染色质免疫沉淀

范文一:CHIP(染色质免疫共沉淀)

一、超声剪切染色质

1.用37℃预温的1%PFA固定10-20min,使DNA与蛋白质交联

2.终止交联,加入终浓度为0.125M的甘氨酸

3.用预冷的PBS洗2次

4.用PBS将细胞刮下(5mlPBS+1mMPMSF+1mg/ml抑肽酶)

5.4500rpm5min(此阶段细胞沉淀可储存于-80℃)

6.弃上清,按200ul/106个细胞加入SDS lysis buffer(现加PMSF&coktail),冰上10min(4℃rotation 30min)

7.27G针头注射器吹打3遍,若有气泡离心

8.超声:不可有气泡,超两次后放到冰上

9.离心:4℃,12000rpm,20min,上清转移到15ml离心管

二、Ab沉淀目的染色质

1.用dilution buffer稀释至1ml

2.取50ul Input(也可取少量做lgG阴性对照,RNaseⅡ阴性对照)

备注:取450ul做lgGcontrol,剩余500ul

3.剩下的加一抗(5ul/ml),4℃rotate过夜

4.向样品中加入50ul ProteinA+Gbeads, 4℃rotate2h, 之后可在冰上沉淀一会

5.离心,1000rpm1min,留上清

6.洗珠子,1ml/5min/次,在4℃rotate,再在冰上静置5min,1000rpm1min。 洗涤顺序为:低盐溶液→高盐溶液→LicL(之前在4℃)→TE→TE(室温)

三、去除蛋白质

1.Elution buffer(1%SDS、0.1MNaHCO3;0.5gSDS,0.42gNaHCO3 in 50ml ddH20)+250uL RT15min rotate →离心1000rpm1min→上清(收集)→+250ulRT 10min →金属65℃5min→上清(收集)

2.上清+20ul5M NaCl

Input+450ul elution buffer+20ul 5M NaCl

65℃ 6-7h或过夜

3.10ul0.5MEDTA,20ul1MTris-HCl +2ul 10mg/ml 蛋白酶K(50℃1h)?

四、提纯DNA

1.加等体积(500ul)Tris-饱和酚,剧烈混匀,14500rpm10min, 取上清,加入500ulCHCl3混匀后14500rpm10min,取上清后再加入tRNA60ug (200ug/ml,3ul),加异丙醇500ul,离心14500rpm20min 弃上清

2.加70%酒精洗一遍,14500rpm5min,(要去掉上清,先倒掉,倒掉之后离心一下再扔掉液体)将管子倒扣空气晾干。

3.加30ul ddH2O 溶解,4℃过夜,-20℃保存。

范文二:染色质免疫共沉淀实验

一、 染色质免疫共沉淀简介

真核生物的基因组DNA以染色质的形式存在。因此,研究蛋白质与DNA在染色质环境下的相互作用是阐明真核生物基因表达机制的基本途径。染色质免疫沉淀技术

(chromatin immunoprecipitation assay, CHIP)是目前唯一研究体内DNA与蛋白质相互作用的方法。它的基本原理是在活细胞状态下固定蛋白质-DNA复合物,并将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段,然后通过免疫学方法沉淀此复合体,特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段,通过对目的片断的纯化与检测,从而获得蛋白质与DNA相互作用的信息。CHIP不仅可以检测体内反式因子与DNA的动态作用,还可以用来研究组蛋白的各种共价修饰与基因表达的关系。而且,CHIP与其他方法的结合,扩大了其应用范围:CHIP与基因芯片相结合建立的CHIP-on-chip方法已广泛用于特定反式因子靶基因的高通量筛选;CHIP与体内足迹法相结合,用于寻找反式因子的体内结合位点;RNA-CHIP用于研究RNA在基因表达调控中的作用。由此可见,随着CHIP的进一步完善,它必将会在基因表达调控研究中发挥越来越重要的作用。

染色质免疫共沉淀可以:(1)组蛋白修饰酶的抗体作为“生物标记”;(2)转录调控分析;(3)药物开发研究;(4)DNA损失与凋亡分析。 二、ChIP的一般流程

甲醛处理细胞---收集细胞,超声破碎---加入目的蛋白的抗体,与靶蛋白-DNA复合物相互结合---加入ProteinA,结合抗体-靶蛋白-DNA复合物,并沉淀---对沉淀下来的复合物进行清洗,除去一些非特异性结合---洗脱,得到富集的靶蛋白-DNA复合物---解交联,纯化富集的DNA-片断---PCR分析。

三、PCR分析

ChIP-chip技术对于大规模挖掘顺式调控信息成绩卓著,同时它可以用于胚胎干细胞和一些疾病如癌症、心血管疾病和中央神经紊乱的发生的机制。研究人员还可以利用这项技术开发一些治疗方法。目前ChIP-chip技术研究主要集中于两个领域:及转录因子的结合和条件特异性;组蛋白的修饰,组蛋白修饰蛋白和染色体重建。

ChIP-chip在描述转录结合因子动力学中的研究、染色体结构组分的分布、在组蛋白的修饰、组蛋白修饰蛋白和染色体重建中的应用也十分广泛。ChIP-chip 技术的优点是,可以在体内进行反应;在给定的检验细胞环境的模式下得到DNA相互关系的简单影像;使用

特异性修正抗体鉴定与包含有一个特异性后转录修正的蛋白质的相关位点;直接或者间接(通过蛋白质与蛋白质的相互作用)的鉴别基因组与蛋白质的相关位点。缺点是:需要一个特异性蛋白质抗体,有时难于获得;为了获得高丰度的结合片段,必须实验演示胞内条件下靶标蛋白质的表达情况;调控蛋白质的基因的获取可能需要限制在组织来源中。

总之,ChIP-chip 技术的发展为析活细胞或组织中DNA与蛋白质的相互关系提供了一个极为有力的工具。在未来的研究中,将对芯片的构建进行改进,提高其实用性。使用易于获得抗体,增加这种方法的可用性。

在PCR分析这一块,比较传统的做法是半定量-PCR。但是现在随着荧光定量PCR的普及,大家也越来越倾向于Q-PCR了。此外还有一些由ChIP衍生出来的方法。例如RIP(其实就是用ChIP的方法研究细胞内蛋白与RNA的相互结合,具体方法和ChIP差不多,只是实验过程中要注意防止RNase,最后分析的时候需要先将RNA逆转录成为cDNA);还有ChIP-chip(其实就是ChIP富集得到的DNA-片段,拿去做芯片分析,做法在ChIP的基础上有所改变,不同的公司有不同的做法,要根据公司的要求来准备样品)。

实验方法

原理 在保持组蛋白和DNA联合的同时,通过运用对应于一个特定组蛋白标记的生物抗体,染色质被切成很小的片断,并沉淀下来。

IP是利用抗原蛋白质和抗体的特异性结合以及细菌蛋白质的“prorein A”特异性地结合到免疫球蛋白的FC片段的现象活用开发出来的方法。

目前多用精制的prorein A预先结合固化在argarose的beads上,使之与含有抗原的溶液及抗体反应后,beads上的prorein A就能吸附抗原达到精制的目的。

实验材料 细胞样品

试剂、试

剂盒 甲醛甘氨酸PBSSDS Lysis Buffer洗脱液RNaseA蛋白酶Komega胶回收试剂盒

仪器、耗

材 离心管超声仪电泳仪离心机

实验步骤 一、细胞的甲醛交联与超声破碎( 第一天)

