用dilution buffer稀释至1ml

2.取50ul Input(也可取少量做lgG阴性对照,RNaseⅡ阴性对照)

备注:取450ul做lgGcontrol,剩余500ul

3.剩下的加一抗(5ul/ml),4℃rotate过夜

4.向样品中加入50ul ProteinA+Gbeads, 4℃rotate2h, 之后可在冰上沉淀一会

5.离心,1000rpm1min,留上清

6.洗珠子,1ml/5min/次,在4℃rotate,再在冰上静置5min,1000rpm1min。 洗涤顺序为:低盐溶液→高盐溶液→LicL(之前在4℃)→TE→TE(室温)

三、去除蛋白质

1.Elution buffer(1%SDS、0.1MNaHCO3;0.5gSDS,0.42gNaHCO3 in 50ml ddH20)+250uL RT15min rotate →离心1000rpm1min→上清(收集)→+250ulRT 10min →金属65℃5min→上清(收集)

2.上清+20ul5M NaCl

Input+450ul elution buffer+20ul 5M NaCl

65℃ 6-7h或过夜

3.10ul0.5MEDTA,20ul1MTris-HCl +2ul 10mg/ml 蛋白酶K(50℃1h)?

四、提纯DNA

1.加等体积(500ul)Tris-饱和酚,剧烈混匀,14500rpm10min, 取上清,加入500ulCHCl3混匀后14500rpm10min,取上清后再加入tRNA60ug (200ug/ml,3ul),加异丙醇500ul,离心14500rpm20min 弃上清

2.加70%酒精洗一遍,14500rpm5min,(要去掉上清,先倒掉,倒掉之后离心一下再扔掉液体)将管子倒扣空气晾干。

3.加30ul ddH2O 溶解,4℃过夜,-20℃保存。

染色质免疫共沉淀技术的发展

染色质免疫共沉淀技术的发展

姚汪劲松 发育生物学2013级 2013110046

摘要:本文主要介绍了染色质免疫沉淀技术的发展历程、基本原理和优缺点,并且介绍了反向染色质免疫沉淀技术,并对两种方法进行了比较。

关键词:染色质免疫共沉淀;反向染色质免疫共沉淀;应用,研究前景。

目前,不断发展的DNA和蛋白质相互作用的方法和技术已经成为研究DNA复制、重组、修复和转录的核心。其中凝胶阻滞实验(EMSA),报告基因分析,DNA微阵列,质谱分析法MS,酵母单杂交系统和染色质免疫共沉淀技术(ChIP)是被广泛应用于研究DNA和蛋白质相互作用的方法。

真核生物基因组DNA以染色质形式存在,研究蛋白质与DNA在染色质环境下的相互作用是阐明真核生物基因表达调控机制的基本途径。生物体内基因表达调控主要发生在转录过程中,转录调控是顺式作用元件(Cis-acting elements)如启动子(Promoter)、增强子(Enhancer)与反式作用因子(Trans-acting factors)相互作用的结果。基因组DNA的甲基化、组蛋白甲基化、乙酰化和磷酸化修饰,核小体重新定位及染色体结构重建都影响调控。转录调控具有细胞类型、发育阶段和外界环境刺激的差异性,哺乳动物转录调控序列分散在较大区域,组蛋白修饰状态达100多种,这些因素都增加了转录调控的复杂性。

ChIP是一种在体内研究转录因子和靶基因启动子区域直接相互作用的方法,可以在体内直接确定它们之间相互作用方式的动态变化,能够得到转录因子结合位点的信息,确定其直接靶基因。它早期多被用于研究核小体上的DNA和组蛋白的相互作用以及组蛋白的修饰等方面。近年来,随着生物技术的迅速发展,ChIP技术不断发展和完善,被广泛应用于体内转录调控因子与靶基因启动子上特异核苷酸序列结合方面的研究,并成为在染色质水平研究基因表达调控的有效方法。特别是,此技术与DNA芯片和分子克隆技术相结合,可用于高通量筛选已知蛋白因子的未知DNA靶位点和研究反式作用因子在整个基因组上的分布情况,这将有助于深入研究DNA与蛋白质相互作用的调控网络。

ChIP技术由Orlando等于1997年创立。其基本原理为将处于适当生长时期的活细胞用甲醛交联后将细胞裂解,染色体分离并打碎为一定大小的片段;然后用特异性抗体免疫沉淀目标蛋白与DNA交联的复合物,对特定靶蛋白与DNA片段进行富集。采用低pH值条件反交联,DNA与蛋白质之间的Schiff键水解,释放DNA片段。通过对目标片段的纯化与检测,获得DNA与蛋白质相互作用的序列信息。在上述ChIP过程中,甲醛能够进入细胞并使蛋白质与DNA或蛋白质与蛋白质之间通过希弗(Scihff)键交联,形成稳定结合的复合物。如果交联效果不太好,可以先用交联剂DMA(Dimethyl adipimidate)或DSG (Disuccnimidyl glutarate)处理细胞,以加强后续甲醛交联的效果。破碎DNA可采用超声物理破碎或特定酶切消化,以获得所需长度的DNA片段。由于DNA片段长度将影响抗体免疫沉淀效率,因此破碎DNA是ChIP实验成功与否的重要因素。超声效果与细胞裂解是否充分、细胞浓度及裂解液成分等因素有关。超声处理后的液体应从浑浊状态变为透明状态。选择专一性及亲和力较高的抗体是ChIP成功的关键。非特异性抗体将增加大量的非目标靶点DNA片段信息,从而掩盖了真实的蛋白质结合位点信息;而亲和力较差的抗体,则无法获得高信噪比靶点DNA片段。另一方面,在甲醛交联过程中可能会掩盖一些蛋白质的表位,这会影响到一部分蛋白质和DNA复合体的免疫沉淀反应。因此,用Western印迹或免疫组化等常用的实验方法证明的能够对目标蛋白质进行免疫结合的抗体,并不能保证一定能够成功地进行ChIP实验。例如,Weitsman 等检验了不同的雌激素受体β抗体在ChIP中的免疫沉淀能力, 发现有的抗体虽然能够在标准免疫沉淀条件下与抗原结合,但不适合ChIP条件下使用,并

且不同抗体的结合效率也有差异。对于某一目标蛋白采用多种抗体组合来进行ChIP实验是一种有效的方案。例如,Chen 等针对CTCF在人类基因组中的结合位点研究,采用了多种不同单克隆抗体的混合物进行免疫沉淀。另外,有人利用表位附加标记技术表达融合蛋白进行免疫沉淀实验。常用的表位附加标记有红血球凝集素(Hemagglutinin)、生物素和c-Myc等。但哺乳动物细胞中难以引入表位附加标记的融合蛋白,并且其表达往往不同于其内源转录因子。染色质免疫沉淀获得的DNA数量往往很多,其中包含大量的非特异结合造成的背景噪音,采用严格的洗涤条件可以降低背景。Ogryzko等将靶蛋白与生物素受体片段融合表达, 通过抗生物素磁珠免疫沉淀,二者较强的结合力便于进行更为严谨的洗涤,达到降低背景的目的。

与传统的研究转录因子和DNA相互作用的方法相比,染色质免疫共沉淀技术是一种在体内研究DNA与蛋白质相互作用的理想方法。ChIP的优点在于能够在体内捕获转录因子和靶基因的相互作用,能同时快速地提供一种或者多种基因的调控机制,因此有巨大的应用价值。ChIP技术也有一定的局限性:第一,该技术需要抗目的蛋白或者特殊修饰标签的高度特异性抗体。第二,假阴性信号可能源于无效的抗体结合或者在交联过程中抗原受到干扰。第三,甲醛固定可能是暂时的,甚至是非特异的,可能导致相邻的蛋白形成假阳性信号。针对以上三方面,推荐在交联之后和抗体沉淀之前绘制一条标准曲线,以确定每次实验所需染色质的最佳量,确保材料的起始量相等。当检测的染色质模版(目的抗体的染色质免疫沉淀物)扩增出可检测的条带时,将染色质样品连续稀释以确定关键点;而此时对照(mock ChIPed)染色质模版需要浓缩以扩增出可见的条带。总之,染色质免疫共沉淀的步骤是需要精确的且要求一系列的预实验。第四,难以同时得到多个蛋白质对同一序列结合的信息等。反向染色质免疫共沉淀技术(reverse chromatin immunoprecipitation assay,Reverse ChIP)可以弥补这个缺陷,并且能定性、定量地准确鉴定目的蛋白质。Reverse ChIP是一种在体内状态下分析DNA和蛋白质相互作用的新方法。它用特异的核酸探针捕获靶DNA片段及与其相结合的蛋白质。蛋白质用质谱仪检测,以确定靶DNA位点全部相关的蛋白质。这种技术可对靶DNA位点相关蛋白质进行全面、系统地鉴定,特别能找到已知DNA元件相应的调节蛋白。其在发现鉴定、靶DNA位点相关蛋白质和研究DNA和蛋白质相互作用方面有重要的应用价值。