1. 取出1平皿细胞(10 cm平皿),加入243 ul 37%甲醛,使得甲醛的终浓度为1%(培养基共有9 ml)。

5. 细胞刮刀收集细胞于15 ml离心管中(PBS依次为5 ml,3 ml和3 ml)。预冷后2 000 rpm 5 min收集细胞。

6. 倒去上清。按照细胞量,加入SDS Lysis Buffer。使得细胞终浓度为每200ul含2×106个细胞。这样每100 ul溶液含1×106个细胞。再加入蛋白酶抑制剂复合物。假设MCF7长满板为5×106个细胞。本次细胞长得约为80%。即为4×106个细胞。因此每管加入400 ul SDS Lysis Buffer。将2管混在一起,共800 ul。

7. 超声破碎:VCX750,25%功率,4.5 s冲击,9 s间隙。共14次。

二、除杂及抗体哺育 ( 第一天)

1. 超声破碎结束后,10 000 g 4℃离心10 min。去除不溶物质。

2. 留取300ul做实验,其余保存于-80℃。

3. 300 ul中,100 ul加抗体做为实验组;100 ul不加抗体做为对照组;100 ul加入4 ul 5 M NaCl(NaCl终浓度为0.2 M),65℃处理3 h解交联,跑电泳,检测超声破碎的效果。

4. 在100 ul的超声破碎产物中,加入900 ul ChIP DilutionBuffer和20 ul的50×PIC。

再各加入60 ul ProteinA Agarose/SalmonSpermDNA。4℃颠转混匀1 h。

5. 1 h后,在4℃静置10 min沉淀,700 rpm离心1 min。

6. 取上清。各留取20 ul做为input。一管中加入1 ul抗体,另一管中则不加抗体。4℃颠转过夜。

三、检验超声破碎的效果 ( 第一天)

1. 取100 ul超声破碎后产物,加入4 ul 5M NaCl,65℃处理2 h解交联。

2. 分出一半用酚/氯仿抽提。电泳检测超声效果。

四、免疫复合物的沉淀及清洗( 第二天)

1. 孵育过夜后,每管中加入60 ul ProteinA Agarose/SalmonSperm DNA。4℃颠转2 h。

2. 4℃静置10 min后,700 rpm离心1 min。除去上清。

3. 依次用下列溶液清洗沉淀复合物。清洗的步骤:加入溶液,在4℃颠转10 min,4℃静置10 min沉淀,700 rpm离心1 min,除去上清。

洗涤溶液:

(1)low salt wash buffer-one wash

(2)highsalt wash buffer-one wash

(3)LiCl wash buffer-one wash

(4)TE buffer-two wash

4. 清洗完毕后,开始洗脱。

洗脱液的配方:100 ul 10%SDS,100 ul1M NaHCO3,800 ul ddH2O,共1 ml。

每管加入250 ul洗脱buffer,室温下颠转15 min,静置离心后,收集上清。重复洗涤一次。最终的洗脱液为每管500 ul。

5. 解交联:每管中加入20 ul 5M NaCl(NaCl终浓度为0.2 M)。

6. 混匀,65℃解交联过夜。

五、DNA样品的回收(第三天)

1. 解交联结束后,每管加入1 ul RNaseA(MBI),37℃孵育1 h。

2. 每管加入10 ul 0.5 M EDTA,20 ul1M Tris.HCl(PH6.5),2 ul 10 mg/ml蛋白酶K。45℃处理2 h。

3. DNA片段的回收----omega胶回收试剂盒。最终的样品溶于100 ul ddH2O。

六、PCR分析(第三天)

注意事项 1. 注意抗体的性质。抗体不同和抗原结合能力也不同,免染能结合未必能用在IP反

应。建议仔细检查抗体的说明书。特别是多抗的特异性是问题。

2. 注意溶解抗原的缓冲液的性质。多数的抗原是细胞构成的蛋白,特别是骨架蛋白,缓冲液必须要使其溶解。为此,必须使用含有强界面活性剂的缓冲液,尽管它有可能影响一部分抗原抗体的结合。另一面,如用弱界面活性剂溶解细胞,就不能充分溶解细胞蛋白。即便溶解也产生与其它的蛋白结合的结果,抗原决定族被封闭,影响与抗体的结合,即使IP成功,也是很多蛋白与抗体共沉的悲惨结果。

3. 为防止蛋白的分解,修饰,溶解抗原的缓冲液必须加蛋白每抑制剂,低温下进行实验。每次实验之前,首先考虑抗体/缓冲液的比例。抗体过少就不能检出抗原,过多则就不能沉降在beads上,残存在上清。缓冲剂太少则不能溶解抗原,过多则抗原被稀释。

范文三:ChIP染色质免疫沉淀技术

染色质免疫沉淀技术(Chromatin Immunoprecipitation,简称ChIP)是研究体内蛋白质与DNA相互作用的一种技术。它利用抗原抗体反应的特异性,可以真实地反映体内蛋白因子与基因组DNA结合的状况。特别是近年来由于该技术不断的发展和完善,其应用范围已经从研究目的蛋白与已知靶序列间的相互作用,发展到研究目的蛋白与整个基因组的未知序列的相互作用;从研究一个目的蛋白与DNA的相互作用,发展到研究两个蛋白与DNA共同结合的相互作用;从研究启动子区域的组蛋白的修饰,发展到研究结合在DNA序列上的蛋白复合物。随着对基因功能研究的不断深入,这项技术正越来越多的被应用于科研的各个领域。

chip技术的原理

染色质免疫沉淀技术的原理是:在生理状态下把细胞内的DNA与蛋白质交联在一起,通过超声或酶处理将染色质切为小片段后,利用抗原抗体的特异性识别反应,将与目的蛋白相结合的DNA片段沉淀下来。染色质免疫沉淀技术一般包括细胞固定,染色质断裂,染色质免疫沉淀,交联反应的逆转,DNA的纯化,以及DNA的鉴定。因为ChIP实验涉及的步骤多,结果的重复性较低,所以对ChIP实验过程的每一步都应设计相应的对照,而且对结果的分析也需要有一定的经验。对于刚刚开始使用ChIP技术的研究人员来说,使用成熟的商品化试剂盒和相关的技术服务会达到事半功倍的效果,比如millipore公司的EZ-ChIP试剂盒就是专门为初学者设计的入门产品。下面我们就最基本的实验步骤,实验中的小技巧以及需要注意的问题简单介绍一下。

1. 细胞固定

甲醛能有效的使蛋白质-蛋白质,蛋白质-DNA,蛋白质-RNA交联,形成生物复合体,防止细胞内组分的重新分布。甲醛的交联反应是完全可逆的,便于在后续步骤中对DNA和蛋白质进行分析。交联所用的甲醛终浓度为1%,交联时间通常为5分钟到1个小时,具体时间根据实验而定。值得注意的是,交联时间如果过长,细胞染色质难以用超声波破碎,影响ChIP结果,而且实验材料也容易在离心过程中丢失。交联时间如果过短,则交联不完全,产生假阴性。甲醛的交联反应可被加入的甘氨酸终止。

2. 染色质断裂

交联后的染色质可被超声波或Micrococcal Nuclease切成400~600 bp的片段(用琼脂糖凝胶电泳检测),以便暴露目标蛋白,利于抗体识别。超声波是使用机械力断裂染色质,容易引起升温或产生泡沫,这都会引起蛋白质变性,进而影响ChIP的效率。所以在超声波断裂染色质时,要在冰上进行,且要设计时断时续的超声程序,保证低温。另外,超声探头要尽量深入管中,但不接触管底或侧壁,以免产生泡沫。总超声时间也不要太长,以免蛋白降解。Micrococcal Nuclease可以将染色质切成一到几个核小体,比超声波处理的结果更精致,更均一(图1)。另外,酶反应的条件比较温和,对DNA和DNA-蛋白复合物的损伤较小,而且蛋白不易变性。酶处理染色质适用于新鲜的细胞或组织样品和冰冻样品。在研究组蛋白时,经常采用的研究方法。因为N-ChIP没经过甲醛固定,超声波处理会打断组蛋白和DNA的结合,所以只能选择酶处理染色质的方法。对于甲醛固定的样品,一般选择超声波处理方法。也有研究人员使用酶处理的方法研究甲醛固定较温和的样品。Millipore公司有商品化的Micrococcal Nuclease处理的ChIP试剂盒(EZ-Enzyme)提供。

染色质免疫沉淀中的对照与抗体选择

Input对照:

在进行免疫沉淀前,需要取一部分断裂后的染色质做Input对照。Input是断裂后的基因组DNA,需要与沉淀后的样品DNA一起经过逆转交联,DNA纯化,以及最后的PCR或其他方法检测。Input对照不仅可以验证染色质断裂的效果,还可以根据Input中的靶序列的含量以及染色质沉淀中的靶序列的含量,按照取样比例换算出ChIP的效率,所以Input对照是ChIP实验必不可少的步骤。

Beads选择:

接下来,利用目的蛋白质的特异抗体通过抗原-抗体反应形成DNA-蛋白质-抗体复合物,然后使用Agarose beads或Magna beads沉淀此复合物,特异性地富集与目的蛋白结合的DNA片段。再经过多次洗涤,除去非特异结合的染色质后,用SDS+NaHCO3洗脱免疫沉淀复合物。Magna beads是近年来出现的一种新型beads,它使用方便,不像Agarose beads那样容易破裂,所以在操作过程中更简单,而且免去了离心的步骤,节省不少时间。

抗体选择:

染色质免疫沉淀所选择的目的蛋白的抗体是ChIP实验成功的关键。因为在蛋白质与染色质交联结合时,抗体的抗原表位可能因为与结合位点的距离太近,不能被抗体识别,所以不能有效地在体内形成免疫沉淀复合物,直接影响ChIP的结果。所以不是所有的抗体都能做ChIP实验的,只有经过ChIP实验验证后的抗体才能确保实验结果的可靠性。

阳性与阴性对照:

在做ChIP实验时,一定要做好实验对照,因为没有对照,很难对实验结果的可靠性进行评估。阳性抗体和阴性抗体对照是最基本的实验对照。阳性抗体通常选择与已知序列相结合的比较保守的蛋白的抗体,常用的包括组蛋白抗体或RNA Polymerase II抗体等。阴性抗体通常选择目的蛋白抗体宿主的IgG或血清。目的蛋白抗体的结果与阳性抗体和阴性抗体的结果相比较,才能得出正确结论。另外,还应考虑目的蛋白抗体与DNA的非特异性结合的可能,所以通常还会选择一对阴性引物,即目的蛋白肯定不会结合的DNA序列,作为该抗体的阴性对照。最佳的阴性对照引物是在靶序列上游的一段与目的蛋白肯定不能结合的序列。如果目的蛋白没有商品化的适用于染色质免疫沉淀实验的抗体,只有其他用途的抗体时,可以先做蛋白质免疫沉淀(Immunoprecipitation)检测。如果抗体可以成功的沉淀蛋白,再进行染色质免疫沉淀实验的检测。

交联反应的逆转和DNA的纯化

用不含DNase的RNase和Proteinase K,65oC保温6小时逆转交联,经DNA纯化柱回收DNA或用酚氯仿抽提、乙醇沉淀纯化DNA。DNA纯化柱纯化DNA的质量高,有利于下一步PCR等方法的检测。因为甲醛不仅交联DNA-蛋白质,还交联蛋白质-蛋白质,所以还可以对DNA序列上的蛋白质复合物进行分析。在逆转交联时不使用Proteinase K,然后用丙酮回收有机相中的蛋白质,进行分析。

DNA的鉴定

最常用的DNA的鉴定方法是半定量PCR和Real-time PCR。由于启动子区域的序列具有多样性的特点,所以不同的细胞系或不同的动物品系的同一基因的启动子序列有可能不

同。而且启动子区域多富含CG的序列,其PCR条件可能需要相应调整。有条件可设计不止一对引物来反复验证ChIP实验的结果(图2)。

ChIP技术的应用

染色质免疫沉淀的DNA适用于多种分析方法。如果目的蛋白的靶序列是已知的或需要验证的,可采用狭缝杂交(Slot blot)的方法,把靶序列特异性探针与染色质免疫沉淀的DNA杂交,来验证目的蛋白与DNA靶序列的特异性结合。还可以根据靶序列设计引物,用半定量PCR的方法进行测定,或采用Real-time PCR方法进行定量分析。如果目的蛋白的靶序列是未知的或高通量的(high-throughput),可采用Southern杂交。但因为免疫沉淀的DNA量较少,所以在研究时通常要用PCR方法扩增DNA探针,再进行整个基因组扫描。还可以把沉淀的DNA克隆到载体中,进行测序,寻找该序列附近的开放阅读框,发现新的基因调节序列。

目前,随着人类基因组测序工作的基本完成,研究目的蛋白和整个基因组的相互作用逐渐成为研究的热点。由于基因组中的信息量非常大,上述常规方法通常无法满足科研的需要。近年来发展起来的ChIP-chip技术将基因组DNA芯片(chip)技术与染色质免疫沉淀技术(ChIP)相结合,为研究目的蛋白与整个基因组相互作用提供了可能。ChIP-chip 技术通过标记染色质免疫沉淀富集的DNA片段,和另一个被标记不同探针的对照组样品一起,与DNA芯片杂交,再利用各种生物信息学方法对收集到的信号进行分析,具体的实验步骤请参考Dr. Richard Young在Nature Protocols上的文章。ChIP-chip技术已经被广泛应用于研究转录因子在整个基因组中的信号网络染色质修饰机制在基因组中的调控,DNA的复制,修复以及修饰,基因的转录与核运输等诸多方面。

染色质免疫沉淀技术还可用于分析两种蛋白共同结合的DNA序列,即ChIP reChIP方法。ChIP reChIP是在第一次ChIP的基础上不解交联,而继续进行另一个目的蛋白的免疫沉淀,从而得到与两种目的蛋白都结合的DNA序列。值得注意的是,因为通过两次免疫沉淀富集的DNA量比较少,所以在分析时通常要把多次免疫沉淀的DNA浓缩后再进行操作。

近年来ChIP技术也被用于研究RNA-蛋白的相互作用,其原理与DNA类似,也包括甲醛固定,超声波破细胞,免疫沉淀,交联逆转,RNA纯化和RNA

鉴定等步骤。所不同的

是,交联逆转只用Proteinase K,要进行RNA纯化和不含RNase的DNase处理,分析时用RT-PCR,芯片杂交要用cDNA芯片等。

范文四:染色质免疫沉淀ChIP

染色质免疫沉淀(ChIP)实验指南及技术总结

ChIP是一项比较流行的研究转录因子(transcriptionfactor,TF)与启动子(promoter)相互结合的实验技术。由于ChIP采用甲醛固定活细胞或者组织的方法,所以能比较真实的反映细胞内TF与Promoter的结合情况。当用甲醛处理时,相互靠近的蛋白与蛋白,蛋白与核酸(DNA或RNA)之间会产生共价键。细胞内,当TF与Promoter相互结合(生物意义上的结合)时,它们必然靠的比较近,或者契合在一起,这个时候用甲醛处理,能使它们之间产生共价键。