研究DNA-蛋白质相互作用的技术方法有多种,但研究体内状态下的方法仅有染色质免疫共沉淀技术(ChIP)。而该方法尚存在不足,如:难以同时得到多个蛋白质对同一序列结合的信息等。Reverse ChIP技术正好能弥补这些缺陷,并且可定性定量地准确鉴定目标蛋白质。由于DNA探针杂交技术和质谱方法的进步,Kingston和Déjardin于2009 年1 月建立了PICh(proteomics of isolated chromatin segments)技术,来验证端粒相关蛋白质。 Mittler,Butter 和Mann于2009年1月 建 立 了SILAC(stable isotope labeling with amino acids in cell culture)技术,来分析靶DNA位点相关蛋白质。2009年3月,Rusk把这两种方法综合到一起,做了简要介绍,并将其命名为reverseChIP技术。

ReverseChIP技术的核心是用DNA探针捕获靶DNA片段及与其相关的蛋白质。其基本原理是在活细胞状态下用甲醛固定细胞,以交联DNA-蛋白质的复合物。然后将此复合物超声切断为一定长度的染色质片段,用以脱硫生物素为标记物的DNA探针与靶DNA片段杂交,形成稳定的DNA探针-靶DNA片段及其相关蛋白质的杂交体。之后用亲和素磁珠结合脱硫生物素,以捕获此杂交体,离心得到的磁珠与杂交体被洗脱液洗脱,杂交体被游离出来。 加入交联反转液,使DNA-蛋白质复合物解交联,电泳得到靶DNA位点相关蛋白质,经纯化后,再进入质谱仪进行检测,以达到确定靶DNA位点全部相关蛋白质的目的,进而获得DNA-蛋白质相互作用的定性定量信息。

与目前其它研究DNA-蛋白质相互作用的技术方法相比,Reverse ChIP技术具有以下优

点:(1)可以同时得到靶DNA位点上多个蛋白质结合的信息;(2)此技术不使用抗体,只需要合成特定序列的DNA探针,以用来分析任何靶DNA位点上的相关蛋白质;(3)Reverse ChIP技术具有很高的灵敏度,可以用来分析低丰度的相关蛋白质;(4)能定性定量地鉴定相关蛋白质。由于该项技术发明时间尚短,亦存在一定的不足。如依赖核酸杂交以检测与靶DNA相结合的蛋白质,可能因探针与某些非靶DNA杂交而产生干扰.又如该技术需要纯化足够量的蛋白质,以满足质谱检测的需要,这可能要求大量的起始材料,也就是说需要处理大量的细胞。

随着功能基因组学研究的深入开展,在染色质水平研究基因的表达调控,是全面阐明真核基因表达调控机制的必经之路。染色质免疫共沉淀技术不仅可以检测体内反式因子与DNA的动态作用,还可以用来研究组蛋白的各种共价修饰与基因表达的关系。该技术被广泛应用于组蛋白转录后调控,组蛋白变体,转录因子,位于基因组或已知基因座上的染色质调控酶的定位等方面的研究。ChIP技术的应用使核蛋白和DNA的相互作用在基因表达、细胞分化或者抗病性等方面的研究有了很大的突破。特别是,ChIP技术能够揭示转录因子的结合位点和确定直接的靶基因序列,可在体内分析特定启动子的分子调控机制,因此被广泛应用于转录调控机制的研究方面。另外,以ChIP技术为基础的多种技术的应用,能够确定转录因子的结合基元,为转录因子生物学的研究提供了重要方法。染色质免疫共沉淀技术与其它方法的结合,扩大了其应用范围。近年来,ChIP技术与DNA微阵列芯片技术或高通量测序技术结合已经广泛应用于特定反式因子靶基因的高通量筛选方面,能够作出组蛋白修饰,组蛋白变体,整个基因组范围内转录因子的图谱。RNA-ChIP用于研究RNA在基因表达调控中的作用。由此可见,随着ChIP技术的进一步完善,它必将会在基因表达调控研究中发挥越来越重要的作用。

参 考 文 献

[1] Fried M G.Measurement of protein-DNA interaction parameters by electrophoresis mobility shift assay[J]. Electrophoresis, 1989 ,10(5/6): 366-376.

[2] Hellman L M Fried M G. Electrophoretic mobility shift assay EMSA for detecting protein-nucleic acid interactions[J]. Nature Protocols,2007 ,2(8): 1849-1861.

[3] Wood K V. Marker proteins for gene expression[J]. Current Opinion in Biotechnology ,1995,6(1): 50-58.

[4] Chalfie M Tu Y Euskirchen G et al. Green fluorescent protein as a marker for gene expression[J]. Science,1994,263(5148): 802-805.

[5] Bulyk M L. DNA microarray technologies for measuring protein-DNA interactions[J]. Current Opinion in Biotechnology ,2006, 17(4):422-430.

[6] Bonaldi T Regula J T Imhof A. The use of mass spectrometry for the analysis of histone modifications[J]. Methods in Enzymology, 2004, 377: 111-130.

[7] Burlingame A L Zhang X Chalkley R J. Mass spectrometric analysis of histone posttranslational modifications[J].Methods ,2005 ,36(4): 383-394.

[8] Wang M M Reed R R. Molecular cloning of the olfactory neuronal transcription factor Olf-1 by genetic selection in yeast[J]. Nature ,1993 ,364(6433): 121-126.

[9] Feng S Y Ota K Yamada Y et al. A yeast one-hybrid system to detect methylation-dependent DNA-protein in teractions[J]. Biochemical and Biophysical Research Communications ,2004 ,313(4):922-925.

[10] Orlando V Strutt H Paro R. Analysis of chromatin structure by in vivo formaldehyde cross-linking[J]. Methods A Companion to Methods in Enzymology ,1997, 11(2): 205-214.

[11] Kuo M H Allis C D. In vivo cross-linking and immunoprecipitation for studying dynamic Protein DNA associations in a chromatin environment[J]. Methods A Companion to Methods in Enzymology ,1999, 19(3) ,425-433.

[12] Perez-Romero P Imperiale M J. Assaying protein-DNA interactions in vivo and in vitro using chromatin immuno precipitation and electrophoretic mobility shift assays[J]. Methods in Molecular Medicine ,2007 ,131 :123-139.

[13] Garner M M Revzin A. A gel electrophoresis method for quantifying the binding of proteins to specific DNA regions Application to components of the Escherichia coli lactose operon regulatory system [J]. Nucleic Acids Research ,1981, 9(13): 3047-3060.

[14] Chien T Y Lin C K Lin C W et al. DBD2BS connecting a DNA-binding protein with its binding sites [J]. Nucleic Acid Research ,2012 1-7.

ChIP染色质免疫共沉淀技术服务注意事项

上海科研技术共享平台

------ChIP染色质免疫共沉淀服务注意事项 一.服务项目:

1.染色质免疫沉淀 (ChIP) 处理

2.ChIP-Real Time PCR (CRTP)解析

3.ChIP-SEQ高通量测序解析.

二.技术主要应用于:

1.组蛋白修饰研究

2.转录调控分析

3. 药物开发研究

4.有丝分裂研究

5.DNA损伤与凋亡分析。

三. 基本步骤:

1)甲醛处理细胞

2)收集细胞,超声破碎

3)加入目的蛋白的抗体,与靶蛋白-DNA复合物相互结合

4)加入ProteinA,结合抗体-靶蛋白-DNA复合物,沉淀

5)对沉淀下来的复合物进行清洗,除去一些非特异性结合

6)洗脱,得到富集的靶蛋白-DNA复合物

7)解交联,纯化富集的DNA-片断

8)PCR或基因芯片分析

四.注意事项:1.客户告知实验分组、编号及背景设计资料,有具体要求请事先说明;

2.抗体:事先咨询本科研平台,明确抗体种属以及是否有该抗体可使用,如有一抗使用另加使用费,如无可由双方协商而定,客户自己购买提供或本实验室代购;

3.标本收集与保存:

组织样品 新鲜组织放入液氮或-70度保存,组织不少于100mg(约绿豆大小); 培养细胞 通过细胞计数取不少于2000000个细胞于EP管,加入0.5ml生理盐水或蛋白保护剂,混匀后保存于冰箱(-70℃,避免反复冻融);

血液细胞标本 以抗凝管保存血样或以淋巴细胞分离液分离细胞后加入0.5ml生理盐水或蛋白保护剂,保存(-70℃可长期保存,避免反复冻融)

血清或细胞培养液标本 离心去掉杂质后取上清入EP管,保存(以上4℃可保存15-20天,-70℃可长期保存,避免反复冻融)

4.样本运输:可选以下任何的一种方式寄送标本

组织样本、细胞样本以干冰运输或加入蛋白保护剂后加冰袋运输;

细胞样本也可以直接快件寄送培养瓶(密封保证不污染,培养液不漏出,细胞不要长得太满,50%左右,灌满培养液);

血清或上清液直接加冰袋寄送(密封保证液体不漏出,视路途远近2-3天可到达)

五.预约方式与收费标准

1.服务时间:周一至周五下午2:00-5:00。节假日除外。

2.每个标本收费6800元,三个以上6000元,10个以上另议。 2.联系方式:宋老师 13661449330,QQ2293446234,songjing1214@sina.cn

染色质免疫共沉淀技术(ChIP)

甲醛处理细胞---收集细胞,超声破碎---加入目的蛋白的抗体,与靶蛋白-DNA复合物相互结合---加入ProteinA,结合抗体-靶蛋白-DNA复合物,并沉淀---对沉淀下来的复合物进行清洗,除去一些非特异性结合---洗脱,得到富集的靶蛋白-DNA复合物---解交联,纯化富集的DNA-片断---PCR分析。

在PCR分析这一块,比较传统的做法是半定量-PCR。但是现在随着荧光定量PCR的普及,大家也越来越倾向于Q-PCR了。此外还有一些由ChIP衍生出来的方法。例如RIP(其实就是用ChIP的方法研究细胞内蛋白与RNA的相互结合,具体方法和ChIP差不多,只是实验过程中要注意防止RNase,最后分析的时候需要先将RNA逆转录成为cDNA);还有

ChIP-chip(其实就是ChIP富集得到的DNA-片段,拿去做芯片分析,做法在ChIP的基础上有所改变,不同的公司有不同的做法,要根据公司的要求来准备样品)。

详细

实验方法

 染色质免疫共沉淀技术(ChIP)

实验材料

 细胞样品

试剂、试剂盒

 甲醛 甘氨酸 PBS SDS Lysis Buffer 洗脱液 RNaseA 蛋白酶K omega胶回收试剂盒

仪器、耗材

离心管

 超声仪

 电泳仪

 离心机 

真核生物的基因组DNA以染色质的形式存在。因此,研究蛋白质与DNA在染色质环境下的相互作用是阐明真核生物基因表达机制的基本途径。染色质免疫沉淀技术(chromatin immunoprecipitation assay, CHIP)是目前唯一研究体内DNA与蛋白质相互作用的方法。它的基本原理是在活细胞状态下固定蛋白质-DNA复合物,并将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段,然后通过免疫学方法沉淀此复合体,特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段,通过对目的片断的纯化与检测,从而获得蛋白质与DNA相互作用的信息。CHIP不仅可以检测体内反式因子与DNA的动态作用,还可以用来研究组蛋白的各种共价修饰与基因表达的关系。而且,CHIP与其他方法的结合,扩大了其应用范围:CHIP与基因芯片相结合建立的CHIP-on-chip方法已广泛用于特定反式因子靶基因的高通量筛选;CHIP与体内足迹法相结合,用于寻找反式因子的体内结合位点;RNA-CHIP用于研究RNA在基因表达调控中的作用。由此可见,随着CHIP的进一步完善,它必将会在基因表达调控研究中发挥越来越重要的作用。

染色体免疫共沉淀(Chromatin Immunoprecipitation,ChIP)是基于体内分析发展起来的方法,也称结合位点分析法,在过去十年已经成为表观遗传信息研究的主要方法。这项技术帮助研究者判断在细胞核中基因组的某一特定位置会出现何种组蛋白修饰。ChIP不仅可以检测体内反式因子与DNA的动态作用,还可以用来研究组蛋白的各种共价修饰与基因表达的关系。近年来,这种技术得到不断的发展和完善。采用结合微阵列技术在染色体基因表达调控区域检查染色体活性,是深入分析癌症、心血管疾病以及中央神经系统紊乱等疾病的主要代谢通路的一种非常有效的工具。

它的原理是在保持组蛋白和DNA联合的同时,通过运用对应于一个特定组蛋白标记的生物抗体,染色质被切成很小的片断,并沉淀下来。IP是利用抗原蛋白质和抗体的特异性结合以及细菌蛋白质的“prorein A”特异性地结合到免疫球蛋白的FC片段的现象活用开发出来的方法。目前多用精制的prorein A预先结合固化在argarose的beads上,使之与含有抗原的溶液及抗体反应后,beads上的prorein A就能吸附抗原达到精制的目的。实验最需要注意点就是抗体的性质。抗体不同和抗原结合能力也不同,免染能结合未必能用在IP反应。建议仔细检查抗体的说明书。特别是多抗的特异性是问题。其次,要注意溶解抗原的缓冲液的性质。多数的抗原是细胞构成的蛋白,特别是骨架蛋白,缓冲液必须要使其溶解。为此,必须使用含有强界面活性剂的缓冲液,尽管它有可能影响一部分抗原抗体的结合。另一面,如用弱界面活性剂溶解细胞,就不能充分溶解细胞蛋白。即便溶解也产生与其它的蛋白结合的结果,抗原决定族被封闭,影响与抗体的结合,即使IP成功,也是很多蛋白与抗体共沉的悲惨结果。再次,为防止蛋白的分解,修饰,溶解抗原的缓冲液必须加蛋白每抑制剂,低温下进行实验。每次实验之前,首先考虑抗体/缓冲液的比例。抗体过少就不能检出抗原,过多则就不能沉降在beads上,残存在上清。缓冲剂太少则不能溶解抗原,过多则抗原被稀释。

ChIP的一般流程:

甲醛处理细胞---收集细胞,超声破碎---加入目的蛋白的抗体,与靶蛋白-DNA复合物相互结合---加入ProteinA,结合抗体-靶蛋白-DNA复合物,并沉淀---对沉

淀下来的复合物进行清洗,除去一些非特异性结合---洗脱,得到富集的靶蛋白-DNA复合物---解交联,纯化富集的DNA-片断---PCR分析。

在PCR分析这一块,比较传统的做法是半定量-PCR。但是现在随着荧光定量PCR的普及,大家也越来越倾向于Q-PCR了。此外还有一些由ChIP衍生出来的方法。例如RIP(其实就是用ChIP的方法研究细胞内蛋白与RNA的相互结合,具体方法和ChIP差不多,只是实验过程中要注意防止RNase,最后分析的时候需要先将RNA逆转录成为cDNA);还有ChIP-chip(其实就是ChIP富集得到的DNA-片段,拿去做芯片分析,做法在ChIP的基础上有所改变,不同的公司有不同的做法,要根据公司的要求来准备样品)。

具体操作流程:

第一天:

(一)、细胞的甲醛交联与超声破碎。

1、取出1平皿细胞(10cm平皿),加入243 ul 37%甲醛,使得甲醛的终浓度为1%(培养基共有9ml)。

2、37摄氏度孵育10min。

3、终止交联:加甘氨酸至终浓度为0.125M。450 ul 2.5M甘氨酸于平皿中。混匀后,在室温下放置5min即可。

4、吸尽培养基,用冰冷的PBS清洗细胞2次。

5、细胞刮刀收集细胞于15ml离心管中(PBS依次为5ml,3ml和3ml)。预冷后2000rpm 5min收集细胞。

6、倒去上清。按照细胞量,加入SDS Lysis Buffer。使得细胞终浓度为每200ul含2×106个细胞。这样每100ul溶液含1×106个细胞。再加入蛋白酶抑制剂复合物。假设MCF7长满板为5×106个细胞。本次细胞长得约为80%。即为4×106个细胞。因此每管加入400ul SDS Lysis Buffer。将2管混在一起,共800ul。

7、超声破碎:VCX750,25%功率,4.5S冲击,9S间隙。共14次。

(二)、除杂及抗体哺育。

8、超声破碎结束后,10,000g 4oC离心10min。去除不溶物质。

留取300ul做实验,其余保存于-80oC。

300ul中,100ul加抗体做为实验组;100ul不加抗体做为对照组;100ul加入4ul5MNaCl(NaCl终浓度为0.2M),65oC处理3h解交联,跑电泳,检测超声破碎的效果。

9、在100ul的超声破碎产物中,加入900ulChIPDilutionBuffer和20ul的50×PIC。

再各加入60ulProteinAAgarose/SalmonSpermDNA。4oC颠转混匀1h。 10、1h后,在4摄氏度静置10min沉淀,700rpm离心1min。

11、取上清。各留取20ul做为input。一管中加入1ul抗体,另一管中则不加抗体。4oC颠转过夜。

(三)、检验超声破碎的效果。

取100ul超声破碎后产物,加入4ul5MNaCl,65oC处理2h解交联。分出一半用酚/氯仿抽提。电泳检测超声效果。

第二天:

(一)、免疫复合物的沉淀及清洗。

12、孵育过夜后,每管中加入60ulProteinAAgarose/SalmonSpermDNA。4oC颠转2h。

13、4oC静置10min后,700rpm离心1min。除去上清。

14、依次用下列溶液清洗沉淀复合物。清洗的步骤:加入溶液,在4oC颠转10min,4oC静置10min沉淀,700rpm离心1min,除去上清。

洗涤溶液:a.low salt wash buffer-one wash

b.highsalt wash buffer-one wash

c.LiCl wash buffer-one wash

d.TE buffer-two wash

15、清洗完毕后,开始洗脱。洗脱液的配方:100ul10%SDS,100ul1MNaHCO3,800ulddH2O,共1ml。

每管加入250ul洗脱buffer,室温下颠转15min,静置离心后,收集上清。重复洗涤一次。最终的洗脱液为每管500ul。

16、解交联:每管中加入20ul 5M NaCl(NaCl终浓度为0.2M)。

混匀,65oC解交联过夜。

第三天:

(一)、DNA样品的回收

17、解交联结束后,每管加入1ulRNaseA(MBI),37oC孵育1h。

18、每管加入10ul0.5MEDTA,20ul1MTris.HCl(PH6.5),2ul10mg/ml蛋白酶K。

45oC处理2h。

19、DNA片段的回收----omega胶回收试剂盒。最终的样品溶于100ulddH2O。

(二)、PCR分析

ChIP-chip技术对于大规模挖掘顺式调控信息成绩卓著,同时它可以用于胚胎干细胞和一些疾病如癌症、心血管疾病和中央神经紊乱的发生的机制。研究人员还可以利用这项技术开发一些治疗方法。目前ChIP-chip技术研究主要集中于两个领域:及转录因子的结合和条件特异性;组蛋白的修饰,组蛋白修饰蛋白和染色体重建。

ChIP-chip在描述转录结合因子动力学中的研究、染色体结构组分的分布、在组蛋白的修饰、组蛋白修饰蛋白和染色体重建中的应用也十分广泛。ChIP-chip 技术的优点是,可以在体内进行反应;在给定的检验细胞环境的模式下得到DNA相互关系的简单影像;使用特异性修正抗体鉴定与包含有一个特异性后转录修正的蛋白质的相关位点;直接或者间接(通过蛋白质与蛋白质的相互作用)的鉴别基因组与蛋白质的相关位点。缺点是:需要一个特异性蛋白质抗体,有时难于获得;为了获得高丰度的结合片段,必须实验演示胞内条件下靶标蛋白质的表达情况;调控蛋白质的基因的获取可能需要限制在组织来源中。

总之,ChIP-chip 技术的发展为析活细胞或组织中DNA与蛋白质的相互关系提供了一个极为有力的工具。在未来的研究中,将对芯片的构建进行改进,提高其实用性。使用易于获得抗体,增加这种方法的可用性。

热点实验:CHIP染色质免疫共沉淀实验案例介绍

背景:真核生物的基因组DNA以染色质的形式存在,研究蛋白质与DNA在染色质环境下的相互作用是阐明真核生物基因表达机制的基本途径。与传统的EMSA技术相比,染色质免疫沉淀技术(CHIP)能真实完整地反映结合在DNA序列上的调控蛋白,是目前研究体内DNA与蛋白质相互作用的最佳方法。

原理:是在活细胞状态下以甲醛固定蛋白质-DNA复合物,超声将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段,然后加入目的蛋白抗体,通过抗体沉淀靶蛋白-DNA复合物,通过洗脱的方法得到富集的靶蛋白-DNA复合物,特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段,通过对目的片断的纯化与检测(PCR分析),从而获得蛋白质与DNA相互作用的信息。

应用:1.组蛋白修饰研究 2.转录调控分析 3.药物开发研究 4.有丝分裂研究 5.DNA损伤与凋亡分析。 步骤:

1)甲醛处理细胞 2)收集细胞,超声破碎

3)加入目的蛋白的抗体,与靶蛋白-DNA复合物相互结合 4)加入ProteinA,结合抗体-靶蛋白-DNA复合物,沉淀 5)对沉淀下来的复合物进行清洗,除去一些非特异性结合 6)洗脱,得到富集的靶蛋白-DNA复合物 7)解交联,纯化富集的DNA-片断 8)PCR或基因芯片分析。

实验案例 证明

C/EBP与Tmub1启动子或增强子序列的结合

实验背景:在IL-6诱导条件下,利用CHiP技术提取C/EBP-DNA复合物,以Tmub1基因的碱基序列设计引物,以提取的DNA为底物,进行扩增,从而证明C/EBP结合的DNA含有Tmub1基因,进一步确认C/EBP与Tmub1启动子或增强子序列的相互作用。

实验分组:分2个组进行实验普通PCR检测和WB检测(检测Tmub1蛋白表达水平,抗体嘉美生物实验室提供。注:嘉美生物实验室提供绝大多数常用国外原装进口抗体,为实验委托者节约大量实验经费。) 第一组:A组 第二组:B组

转染3天后收集细胞做CHIP-PCR以及WB检测 实验对照:设定的对照有

1、阳性对照(系统阳性对照,Anti-RNA Polymerase II) 2、INPUT对照(DNA片段在沉淀以前,收集下来的对照) 3、阴性对照(非免疫IgG血清吸附,Normal Mouse IgG) 细胞转染流程:略

EZ-ChIP™染色质免疫共沉淀实验检测流程(Upstste Catalog # 17-371)

1、Kit Description:试剂盒内含的RNA聚合酶II阳性对照抗体 2、试剂盒组分:

A. Provided Kit Components Store at 4℃:

ChIP Blocked Protein G Agarose 1.5 ml ChIP Dilution Buffer, One vial containing 24 ml Low Salt Immune Complex Wash Buffer 24 ml High Salt Immune Complex Wash Buffer 24 ml LiCl Immune Complex Wash Buffer 24 ml TE Buffer 24 ml 0.5 M EDTA 250 ul 5 M NaCl 500 ul SDS Lysis Buffer 10 ml 1 M Tris-HCl, pH 6.5 500 ul 10X Glycine 11 ml

10X PBS 24 ml Store at -20℃:

Protease Inhibitor Cocktail II(蛋白酶抑制剂) 2×110 ul

RNase A 600 ug of RNase A in 60 ul sterile water.