染色质免疫沉淀分析(ChiP)是基于体内分析发展起来的方法,它的基本原理是在活细胞状态下固定蛋白质-DNA复合物,并通过超声或酶处理将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段,然后通过抗原抗体的特异性识别反应沉淀此复合体,特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段,通过对目的片断的纯化与检测,从而获得蛋白质与DNA相互作用的信息。它能真实、完整地反映结合在DNA序列上的调控蛋白,是目前确定与特定蛋白结合的基因组区域或确定与特定基因组区域结合的蛋白质的一种很好的方法。CHIP不仅可以检测体内反式因子与DNA的动态作用,还可以用来研究组蛋白的各种共价修饰与基因表达的关系。而且,CHIP与其他方法的结合,扩大了其应用范围:CHIP与基因芯片相结合建立的CHIP-on-chip方法已广泛用于特定反式因子靶基因的高通量筛选;CHIP与体内足迹法相结合,用于寻找反式因子的体内结合位点;RNA-CHIP用于研究RNA在基因表达调控中的作用。

一般ChIP的流程是:甲醛处理细胞---收集细胞,超声破碎---加入目的蛋白的抗体,与靶蛋白-DNA复合物相互结合---加入ProteinA,结合抗体-靶蛋白-DNA复合物,并沉淀---对沉淀下来的复合物进行清洗,除去一些非特异性结合---洗脱,得到富集的靶蛋白-DNA复合物---解交联,纯化富集的DNA-片断---PCR分析。

在PCR分析这一块,比较传统的做法是半定量-PCR。但是现在随着荧光定量PCR的普及,大家也越来越倾向于Q-PCR了。此外还有一些由ChIP衍生出来的方法。例如RIP(其实就是用ChIP的方法研究细胞内蛋白与RNA的相互结合,具体方法和ChIP差不多,只是实验过程中要注意防止RNase,最后分析的时候需要先将RNA逆转录成为cDNA);还有ChIP-chip(其实就是ChIP富集得到的DNA-片段,拿去做芯片分析,做法在ChIP的基础上有所改变,不同的公司有不同的做法,要根据公司的要求来准备样品)。

第一天:

(一)、细胞的甲醛交联与超声破碎。

1、取出1平皿细胞(10cm平皿),加入243 ul 37%甲醛,使得甲醛的终浓度为1%(培养基共有9ml)。

2、37摄氏度孵育10min。

3、终止交联:加甘氨酸至终浓度为0.125M。450 ul 2.5M甘氨酸于平皿中。混匀后,在室温下放置5min即可。

4、吸尽培养基,用冰冷的PBS清洗细胞2次。

5、细胞刮刀收集细胞于15ml离心管中(PBS依次为5ml,3ml和3ml)。预冷后2000rpm

5min收集细胞。

6、倒去上清。按照细胞量,加入SDS Lysis Buffer。使得细胞终浓度为每200ul含2×106个细胞。这样每100ul溶液含1×106个细胞。再加入蛋白酶抑制剂复合物。假设MCF7长满板为5×106个细胞。本次细胞长得约为80%。即为4×106个细胞。因此每管加入400ul SDS Lysis Buffer。将2管混在一起,共800ul。

7、超声破碎:VCX750,25%功率,4.5S冲击,9S间隙。共14次。

(二)、除杂及抗体哺育。

8、超声破碎结束后,10,000g 4oC离心10min。去除不溶物质。

留取300ul做实验,其余保存于-80oC。

300ul中,100ul加抗体做为实验组;100ul不加抗体做为对照组;100ul加入4ul5MNaCl(NaCl终浓度为0.2M),65oC处理3h解交联,跑电泳,检测超声破碎的效果。

9、在100ul的超声破碎产物中,加入900ulChIPDilutionBuffer和20ul的50×PIC。 再各加入60ulProteinAAgarose/SalmonSpermDNA。4oC颠转混匀1h。

10、1h后,在4oC静置10min沉淀,700rpm离心1min。

11、取上清。各留取20ul做为input。一管中加入1ul抗体,另一管中则不加抗体。4oC颠转过夜。

(三)、检验超声破碎的效果。

取100ul超声破碎后产物,加入4ul5MNaCl,65oC处理2h解交联。分出一半用酚/氯仿抽提。电泳检测超声效果。

第二天:

(一)、免疫复合物的沉淀及清洗。

12、孵育过夜后,每管中加入60ulProteinAAgarose/SalmonSpermDNA。4oC颠转2h。 13、4oC静置10min后,700rpm离心1min。除去上清。

14、依次用下列溶液清洗沉淀复合物。清洗的步骤:加入溶液,在4oC颠转10min,4oC静置10min沉淀,700rpm离心1min,除去上清。

洗涤溶液:a.low salt wash buffer-one wash

b.highsalt wash buffer-one wash

c.LiCl wash buffer-one wash

d.TE buffer-two wash

15、清洗完毕后,开始洗脱。洗脱液的配方:100ul10%SDS,100ul1MNaHCO3,800ulddH2O,共1ml。

每管加入250ul洗脱buffer,室温下颠转15min,静置离心后,收集上清。重复洗涤一次。最终的洗脱液为每管500ul。

16、解交联:每管中加入20ul 5M NaCl(NaCl终浓度为0.2M)。

混匀,65oC解交联过夜。

第三天:

(一)、DNA样品的回收

17、解交联结束后,每管加入1ulRNaseA(MBI),37oC孵育1h。

18、每管加入10ul0.5MEDTA,20ul1MTris.HCl(PH6.5),2ul10mg/ml蛋白酶K。 45oC处理2h。

19、DNA片段的回收----omega胶回收试剂盒。最终的样品溶于100ulddH2O。

(二)、PCR分析

范文五:染色质免疫沉淀(ChiP)分析

染色质免疫沉淀分析

(Chromatin Immunoprecipitation Assay, ChiP)

真核生物细胞状态是由内源和外源因素共同影响的,所有信号传递途径的终点都是DNA。DNA通过核蛋白复合物组成染色质,染色质基因调控的一个重要作用位点。转录激活因子和辅助抑制因子的研究显示存在一种新的调节机制 “组蛋白密码”,其信息存在于组蛋白的转录后修饰等过程中。该类修饰包括组蛋白磷酸化、乙酰化、甲基化、ADP-核糖基化等过程。随着越来越多组蛋白核心结构区域和羧端修饰的确定,组蛋白密码在控制和调节基因功能过程中的作用越来越明确。

参与修饰的酶根据其作用的不同而分类:如组氨酸乙酰转移酶(HATs)可以将乙酰基团转到组蛋白上;组蛋白去乙酰酶(HDACs)可以去除氨基酸上的乙酰基团;组蛋白甲基转移酶(HMTs)可以将甲基基团转移到组蛋白上等。不同组氨酸修饰标记对应于不同的生物学过程,它可以作为调节因子的作用位点,也可以用来改变染色质结构。

凝胶电泳迁移率改变分析(EMSA)是目前研究转录调控蛋白和相应核苷酸序列结合的常用方法,但是由于许多转录调控蛋白有相似或相同的DNA结合位点,这种体外分析获取的结果不一定能真实地反映体内转录调控蛋白和DNA结合状况。

染色质免疫沉淀分析(ChiP)是基于体内分析发展起来的方法,它能真实、完整地反映结合在DNA序列上的调控蛋白。它是目前确定与特定蛋白结合的基因组区域或确定与特定基因组区域结合的蛋白质的最好方法。

ChiP技术和芯片技术的结合有利于确定全基因组范围内染色体蛋白的分布模式以及组蛋白修饰情况。

图:ChiP技术的示意图:

甲醛处理使蛋白质与DNA交联;

超声波将染色质打断成一定大小;

通过抗体沉淀蛋白质-DNA交联复合体;

解除交联,纯化DNA;

实时定量PCR检测DNA的量

应用:

组蛋白修饰酶的抗体作为“生物标记”

转录调控分析

药物开发研究

有丝分裂研究

DNA损失与凋亡分析

试剂盒组分

 ssDNA/Protein A Agarose  ssDNA/Protein A agarose  ssDNA/Protein G Agarose  ChIP Dilution Buffer  Low salt wash buffer  High salt wash buffer  LiCl Wash Buffer  TE Buffer

 0.5M EDTA

 5M NaCL

 1M Tris-HCl, pH 6.5  SDS Lysis Buffer

范文六:染色质免疫共沉淀技术(ChIP)

◇ 2006年 第4期 (总第8期)

科 学 热 点

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功能基因组学研究方法及其进展

功能基因组学(Functional genomics)是利用结构基因组所提供的信息和产物,发展和应用新的实验手段,通过在基因组或系统水平上全面分析基因的功能,使得生物学研究从对单一基因或蛋白质的研究转向多个基因或蛋白质同时进行系统的研究。它的研究内容是人类基因组DNA序列变异性研究、基因组表达调控的研究、陌生生物体的研究和生物信息学的研究等。

目前功能基因组学的研究策略包括以下4个方面:1)建立表达图谱:建立表达序列标签、扣除文库、DNA 芯片、蛋白质组等。2) 随机突变筛选:在基因组中进行随机诱变和筛选,如ENU、iRNA、T-DNA、EP-转录子等等。3) 定向诱变:进行有目的的基因诱变,如基因敲除。4)生物信息学研究:分析基因蛋白质结构和功能比较的信息。经典的技术在大量未知基因的研究中具有局限性,

目前,一些新技术包括生物芯片、基因敲除(knock out)、 转基因(knock in)、RNA干扰(RNAi)以及蛋白质组学研究中的各种技术,在功能基因组学研究中发挥越来越重要的作用。建立、应用、发展并完善这些新的技术非常必要,近几年这些技术有了新的发展,本文就近几年来功能基因组学方法的一些进展作简单介绍。

1 染色质免疫共沉淀技术(ChIP)及与芯片方法的结合

1. 1染色质免疫共沉淀技术

染色质免疫沉淀技术(ChIP)是一种在体内研究DNA与蛋白质相互作用的方法。ChIP不仅可以检测体内反式因子与DNA的动态作用,还可以用来研究组蛋白的各种共价修饰与基因表达的关系。近年来,这种技术得到不断的发展和完善。ChIP与基因芯片相结合建立的ChIP -chip方法已广泛用于特定反式因子靶基因的高通量筛选;ChIP与体内足迹法相结合,用于寻找反式因子的体内结合位点;RNA-CHIP用于研究RNA在基因表达调控中的作用。它与DNA芯片和分子克隆技术相结合,可用于高通量的筛选已知蛋白质分析的未知DNA靶点和研究反式作用因子在整个基因组上的分布情况。

染色质免疫共沉淀-芯片(Chromatin Immunoprecipitation -chip简称 ChIP-chip ),它的基本原理是在生

理状态下把细胞内的蛋白质和DNA交联在一起,超声波将其打碎为一定长度范围内的染色质小片段,然后通过所要研究的目的蛋白质特异性抗体沉淀此复合体,特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段,通过对目的片断的纯化与检测,从而获得蛋白质与DNA相互作用的信息[1-2]。

1.2 染色质免疫共沉淀-芯片技术(ChIP-chip)的应用

ChIP-chip技术对于大规模挖掘顺式调控信息成绩卓著,同时它可以用于胚胎干细胞和一些疾病如癌症、心血管疾病和中央神经紊乱的发生的机制。研究人员还可以利用这项技术开发一些治疗方法。目前ChIP-chip技术研究主要集中于两个领域:及转录因子的结合和条件特异性;组蛋白的修饰,组蛋白修饰蛋白和染色体重建。

1.2.1 ChIP-chip 在描述转录结合因子动力学中的研究

早Yong研究团体等人采用ChIP-chip的方法鉴定了酵母菌中转录调控子Ste12p, Gal4p的DNA结合位点和调控途径[3],Brown等人发展了斑点DNA芯片技术,人们对酵母菌中的转录因子SBF和MBF进行了与上述试验相类似的研究[4-6]。此后,人们采用此方法对酵母菌转录因子进行了大量的研究[7-9];其中最引人注意的是Young研究团体等人采用ChIPs法和微阵列法对酵母菌的106个抗原决定基已知的转录因子的结合位点做了鉴定,并且利用得到的数据结合mRNA 表达芯片的数据用以说明酵母菌的代谢调控网络;B. Ren等人采用ChIP法对酵母菌基因组的基因间区域和已知启动子进行了研究[10]。

1.2.2ChIP-chip 在组蛋白的修饰、组蛋白修饰蛋白和染色体重建中的应用

研究人员得出了对与组蛋白的酶的修饰有关的染色体范围的蛋白质分布和后转录修饰对了解染色质动力学的重要性[11]。Ng HH等人发现组蛋白H3 的4赖氨酸转甲基酶Set1p表现出优先停留在Pol II转录的基因座上[12]。Kurdistani SK研究分析了Rpd3p的结合位点,检验了Rpd3p的结合和它与蛋白质Ume1p 和Ume6p的关联[13]。Moqtaderi Z等人采用ChIP-chip方法阐述了酵母菌中RNA聚合酶Ⅲ的固有转录调控规则[14]。

此外,该方法还用来研究染色体结构组分的分布。Smith 等人证明端粒蛋白p1p Rif1p 和Rif2p和端粒酶组分Est2p与端粒之间具有有细胞循环依赖模式[15]。这种模式似乎可以调节端粒的长度。此外,有人用ChIP-chip 方法研究了黏连蛋白在基因组中的广泛分布[16]。同时,姐妹染色单体黏连蛋白的多亚基复合物也得到了描绘[17]。

ChIP-chip 技术的优点是,可以在体内进行反应;在给定的检验细胞环境的模式下得到DNA相互关系的简单影像;使用特异性修正抗体鉴定与包含有一个特异性后转录修正的蛋白质的相关位点;直接或者间接(通过蛋白质与蛋白质的相互作用)的鉴别基因组与蛋白质的相关位点。缺点是:需要一个特异性蛋白质抗体,有时难于获得;为了获得高丰度的结合片段,必须实验演示胞内条件下靶标蛋白质的表达情况;调控蛋白质的基因的获取可能需要限制在组织来源中[2]。

总之,ChIP-chip 技术的发展为析活细胞或组织中DNA与蛋白质的相互关系提供了一个极为有力的工具。在未来的研究中,将对芯片的构建进行改进,提高其实用性。使用易于获得抗体,增加这种方法的可用性。

2比较基因组杂交芯片

2.1 比较基因组杂交芯片技术

比较基因组杂交芯片或者基于芯片的比较基因组杂交(Comparative Genomic Hybridization Array或者Microarray-based comparative genomic hybridization)阵列-比较基因组杂交技术(array comparative genomic hybridization, array CGH)能在全基因组水平或高分辨率基础上检测染色体拷贝数的变化。比较基因组杂交(CGH)是在荧光原位杂交基础上加以改进而形成的一项分析细胞遗传学技术,它不需要对待测细胞进行培养,也不必制备特异区域探针,一次试验即可检测全部待测基因组DNA拷贝数改变。为了克服CGH技术的不足,研究人员建立在芯片基础上新的CGH技术。Array-based CGH 技术的原理就是用微阵列形式代替通常使用的正常中期染色体,通过用不同颜色荧光素分别标记肿瘤及正常对照DNA,并同时与制备好的芯片杂交, 通过观察红绿荧光的强度比率来了解肿瘤DNA 拷贝数改变。