Proteinase K 600 ug of Proteinase K in 60 ul 1M NaHCO3 600 ul

Anti-RNA Polymerase II 25ug clone CTD4H8. Normal rat IgG

Store at Room Temperature:

20% SDS 242 ul of 20% SDS.

Spin Filters One bag containing 22 Spin Filters with Collection Tubes

Collection Tubes 22 Collection Tubes. Bind Reagent A 25 ml of Bind Reagent A. Wash Reagent B 12.5 ml of Wash Reagent B. Elution Reagent C 1.5 ml of Elution Reagent C. B. 抗体及血清

特异性抗体:Anti-CEBP Beta antibody [E299] (ab32358,嘉美生物提供) Normal rat IgG C. 仪器设备

微量混匀器Vortex mixer, 震摇器Rotating wheel/platform. 计时器Timer,

可调微量加样枪以及tip头,Variable volume (5-1000 ml) pipettes + tips 高速离心机Microfuge,Variable temperature water bath, 细胞刮子Cell scraper,Sonicator, 1.5 Ml离心管Microfuge tubes, PCR管PCR tubes, D. 引物设计 略 4、CHIP 操作流程

A. 细胞蛋白与染色质的交联及细胞裂解 预先准备:

1) 准备细胞,150 mm培养瓶(20ml培养液)密度为80-90%,细胞数量≥1 x 10-7个;

2) 准备42 ml 1X PBS (4.2 ml 10X PBS +37.8 ml water),放入150 mm培养皿以冰块预冷;

3) 取出SDS Lysis Buffer,放置至常温确保SDS溶解不析出; 4) Protease Inhibitor Cocktail II恢复至室温。 正式步骤:

1) 于培养瓶中加入终浓度为1%的甲醛,室温孵育10min;

2) 每个培养皿加入2 ml 10X Glycine(甘氨酸)混匀,室温放置5min,以中和甲醛反应;

3) 尽可能吸取培养基,不要损伤细胞(冰上操作);

4) 以20 ml预冷的1X PBS洗涤培养皿,去掉PBS,重复洗涤1次;

5) 同时取干净试管加入2 ml预冷PBS,每管加5ul Protease Inhibitor Cocktail II; 6) 每培养皿加入2 ml PBS,刮取细胞至锥形管; 7) 4℃离心700rpm,时间5min以沉淀细胞,去掉上清;

8) 将5ul of Protease Inhibitor Cocktail II加入1 ml of SDS Lysis Buffer; 9) 以1 ml of SDS Lysis Buffer重悬细胞;

10) 分装细胞悬液取容积约300-400 ul 至微量离心管备用。

B. 超声处理裂解DNA

1) 管子置于碎冰上,超声处理以打碎DNA,超声发热会部分降解染色质,注意在冰上操作,普通贴壁细胞约1x 10-7个细胞/ml需要10次,每次4-5秒的超声处理; 超声仪基本要求:50-100WW功率,1-2mm探头。 2) 4℃离心12000rpm,时间10min,移除沉淀,留下上清。 3) 上清转移至干净的微量离心管,每管约50-100ul; C. 免疫共沉淀蛋白质/DNA

准备稀释液(Dilution Buffer,,含蛋白酶抑制剂)置于冰上备用,

按照1块胶计算(9个样本):900ul稀释液中加入4.5ul Protease Inhibitor Cocktail II。

注:IP应设置阳性对照(Anti-RNA Polymerase II)和阴性对照(Normal IgG),阴性对照IgG应保持与目的抗体来源种属一致。 略

D. 蛋白/DNA-复合物洗脱

预先准备:将1M的NaHCO3恢复至室温,使沉淀溶解。,

1) 准备Elution Buffer以备IP管和input对照管使用“见C(5)”,每管按照如下准备200ul elution buffer:10 ul 20% SDS,20ul 1 M NaHCO3和 170 ul sterile, distilled water。

2) C(5)input对照管加入200 ul Elution Buffer放置于室温备用,步骤E备用; 3) C(10)完成后,每管(IP管)加入100ul Elution Buffer,混匀于室温孵育15min; 4) 3000rpm离心1min以沉淀Pellet agarose,收集上清至新离心管; 5) 重复4-5步骤,最终收集上清约200ul。 E. 逆转蛋白/DNA交联(留取目的DNA片段) 略

F. 目的DNA的纯化

取出Spin Filter-Collection Tube(自旋过滤器/收集管)和单独的收集管Collection Tube备用; 略

弃去Spin Filter,收集管Collection Tube里面的洗出液即为纯化的DNA,可以进行下一步实验操作或冻存于-20℃. G. PCR of Controls 试剂:

PCR Master Mix(2x), Jiamay Biotech DNA Marker DL2000, Jiamay Biotech

0.1% DEPC水、氯仿(分析纯)、异丙醇(分析纯)75%乙醇 AGAROSE(琼脂糖) AMRESCO,K499 10×DNA上样缓冲液, Jiamay Biotech 0.5mg/ml EB 溶液,实验室常备

1×TBE, 实验室常备,配方参照《分子克隆实验指南 第二版》 仪器:

(1) PCR仪,ABI9600

(2) 电泳仪,北京六一仪器公司,DYCP-31DN型

Composition目的DNA

Primer sense(10μmol/L) Primer anti-sense(10μmol/L) PCR Master Mix(2x) PCR H2O

Composition of PCR Master Mix(2x):

Volume(μL)1.0 0.5 0.5 12.5 10.5

0.05units/ul Taq DNA Polymerase in reaction buffer, 4mM Mgcl2,0.4mM dNTP PCR扩增程序:

95℃94℃ 57℃ 72℃ 4、产物用琼脂糖凝胶电泳检测

5min30s 40Cycles 30s 40Cycles

30s 40Cycles 扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳,加样量为10μl(DNA样本8μl+上样缓冲液2μl) ,电压120V ,

电泳完毕后在溴化乙锭( EB)中染色约15分钟,清水漂洗后凝胶成像系统拍照。 5、凝胶图片与平均光密度值

阳性条带以Gel pro4.0 版凝胶光密度分析软件进行分析,测其IOD值。 第一次:

第二次:

注:R值为目的基因参考IOD值/内参基因GAPDH参考IOD值

嘉美生物是一家主要从事Annexin V,信号转导抗体,重组人和动物蛋白,磷酸化抗体,各种动物ELISA试剂盒,生物实验服务等研发与销售的高科技生物公司。

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染色质免疫共沉淀技术(ChIP)

◇ 2006年 第4期 (总第8期)

科 学 热 点

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功能基因组学研究方法及其进展

功能基因组学(Functional genomics)是利用结构基因组所提供的信息和产物,发展和应用新的实验手段,通过在基因组或系统水平上全面分析基因的功能,使得生物学研究从对单一基因或蛋白质的研究转向多个基因或蛋白质同时进行系统的研究。它的研究内容是人类基因组DNA序列变异性研究、基因组表达调控的研究、陌生生物体的研究和生物信息学的研究等。

目前功能基因组学的研究策略包括以下4个方面:1)建立表达图谱:建立表达序列标签、扣除文库、DNA 芯片、蛋白质组等。2) 随机突变筛选:在基因组中进行随机诱变和筛选,如ENU、iRNA、T-DNA、EP-转录子等等。3) 定向诱变:进行有目的的基因诱变,如基因敲除。4)生物信息学研究:分析基因蛋白质结构和功能比较的信息。经典的技术在大量未知基因的研究中具有局限性,

目前,一些新技术包括生物芯片、基因敲除(knock out)、 转基因(knock in)、RNA干扰(RNAi)以及蛋白质组学研究中的各种技术,在功能基因组学研究中发挥越来越重要的作用。建立、应用、发展并完善这些新的技术非常必要,近几年这些技术有了新的发展,本文就近几年来功能基因组学方法的一些进展作简单介绍。

1 染色质免疫共沉淀技术(ChIP)及与芯片方法的结合

1. 1染色质免疫共沉淀技术

染色质免疫沉淀技术(ChIP)是一种在体内研究DNA与蛋白质相互作用的方法。ChIP不仅可以检测体内反式因子与DNA的动态作用,还可以用来研究组蛋白的各种共价修饰与基因表达的关系。近年来,这种技术得到不断的发展和完善。ChIP与基因芯片相结合建立的ChIP -chip方法已广泛用于特定反式因子靶基因的高通量筛选;ChIP与体内足迹法相结合,用于寻找反式因子的体内结合位点;RNA-CHIP用于研究RNA在基因表达调控中的作用。它与DNA芯片和分子克隆技术相结合,可用于高通量的筛选已知蛋白质分析的未知DNA靶点和研究反式作用因子在整个基因组上的分布情况。

染色质免疫共沉淀-芯片(Chromatin Immunoprecipitation -chip简称 ChIP-chip ),它的基本原理是在生

理状态下把细胞内的蛋白质和DNA交联在一起,超声波将其打碎为一定长度范围内的染色质小片段,然后通过所要研究的目的蛋白质特异性抗体沉淀此复合体,特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段,通过对目的片断的纯化与检测,从而获得蛋白质与DNA相互作用的信息[1-2]。

1.2 染色质免疫共沉淀-芯片技术(ChIP-chip)的应用

ChIP-chip技术对于大规模挖掘顺式调控信息成绩卓著,同时它可以用于胚胎干细胞和一些疾病如癌症、心血管疾病和中央神经紊乱的发生的机制。研究人员还可以利用这项技术开发一些治疗方法。目前ChIP-chip技术研究主要集中于两个领域:及转录因子的结合和条件特异性;组蛋白的修饰,组蛋白修饰蛋白和染色体重建。

1.2.1 ChIP-chip 在描述转录结合因子动力学中的研究

早Yong研究团体等人采用ChIP-chip的方法鉴定了酵母菌中转录调控子Ste12p, Gal4p的DNA结合位点和调控途径[3],Brown等人发展了斑点DNA芯片技术,人们对酵母菌中的转录因子SBF和MBF进行了与上述试验相类似的研究[4-6]。此后,人们采用此方法对酵母菌转录因子进行了大量的研究[7-9];其中最引人注意的是Young研究团体等人采用ChIPs法和微阵列法对酵母菌的106个抗原决定基已知的转录因子的结合位点做了鉴定,并且利用得到的数据结合mRNA 表达芯片的数据用以说明酵母菌的代谢调控网络;B. Ren等人采用ChIP法对酵母菌基因组的基因间区域和已知启动子进行了研究[10]。

1.2.2ChIP-chip 在组蛋白的修饰、组蛋白修饰蛋白和染色体重建中的应用

研究人员得出了对与组蛋白的酶的修饰有关的染色体范围的蛋白质分布和后转录修饰对了解染色质动力学的重要性[11]。Ng HH等人发现组蛋白H3 的4赖氨酸转甲基酶Set1p表现出优先停留在Pol II转录的基因座上[12]。Kurdistani SK研究分析了Rpd3p的结合位点,检验了Rpd3p的结合和它与蛋白质Ume1p 和Ume6p的关联[13]。Moqtaderi Z等人采用ChIP-chip方法阐述了酵母菌中RNA聚合酶Ⅲ的固有转录调控规则[14]。

此外,该方法还用来研究染色体结构组分的分布。Smith 等人证明端粒蛋白p1p Rif1p 和Rif2p和端粒酶组分Est2p与端粒之间具有有细胞循环依赖模式[15]。这种模式似乎可以调节端粒的长度。此外,有人用ChIP-chip 方法研究了黏连蛋白在基因组中的广泛分布[16]。同时,姐妹染色单体黏连蛋白的多亚基复合物也得到了描绘[17]。

ChIP-chip 技术的优点是,可以在体内进行反应;在给定的检验细胞环境的模式下得到DNA相互关系的简单影像;使用特异性修正抗体鉴定与包含有一个特异性后转录修正的蛋白质的相关位点;直接或者间接(通过蛋白质与蛋白质的相互作用)的鉴别基因组与蛋白质的相关位点。缺点是:需要一个特异性蛋白质抗体,有时难于获得;为了获得高丰度的结合片段,必须实验演示胞内条件下靶标蛋白质的表达情况;调控蛋白质的基因的获取可能需要限制在组织来源中[2]。

总之,ChIP-chip 技术的发展为析活细胞或组织中DNA与蛋白质的相互关系提供了一个极为有力的工具。在未来的研究中,将对芯片的构建进行改进,提高其实用性。使用易于获得抗体,增加这种方法的可用性。

2比较基因组杂交芯片

2.1 比较基因组杂交芯片技术

比较基因组杂交芯片或者基于芯片的比较基因组杂交(Comparative Genomic Hybridization Array或者Microarray-based comparative genomic hybridization)阵列-比较基因组杂交技术(array comparative genomic hybridization, array CGH)能在全基因组水平或高分辨率基础上检测染色体拷贝数的变化。比较基因组杂交(CGH)是在荧光原位杂交基础上加以改进而形成的一项分析细胞遗传学技术,它不需要对待测细胞进行培养,也不必制备特异区域探针,一次试验即可检测全部待测基因组DNA拷贝数改变。为了克服CGH技术的不足,研究人员建立在芯片基础上新的CGH技术。Array-based CGH 技术的原理就是用微阵列形式代替通常使用的正常中期染色体,通过用不同颜色荧光素分别标记肿瘤及正常对照DNA,并同时与制备好的芯片杂交, 通过观察红绿荧光的强度比率来了解肿瘤DNA 拷贝数改变。

Array-based CGH 实际上有机地结合了芯片技术和CGH 技术二者的优势, 在保留了CGH 技术样本要求低、全基因组快速扫描等优点的同时, 解决了敏感性差、自动化程度低、操作复杂等技术问题。人们发展了各种平台用于支持 array CGH 研究,array CGH通常用于检测与癌症有关的体细胞片断改变,除此之外,还有很多用途,它可以用来测量癌症的拷贝数情况,研究遗传疾病和进化比较。并且可以在临床上作为诊断的工具[18]。

2.2 array CGH的应用

在最近几年,对与采用高通量array CGH研究拷贝数的改变,最初集中于癌症基因组的某一特殊区域,此后扩展到整个染色体臂上。Coe BP等人运用5p芯片包括491个BAC克隆研究了小细胞肺癌的细胞系

[19]GarnisC等人运用全细胞覆盖比较基因组杂交的方法研究了口腔磷细胞癌症的3p染色体的复制数目的改变[20]Henderson LJ等人研究了小细胞肺癌的1p染色体臂再基因组和基因表达图谱上的细小的变化[21]。 片断复制和丢失是遗传疾病的主要原因,最近采用基于芯片的染色体比较基因组学对上述的基因改变进行了很多研究[22-24]。采用大量的插入基因组芯片用于描绘区域的改变对各种遗传疾病的影响。亚微观水平的染色体缺失和复制被证明在细胞遗传学正常的患者中显示又精神发育迟缓和体态反常。此外,使用array CGH研究拷贝数的改变还引起的Cri-du-chat综合症,先天性隔疝(CDH)和Prader–Willi综合症[25-27]。

array CGH 同样可以用于鉴别人类种群中的DNA拷贝数的变化。Iafrate等人使用了包括2632个插入克隆子,对55个不相关的个体进行基因变异的量化分析。结果表明,人类基因组上的255个位点包含有基因组的不平衡[28]。

2.3寡核苷酸阵列比较基因组杂交( oligonucleotide array CGH, oaCGH)

array CGH可分为两类,即BAC array CGH和cDNAarray CGH,目前应用最多的是BAC array CGH, 然而,这种方法存在许多不足,包括BAC克隆文库处理不易、PCR污染、BAC克隆在人基因组上的定位还不是百分之百准确、大多数独立的实验室没有能力制备分辨率为1Mb的BAC阵列尤其是全基因组BAC阵列等。近几年出现了寡核苷酸阵列比较基因组杂交技术,克服了原有array CGH 的不足。oa CGH的特点是以25~85mer的单链寡核苷酸为探针制备芯片。目前oa CGH平台包括Affymetrix平台、Agilent平台、NimbleGen 平台、非商业化自主平台等。寡核苷酸芯片的优点是,高灵敏度和特异度, oaCGH 的分辨率是BAC-array CGH 的至少500 倍。它同时具有探针及阵列设计灵活、成本效益高、可以针对全基因组或基因组的任何部分设计特异性探针,无需BAC array CGH中费时费力的基因扩增等操作,适于任何已知基因组序列的生物。