Array-based CGH 实际上有机地结合了芯片技术和CGH 技术二者的优势, 在保留了CGH 技术样本要求低、全基因组快速扫描等优点的同时, 解决了敏感性差、自动化程度低、操作复杂等技术问题。人们发展了各种平台用于支持 array CGH 研究,array CGH通常用于检测与癌症有关的体细胞片断改变,除此之外,还有很多用途,它可以用来测量癌症的拷贝数情况,研究遗传疾病和进化比较。并且可以在临床上作为诊断的工具[18]。

2.2 array CGH的应用

在最近几年,对与采用高通量array CGH研究拷贝数的改变,最初集中于癌症基因组的某一特殊区域,此后扩展到整个染色体臂上。Coe BP等人运用5p芯片包括491个BAC克隆研究了小细胞肺癌的细胞系

[19]GarnisC等人运用全细胞覆盖比较基因组杂交的方法研究了口腔磷细胞癌症的3p染色体的复制数目的改变[20]Henderson LJ等人研究了小细胞肺癌的1p染色体臂再基因组和基因表达图谱上的细小的变化[21]。 片断复制和丢失是遗传疾病的主要原因,最近采用基于芯片的染色体比较基因组学对上述的基因改变进行了很多研究[22-24]。采用大量的插入基因组芯片用于描绘区域的改变对各种遗传疾病的影响。亚微观水平的染色体缺失和复制被证明在细胞遗传学正常的患者中显示又精神发育迟缓和体态反常。此外,使用array CGH研究拷贝数的改变还引起的Cri-du-chat综合症,先天性隔疝(CDH)和Prader–Willi综合症[25-27]。

array CGH 同样可以用于鉴别人类种群中的DNA拷贝数的变化。Iafrate等人使用了包括2632个插入克隆子,对55个不相关的个体进行基因变异的量化分析。结果表明,人类基因组上的255个位点包含有基因组的不平衡[28]。

2.3寡核苷酸阵列比较基因组杂交( oligonucleotide array CGH, oaCGH)

array CGH可分为两类,即BAC array CGH和cDNAarray CGH,目前应用最多的是BAC array CGH, 然而,这种方法存在许多不足,包括BAC克隆文库处理不易、PCR污染、BAC克隆在人基因组上的定位还不是百分之百准确、大多数独立的实验室没有能力制备分辨率为1Mb的BAC阵列尤其是全基因组BAC阵列等。近几年出现了寡核苷酸阵列比较基因组杂交技术,克服了原有array CGH 的不足。oa CGH的特点是以25~85mer的单链寡核苷酸为探针制备芯片。目前oa CGH平台包括Affymetrix平台、Agilent平台、NimbleGen 平台、非商业化自主平台等。寡核苷酸芯片的优点是,高灵敏度和特异度, oaCGH 的分辨率是BAC-array CGH 的至少500 倍。它同时具有探针及阵列设计灵活、成本效益高、可以针对全基因组或基因组的任何部分设计特异性探针,无需BAC array CGH中费时费力的基因扩增等操作,适于任何已知基因组序列的生物。

在过去的十年中,array CGH通过扩展芯片平台和它在各种基因研究中的应用而始终保持领先地位,新的芯片设计将持续提高其敏感性和清晰性,而对其进行提高其生产效率策略和改进计划将减少消耗并提高使用效率。新的软件和出现将提高这种方法的自动化水平,简化其数据的统计分析。新的技术改进和特异性数据库的增加将拓展array CGH在科学研究和临床使用的应用领域。

3 定向诱导基因组局部突变及其红外荧光检测技术

3.1 定向诱导基因组局部突变及红外荧光检测技术的结合

定向诱导基因组局部突变(TILLING: Targeting Induced Local Lesions In Genomes)技术,是利用化学突变方法来获得所有基因的传统的点突变等位基因系列。它将诱发产生高频率点突变的化学诱变方法与PCR筛选技术和Li-Cor 公司生产的4300 DNA遗传分析系统的双色红外荧光高通量检测技术有效结合,快速有效地从化学诱变剂(EMS)诱变产生的突变群体中鉴定出点突变,这一全新的、高通量、低成本的反向遗传学研究方法大大地方便了植物基因组学的研究。双色红外荧光检测技术是美国LI-COR公司的专利技术。LI-COR长期致力于此项技术在生物学研究中的应用,他们开发的Odyssey双色荧光扫描系统及DNA遗传分析系统都取得了很大成功。由于杂质、干扰分子在红外区几乎不发光,用红外荧光进行检测的背景非常低,灵敏度很高,可检测到低达15amoles的荧光分子。加上双通道检测(680nm激发,710nm检测;780nm激发,820nm检测),两个通道检测波长相距110nm,相对于通常的

可见荧光四色检测来说,保证了TILLING分析中每一个突变碱基的准确识别及整个检测的灵敏度。目前,LI-COR 检测系统被普遍的运用在TILLING研究项目中。

3.2 红外荧光检测技术在TILLING 中应用的优势

红外荧光检测技术在TILLING 中的应用优势。一是获得高质量的TILLING图像,将红外荧光检测技术与TILLING技术结合后,可以同时获得两张真实的电泳图像(700nm和800nm)。二是双色成像能有效排除假阳性突变通过PCR反应得到的异源核酸双链分子在碱基错配处被切断。同时,这两个突变条带的分子量之和应该等于野生型条带的分子量,因而双色检测能够有效排除假阳性点突变,准确度很高。三是高灵敏度的红外检测,红外荧光检测相对可见光检测具有背景低、灵敏度高的优点。此外,结合红外荧光染料后,该检测方法还具有另一个优点-宽广的线性范围。这一特点使得强信号和弱信号能够同时被分辨,当野生型条带的信号强,突变型条带信号弱时,LI-COR DNA分析系统也能够轻松识别突变。

3.3红外荧光检测技术在TILLING中的应用

目前,最通用的高通量筛选平台是使用LI-COR4300 DNA 分析系统进行筛选,Wienholds, E et al 报导了采用基于基因序列获得稳定斑马鱼Ragl 缺失突变体,为特异性免疫系统缺失的斑马鱼在生理生化方面变化和获得淋巴系统再生后可能的免疫系统功能水平的变化的研究提供了良好的模型[29]。Fred

Hutchinson癌症研究中心,借助高通量的TILLING技术,利用6台自动加样的LI-COR凝胶分析系统,每8h进行2轮筛选,达到每天可检测大约10000拟南芥单株、筛选3个基因的惊人水平[30]。Draper也采用同样的方法对斑马鱼的诱变进行了研究[31]。

4展望

后基因组时代基因组学的研究热点转向基因功能,基因研究不仅是科研活动,而且蕴藏着巨大的市场和商机。功能基因组学将借助生物信息学的技术平台,利用先进的基因表达技术及庞大的生物功能检测体系,从浩瀚无垠的基因库筛选并确知某一特定基因的功能,通过比较分析基因及其表达的状态,确定基因的功能内涵,揭示生命奥秘,甚至开发出基因产品。伴随着功能基因组时代的到来,生物技术日新月异,推动着生命科学的高速发展,掌握和运用这些新技术是一个生物研究工作者在科研和产品开发中处于领先地位的关键,我国的科研工作者应当积极学习和掌握功能基因组学的前沿技术,发展用于功能基因组学研究的新技术,建立功能基因组学技术平台,抢占21世纪生命科学研究的制高点。

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范文七:染色质免疫共沉淀技术(ChIP)