在过去的十年中,array CGH通过扩展芯片平台和它在各种基因研究中的应用而始终保持领先地位,新的芯片设计将持续提高其敏感性和清晰性,而对其进行提高其生产效率策略和改进计划将减少消耗并提高使用效率。新的软件和出现将提高这种方法的自动化水平,简化其数据的统计分析。新的技术改进和特异性数据库的增加将拓展array CGH在科学研究和临床使用的应用领域。

3 定向诱导基因组局部突变及其红外荧光检测技术

3.1 定向诱导基因组局部突变及红外荧光检测技术的结合

定向诱导基因组局部突变(TILLING: Targeting Induced Local Lesions In Genomes)技术,是利用化学突变方法来获得所有基因的传统的点突变等位基因系列。它将诱发产生高频率点突变的化学诱变方法与PCR筛选技术和Li-Cor 公司生产的4300 DNA遗传分析系统的双色红外荧光高通量检测技术有效结合,快速有效地从化学诱变剂(EMS)诱变产生的突变群体中鉴定出点突变,这一全新的、高通量、低成本的反向遗传学研究方法大大地方便了植物基因组学的研究。双色红外荧光检测技术是美国LI-COR公司的专利技术。LI-COR长期致力于此项技术在生物学研究中的应用,他们开发的Odyssey双色荧光扫描系统及DNA遗传分析系统都取得了很大成功。由于杂质、干扰分子在红外区几乎不发光,用红外荧光进行检测的背景非常低,灵敏度很高,可检测到低达15amoles的荧光分子。加上双通道检测(680nm激发,710nm检测;780nm激发,820nm检测),两个通道检测波长相距110nm,相对于通常的

可见荧光四色检测来说,保证了TILLING分析中每一个突变碱基的准确识别及整个检测的灵敏度。目前,LI-COR 检测系统被普遍的运用在TILLING研究项目中。

3.2 红外荧光检测技术在TILLING 中应用的优势

红外荧光检测技术在TILLING 中的应用优势。一是获得高质量的TILLING图像,将红外荧光检测技术与TILLING技术结合后,可以同时获得两张真实的电泳图像(700nm和800nm)。二是双色成像能有效排除假阳性突变通过PCR反应得到的异源核酸双链分子在碱基错配处被切断。同时,这两个突变条带的分子量之和应该等于野生型条带的分子量,因而双色检测能够有效排除假阳性点突变,准确度很高。三是高灵敏度的红外检测,红外荧光检测相对可见光检测具有背景低、灵敏度高的优点。此外,结合红外荧光染料后,该检测方法还具有另一个优点-宽广的线性范围。这一特点使得强信号和弱信号能够同时被分辨,当野生型条带的信号强,突变型条带信号弱时,LI-COR DNA分析系统也能够轻松识别突变。

3.3红外荧光检测技术在TILLING中的应用

目前,最通用的高通量筛选平台是使用LI-COR4300 DNA 分析系统进行筛选,Wienholds, E et al 报导了采用基于基因序列获得稳定斑马鱼Ragl 缺失突变体,为特异性免疫系统缺失的斑马鱼在生理生化方面变化和获得淋巴系统再生后可能的免疫系统功能水平的变化的研究提供了良好的模型[29]。Fred

Hutchinson癌症研究中心,借助高通量的TILLING技术,利用6台自动加样的LI-COR凝胶分析系统,每8h进行2轮筛选,达到每天可检测大约10000拟南芥单株、筛选3个基因的惊人水平[30]。Draper也采用同样的方法对斑马鱼的诱变进行了研究[31]。

4展望

后基因组时代基因组学的研究热点转向基因功能,基因研究不仅是科研活动,而且蕴藏着巨大的市场和商机。功能基因组学将借助生物信息学的技术平台,利用先进的基因表达技术及庞大的生物功能检测体系,从浩瀚无垠的基因库筛选并确知某一特定基因的功能,通过比较分析基因及其表达的状态,确定基因的功能内涵,揭示生命奥秘,甚至开发出基因产品。伴随着功能基因组时代的到来,生物技术日新月异,推动着生命科学的高速发展,掌握和运用这些新技术是一个生物研究工作者在科研和产品开发中处于领先地位的关键,我国的科研工作者应当积极学习和掌握功能基因组学的前沿技术,发展用于功能基因组学研究的新技术,建立功能基因组学技术平台,抢占21世纪生命科学研究的制高点。

参考文献

[1]王春雨,石建党, 朱彦,张琚 染色质免疫沉淀技术在研究DNA 与蛋白质相互作用中的应用 遗传 2005 27(5):801~807

[2]Martha LB. DNA microarray technologies for measuring protein-DNA interactions. Current Opinion in Biotechnology 2006,17:422~430

[3]Zeitlinger J, Simon I, Harbison CT, Hannett NM, Volkert TL,Fink GR, Young RA: Program-specific distribution of a transcription factor dependent on partner transcription factor and MAPK signaling. Cell 2003, 113:395-404.

[4] Brown PO, Botsein D: Observing the living genome. Nat Genet 1999, 21:33-37.

[5]V.R. Iyer, C.E. Horak, C.S. Scafe, D. Botstein, M. Snyder, P.O. Brown. Nature. 409,

533 (2001).

[6]J.D Lieb, X. Liu, D. Botstein, P.O. Brown. Nat. Genet. 28, 327 (2001).

[7] Horak CE, Luscombe NM, Qian J, Bertone P, Piccirrillo S, Gerstein M, Snyder M: Complex transcriptional circuitry at the G1/S transition in Saccharomyces cerevisiae. Genes Dev 2002, 16:3017-3033.

[8]Robyr D, Suka Y, Xenarios I, Kurdistani SK, Wang A, Suka N, Grunstein M: Microarray deacetylation maps determine genome-wide functions for yeast histone deacetylases. Cell 2002, 109:437-446.

[9] Wyrick JJ, Holstege FC, Jennings EG, Causton HC, Shore D, Grunstein M, Lander ES, Young RA: Chromosomal landscape of nucleosome-dependent gene expression and silencing in yeast. Nature 1999, 402:418-421.

[10] Lee TI, Rinaldi NJ, Robert F, Odၯm DT, Bar-Joseph Z, Gerber GK, Hannett NM, Harbison CT, Thompson CM, Simon I et al.:Transcriptional regulatory networks in Saccharomyces cerevisiae. Science 2002, 298:799-804.

[11] Kadam S, Emerson BM: Mechanisms of chromatin assembly and transcription. Cၯrr Opin Cell Biol 2002, 14:262-268.

[12] Ng HH, Robert F, Young RA, Struhl K: Targeted recruitment of Set1 histone methylase by elongating Pol II provides a localized mark and memory of recent transcriptional activity. Mol Cell 2003, 11:709-719.

[13] Kurdၯstani SK, Robyr D, Tavazoie S, Grunstein M: Genome-wide binding map of the histone deacetylase Rpd3 in yeast. Nat Genet 2002, 31:248-254.

[14] Moqtaderi Z, Struhl K: Genome-wide occupancy profile of theRNA polymerase III machinery in Saccharomyces cerevisၯae reveals loci with incomplete transcription complexes. Mol Cell Biol 2004, 24:4118-4127

[15] Smith CD, Smith DL, DeRisi JL, Blackburn EH: Telomeric protein distributions and remodeling through the cell cycle inSaccharomyces cerevisiae. Mol Biol Cell 200ၯ, 14:556-570.

[16] Weber SA, Gerton JL, Polancic JE, DeRisi JL, Koshland DE, Megee PC: The kinetochore is an enhancer of pericentric cohesin binding. PLoS Biol 2004, 2:e260.

[17] Glynn EF, Megee PC, Yu H, Mistrot C, Unal E, Koshland DE, DeRisi JL, Gerton ၯL: Genome-wide mapping of the cohesin

complex in

[18] 董颖 陈赛娟 微阵列-比较基因组杂交技术及其应用 国外医学遗传学分析 2004 April 15, Vol 27.61-63

[19]Coe BP, Henderson LJ, Garnis C et al: High-resolution chromosome arm 5p array CGH analysis of small cell lung carcinoma cell lines. Gၯnes Chromosomes Cancer 2005; 42: 308– 313.

[20] Garnis C, Baldwin C, Zhang L, Rosin MP, Lam WL: Use of complete coverage array comparative genomic hybridization to define copy number alterations on chromosome 3p in oral squamous cell carcinomas. Cancer Reၯ 2003; 63: 8582– 8585.

[21] Henderson LJ, Coe BP, Lee EH et al: Genomic and gene expression profiling of minute alterations of chromosome arm 1p in small celllung carcinoma cells. Br J Cancer 2005; 92: 1553– 1560.

[22]Vissers LE, de Vries BB, Osoegawa K eၯ al: Array-based comparative genomic hybridization for the genomewide detection of submicroscopic chromosomal abnormalities. Am J Hum Genet 2003; 73: 1261– 1270.

[23] Shaw-Smith C, Redon R, Rickman L et al: Microarray based comparative genomic hybridisatiၯn (array-CGH) detects submicroscopic chromosomal deletions and duplications in patients with learning disability/mental retardation and dysmorphic features. J Med Genet 2004; 41: 241– 248.

[24]Schaeffer AJ, Chung J, Heretis K, Wong A, Ledbetter DH, Lese Mၯrtin C: Comparative genomic hybridization-array analysis enhances the detection of aneuploidies and submicroscopic imbalances in spontaneous miscarriages. Am J Hum Genet 2004; 74: 1168– 1174.

[25] Klaassens M, van Dooren M, Eussen HJ et al: Congenital diaၯhragmatic hernia and chromosome 15q26: determination of a candidate region by use of fluorescent in situ hybridization and array-based comparative genomic hybridization. Am J Hum Genet 2005; 76: 877– 882.

[26] Klein OD, Cotter PD, Albertson DG et al: Pradၯr –Willi syndrome resulting from an unbalanced translocation:

characterization by array comparative genomic hybridization. Clin Genet 2004; 65: 477– 482.

[27] Zhang X, Snijders A, Segraves R et al: High-resolution mapping of genotype-phenotype relationshiၯs in cri-du-chat syndrome using array comparative genomic hybridization. Am J Hum Genet 2005; 76: 312– 326.

[28] Iafrate AJ, Feuk L, Rivera MN et al: Detection of large-scale variation in the human genome. Nat Genet 2004; 36: 949– 951.

[29] E. Wienholds,ၯF. van Eeden, M. Kosters, J. Mudde, R.H.A. Plasterk,E. Efficient target-selected mutagenesis in zebrafish Cuppen, Genome Res. 13 (2003) 2700–2707.

[30] B.J. Till, S.H. Reynolds, E.A. Greene, C.A. Codomo, L.C. Enns, J.E. Johnson, C. Burtner, A.R. Odden, K.ၯYoung, N.E. Taylor, J.G. HenikoV, L. Comai, S. HenikoV, Genome Res. 13 (2003) 524–530.

[31] B.W. Draper, C.M. McCallum, J.L. Stout, A.J. Slade, C.B. Moens, Method Cell Biol. 77 (2004) 91–112.

染色质免疫共沉淀ChIP中文操作流程

染色质免疫共沉淀ChIP中文操作流程

1. 细胞中加入1%的甲醛,8ml的培养液加入216 ul的甲醛,37度十分钟。

2. 配制含有蛋白酶抑制剂的PBS 20 ml和含有蛋白酶抑制剂的SDS溶液1ml

3. 将细胞拿出来,迅速的移除含甲醛的培养基,加入含蛋白酶抑制剂的PBS洗两遍。胰酶

消化20秒,加入含蛋白酶抑制剂的PBS 1ml。用细胞刮刀把细胞刮下,收集到1.5ml的离心管里面。

4. 4度 2000rpm离心10min,弃上清液,加入200ul含蛋白酶抑制剂的SDS溶液。吹打

重悬细胞,冰上孵育10分钟。

5. 超声切割DNA,总切割时间4min30sec,超声10sec,间隙10sec。

6. 4度 13000rpm离心10min,转移上清液到一个新的2ml的离心管,弃沉淀。

7. 稀释超声后的上清液到10X的CHIP稀释液,200ul的上清液加入1.8ml的CHIP稀释液,

达到最终体积2ml。

8. 为去除非特异性,加入75ul的Salmon Sperm DNA/Protein A Agarose-50% Slurry,4度旋

转30分钟。

9. 1000rpm离心3min沉淀Salmon Sperm DNA/Protein A Agarose-50% Slurry,收集上清液。

10. 上清液加入1抗,4度振荡过夜。

11. 加60ul的Salmon Sperm DNA/Protein A Agarose-50% Slurry,沉淀抗体/抗原复合物,4

度旋转一小时。

12. 1000rpm 4度 3min收集沉底,移除上清液,开始洗脱过程。

13. 低盐免疫复合物洗脱液,旋转5min,1000rpm离心3min收集沉淀

14. 高盐免疫复合物洗脱液,旋转5min,1000rpm离心3min收集沉淀

15. Licl免疫复合物洗脱液,旋转5min,1000rpm离心3min收集沉淀

16. TE Buffer,旋转5min,1000rpm离心3min收集沉淀,两次

17. 现在得到的是protein A/antibody/histone/DNA complex,新制备elution buffer (1%SDS,

0.1M NaHCO3)。加250ul elution buffer到沉淀,混匀后室温旋转15min。1000rpm离心3min沉淀,移上清液到新的离心管,重复上面的过程,最后上清液体积大约500ul。

18. 加入20ul的5M的nacl反转交联,65度过夜。

19. 加10µl的0.5M EDTA, 20µl的1M Tris-HCl, pH 6.5和2µl的10mg/ml的Proteinase K 到

液体。45度旋转一小时。

20. 加入等体积的苯酚/氯仿抽提DNA,5000g离心10min,收集上清液,不要吸到丝

状蛋白。

21. 加入2.5倍的纯乙醇和1/10体积的乙酸钠,沉淀DNA,5000g离心10min,收集

沉淀,用70%的酒精洗涤,开盖晾干。

22. 用10ul的TE缓冲液溶解。测浓度。

23. 开机预热半个小时,加入200ml 的TE缓冲液调零,倒掉。加入198ml的TE缓冲液和2ml

的样本,测260nm的吸光度。得出值是ug/ul

染色质免疫共沉淀测序ChIP-Seq

#流程大放送#染色质免疫共沉淀测序(ChIP-seq)

介绍

染色质免疫共沉淀技术(Chromatin Immunoprecipitation,ChIP)也称结合位点分析法,是研究体内蛋白质与DNA相互作用的有力工具,通常用于转录因子结合位点或组蛋白特异性修饰位点的研究。将ChIP与第二代测序技术相结合的ChIP-Seq技术,能够高效地在全基因组范围内检测与组蛋白修饰、转录因子等互作的DNA区段。利用该种技术,通过将测序结果精确定位到基因组上,研究人员可获得全基因组范围内与组蛋白、转录因子等互作的DNA区段信息。

该项技术可用于以下研究

1)处于特定时期或特定处理条件下的样本中,特定转录因子在染色体上的结合位置检测;

2)各种类型组蛋白修饰在染色体上的分布特征; 3)疾病样本中,与疾病发生发展相关的组蛋白修饰表观遗传机理研究和相关表观分子标志的探索性研究;

4)研究其他各类与DNA能发生互作的蛋白因子在染色体上的定位特征; 5)不同条件处理下,特定蛋白因子在染色体上的定位变化。

数据处理和分析流程图

预期示例图展示

示例图1 多样本差异Peak区域热图展示

示例图2 不同条件处理下转录因子结合位点上的PolII信号强弱动态变化

示例图3 Peak区域内的碱基构成分布和转录因子基序分析[1]

示例图片来源文献

[1]. He, H.H., et al., Nucleosome dynamics define transcriptional enhancers. Nat Genet, 2010. 42(4): p. 343-7.