甲醛处理细胞---收集细胞,超声破碎---加入目的蛋白的抗体,与靶蛋白-DNA复合物相互结合---加入ProteinA,结合抗体-靶蛋白-DNA复合物,并沉淀---对沉淀下来的复合物进行清洗,除去一些非特异性结合---洗脱,得到富集的靶蛋白-DNA复合物---解交联,纯化富集的DNA-片断---PCR分析。

在PCR分析这一块,比较传统的做法是半定量-PCR。但是现在随着荧光定量PCR的普及,大家也越来越倾向于Q-PCR了。此外还有一些由ChIP衍生出来的方法。例如RIP(其实就是用ChIP的方法研究细胞内蛋白与RNA的相互结合,具体方法和ChIP差不多,只是实验过程中要注意防止RNase,最后分析的时候需要先将RNA逆转录成为cDNA);还有

ChIP-chip(其实就是ChIP富集得到的DNA-片段,拿去做芯片分析,做法在ChIP的基础上有所改变,不同的公司有不同的做法,要根据公司的要求来准备样品)。

详细

实验方法

 染色质免疫共沉淀技术(ChIP)

实验材料

 细胞样品

试剂、试剂盒

 甲醛 甘氨酸 PBS SDS Lysis Buffer 洗脱液 RNaseA 蛋白酶K omega胶回收试剂盒

仪器、耗材

离心管

 超声仪

 电泳仪

 离心机 

真核生物的基因组DNA以染色质的形式存在。因此,研究蛋白质与DNA在染色质环境下的相互作用是阐明真核生物基因表达机制的基本途径。染色质免疫沉淀技术(chromatin immunoprecipitation assay, CHIP)是目前唯一研究体内DNA与蛋白质相互作用的方法。它的基本原理是在活细胞状态下固定蛋白质-DNA复合物,并将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段,然后通过免疫学方法沉淀此复合体,特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段,通过对目的片断的纯化与检测,从而获得蛋白质与DNA相互作用的信息。CHIP不仅可以检测体内反式因子与DNA的动态作用,还可以用来研究组蛋白的各种共价修饰与基因表达的关系。而且,CHIP与其他方法的结合,扩大了其应用范围:CHIP与基因芯片相结合建立的CHIP-on-chip方法已广泛用于特定反式因子靶基因的高通量筛选;CHIP与体内足迹法相结合,用于寻找反式因子的体内结合位点;RNA-CHIP用于研究RNA在基因表达调控中的作用。由此可见,随着CHIP的进一步完善,它必将会在基因表达调控研究中发挥越来越重要的作用。

染色体免疫共沉淀(Chromatin Immunoprecipitation,ChIP)是基于体内分析发展起来的方法,也称结合位点分析法,在过去十年已经成为表观遗传信息研究的主要方法。这项技术帮助研究者判断在细胞核中基因组的某一特定位置会出现何种组蛋白修饰。ChIP不仅可以检测体内反式因子与DNA的动态作用,还可以用来研究组蛋白的各种共价修饰与基因表达的关系。近年来,这种技术得到不断的发展和完善。采用结合微阵列技术在染色体基因表达调控区域检查染色体活性,是深入分析癌症、心血管疾病以及中央神经系统紊乱等疾病的主要代谢通路的一种非常有效的工具。

它的原理是在保持组蛋白和DNA联合的同时,通过运用对应于一个特定组蛋白标记的生物抗体,染色质被切成很小的片断,并沉淀下来。IP是利用抗原蛋白质和抗体的特异性结合以及细菌蛋白质的“prorein A”特异性地结合到免疫球蛋白的FC片段的现象活用开发出来的方法。目前多用精制的prorein A预先结合固化在argarose的beads上,使之与含有抗原的溶液及抗体反应后,beads上的prorein A就能吸附抗原达到精制的目的。实验最需要注意点就是抗体的性质。抗体不同和抗原结合能力也不同,免染能结合未必能用在IP反应。建议仔细检查抗体的说明书。特别是多抗的特异性是问题。其次,要注意溶解抗原的缓冲液的性质。多数的抗原是细胞构成的蛋白,特别是骨架蛋白,缓冲液必须要使其溶解。为此,必须使用含有强界面活性剂的缓冲液,尽管它有可能影响一部分抗原抗体的结合。另一面,如用弱界面活性剂溶解细胞,就不能充分溶解细胞蛋白。即便溶解也产生与其它的蛋白结合的结果,抗原决定族被封闭,影响与抗体的结合,即使IP成功,也是很多蛋白与抗体共沉的悲惨结果。再次,为防止蛋白的分解,修饰,溶解抗原的缓冲液必须加蛋白每抑制剂,低温下进行实验。每次实验之前,首先考虑抗体/缓冲液的比例。抗体过少就不能检出抗原,过多则就不能沉降在beads上,残存在上清。缓冲剂太少则不能溶解抗原,过多则抗原被稀释。

ChIP的一般流程:

甲醛处理细胞---收集细胞,超声破碎---加入目的蛋白的抗体,与靶蛋白-DNA复合物相互结合---加入ProteinA,结合抗体-靶蛋白-DNA复合物,并沉淀---对沉

淀下来的复合物进行清洗,除去一些非特异性结合---洗脱,得到富集的靶蛋白-DNA复合物---解交联,纯化富集的DNA-片断---PCR分析。

在PCR分析这一块,比较传统的做法是半定量-PCR。但是现在随着荧光定量PCR的普及,大家也越来越倾向于Q-PCR了。此外还有一些由ChIP衍生出来的方法。例如RIP(其实就是用ChIP的方法研究细胞内蛋白与RNA的相互结合,具体方法和ChIP差不多,只是实验过程中要注意防止RNase,最后分析的时候需要先将RNA逆转录成为cDNA);还有ChIP-chip(其实就是ChIP富集得到的DNA-片段,拿去做芯片分析,做法在ChIP的基础上有所改变,不同的公司有不同的做法,要根据公司的要求来准备样品)。

具体操作流程:

第一天:

(一)、细胞的甲醛交联与超声破碎。

1、取出1平皿细胞(10cm平皿),加入243 ul 37%甲醛,使得甲醛的终浓度为1%(培养基共有9ml)。

2、37摄氏度孵育10min。

3、终止交联:加甘氨酸至终浓度为0.125M。450 ul 2.5M甘氨酸于平皿中。混匀后,在室温下放置5min即可。

4、吸尽培养基,用冰冷的PBS清洗细胞2次。

5、细胞刮刀收集细胞于15ml离心管中(PBS依次为5ml,3ml和3ml)。预冷后2000rpm 5min收集细胞。

6、倒去上清。按照细胞量,加入SDS Lysis Buffer。使得细胞终浓度为每200ul含2×106个细胞。这样每100ul溶液含1×106个细胞。再加入蛋白酶抑制剂复合物。假设MCF7长满板为5×106个细胞。本次细胞长得约为80%。即为4×106个细胞。因此每管加入400ul SDS Lysis Buffer。将2管混在一起,共800ul。

7、超声破碎:VCX750,25%功率,4.5S冲击,9S间隙。共14次。

(二)、除杂及抗体哺育。

8、超声破碎结束后,10,000g 4oC离心10min。去除不溶物质。

留取300ul做实验,其余保存于-80oC。

300ul中,100ul加抗体做为实验组;100ul不加抗体做为对照组;100ul加入4ul5MNaCl(NaCl终浓度为0.2M),65oC处理3h解交联,跑电泳,检测超声破碎的效果。

9、在100ul的超声破碎产物中,加入900ulChIPDilutionBuffer和20ul的50×PIC。

再各加入60ulProteinAAgarose/SalmonSpermDNA。4oC颠转混匀1h。 10、1h后,在4摄氏度静置10min沉淀,700rpm离心1min。

11、取上清。各留取20ul做为input。一管中加入1ul抗体,另一管中则不加抗体。4oC颠转过夜。

(三)、检验超声破碎的效果。

取100ul超声破碎后产物,加入4ul5MNaCl,65oC处理2h解交联。分出一半用酚/氯仿抽提。电泳检测超声效果。

第二天:

(一)、免疫复合物的沉淀及清洗。

12、孵育过夜后,每管中加入60ulProteinAAgarose/SalmonSpermDNA。4oC颠转2h。

13、4oC静置10min后,700rpm离心1min。除去上清。

14、依次用下列溶液清洗沉淀复合物。清洗的步骤:加入溶液,在4oC颠转10min,4oC静置10min沉淀,700rpm离心1min,除去上清。

洗涤溶液:a.low salt wash buffer-one wash

b.highsalt wash buffer-one wash

c.LiCl wash buffer-one wash

d.TE buffer-two wash

15、清洗完毕后,开始洗脱。洗脱液的配方:100ul10%SDS,100ul1MNaHCO3,800ulddH2O,共1ml。

每管加入250ul洗脱buffer,室温下颠转15min,静置离心后,收集上清。重复洗涤一次。最终的洗脱液为每管500ul。

16、解交联:每管中加入20ul 5M NaCl(NaCl终浓度为0.2M)。

混匀,65oC解交联过夜。

第三天:

(一)、DNA样品的回收

17、解交联结束后,每管加入1ulRNaseA(MBI),37oC孵育1h。

18、每管加入10ul0.5MEDTA,20ul1MTris.HCl(PH6.5),2ul10mg/ml蛋白酶K。

45oC处理2h。

19、DNA片段的回收----omega胶回收试剂盒。最终的样品溶于100ulddH2O。

(二)、PCR分析

ChIP-chip技术对于大规模挖掘顺式调控信息成绩卓著,同时它可以用于胚胎干细胞和一些疾病如癌症、心血管疾病和中央神经紊乱的发生的机制。研究人员还可以利用这项技术开发一些治疗方法。目前ChIP-chip技术研究主要集中于两个领域:及转录因子的结合和条件特异性;组蛋白的修饰,组蛋白修饰蛋白和染色体重建。

ChIP-chip在描述转录结合因子动力学中的研究、染色体结构组分的分布、在组蛋白的修饰、组蛋白修饰蛋白和染色体重建中的应用也十分广泛。ChIP-chip 技术的优点是,可以在体内进行反应;在给定的检验细胞环境的模式下得到DNA相互关系的简单影像;使用特异性修正抗体鉴定与包含有一个特异性后转录修正的蛋白质的相关位点;直接或者间接(通过蛋白质与蛋白质的相互作用)的鉴别基因组与蛋白质的相关位点。缺点是:需要一个特异性蛋白质抗体,有时难于获得;为了获得高丰度的结合片段,必须实验演示胞内条件下靶标蛋白质的表达情况;调控蛋白质的基因的获取可能需要限制在组织来源中。

总之,ChIP-chip 技术的发展为析活细胞或组织中DNA与蛋白质的相互关系提供了一个极为有力的工具。在未来的研究中,将对芯片的构建进行改进,提高其实用性。使用易于获得抗体,增加这种方法的可用性。

范文八:染色质免疫共沉淀技术的发展

染色质免疫共沉淀技术的发展

姚汪劲松 发育生物学2013级 2013110046

摘要:本文主要介绍了染色质免疫沉淀技术的发展历程、基本原理和优缺点,并且介绍了反向染色质免疫沉淀技术,并对两种方法进行了比较。

关键词:染色质免疫共沉淀;反向染色质免疫共沉淀;应用,研究前景。

目前,不断发展的DNA和蛋白质相互作用的方法和技术已经成为研究DNA复制、重组、修复和转录的核心。其中凝胶阻滞实验(EMSA),报告基因分析,DNA微阵列,质谱分析法MS,酵母单杂交系统和染色质免疫共沉淀技术(ChIP)是被广泛应用于研究DNA和蛋白质相互作用的方法。

真核生物基因组DNA以染色质形式存在,研究蛋白质与DNA在染色质环境下的相互作用是阐明真核生物基因表达调控机制的基本途径。生物体内基因表达调控主要发生在转录过程中,转录调控是顺式作用元件(Cis-acting elements)如启动子(Promoter)、增强子(Enhancer)与反式作用因子(Trans-acting factors)相互作用的结果。基因组DNA的甲基化、组蛋白甲基化、乙酰化和磷酸化修饰,核小体重新定位及染色体结构重建都影响调控。转录调控具有细胞类型、发育阶段和外界环境刺激的差异性,哺乳动物转录调控序列分散在较大区域,组蛋白修饰状态达100多种,这些因素都增加了转录调控的复杂性。

ChIP是一种在体内研究转录因子和靶基因启动子区域直接相互作用的方法,可以在体内直接确定它们之间相互作用方式的动态变化,能够得到转录因子结合位点的信息,确定其直接靶基因。它早期多被用于研究核小体上的DNA和组蛋白的相互作用以及组蛋白的修饰等方面。近年来,随着生物技术的迅速发展,ChIP技术不断发展和完善,被广泛应用于体内转录调控因子与靶基因启动子上特异核苷酸序列结合方面的研究,并成为在染色质水平研究基因表达调控的有效方法。特别是,此技术与DNA芯片和分子克隆技术相结合,可用于高通量筛选已知蛋白因子的未知DNA靶位点和研究反式作用因子在整个基因组上的分布情况,这将有助于深入研究DNA与蛋白质相互作用的调控网络。

ChIP技术由Orlando等于1997年创立。其基本原理为将处于适当生长时期的活细胞用甲醛交联后将细胞裂解,染色体分离并打碎为一定大小的片段;然后用特异性抗体免疫沉淀目标蛋白与DNA交联的复合物,对特定靶蛋白与DNA片段进行富集。采用低pH值条件反交联,DNA与蛋白质之间的Schiff键水解,释放DNA片段。通过对目标片段的纯化与检测,获得DNA与蛋白质相互作用的序列信息。在上述ChIP过程中,甲醛能够进入细胞并使蛋白质与DNA或蛋白质与蛋白质之间通过希弗(Scihff)键交联,形成稳定结合的复合物。如果交联效果不太好,可以先用交联剂DMA(Dimethyl adipimidate)或DSG (Disuccnimidyl glutarate)处理细胞,以加强后续甲醛交联的效果。破碎DNA可采用超声物理破碎或特定酶切消化,以获得所需长度的DNA片段。由于DNA片段长度将影响抗体免疫沉淀效率,因此破碎DNA是ChIP实验成功与否的重要因素。超声效果与细胞裂解是否充分、细胞浓度及裂解液成分等因素有关。超声处理后的液体应从浑浊状态变为透明状态。选择专一性及亲和力较高的抗体是ChIP成功的关键。非特异性抗体将增加大量的非目标靶点DNA片段信息,从而掩盖了真实的蛋白质结合位点信息;而亲和力较差的抗体,则无法获得高信噪比靶点DNA片段。另一方面,在甲醛交联过程中可能会掩盖一些蛋白质的表位,这会影响到一部分蛋白质和DNA复合体的免疫沉淀反应。因此,用Western印迹或免疫组化等常用的实验方法证明的能够对目标蛋白质进行免疫结合的抗体,并不能保证一定能够成功地进行ChIP实验。例如,Weitsman 等检验了不同的雌激素受体β抗体在ChIP中的免疫沉淀能力, 发现有的抗体虽然能够在标准免疫沉淀条件下与抗原结合,但不适合ChIP条件下使用,并

且不同抗体的结合效率也有差异。对于某一目标蛋白采用多种抗体组合来进行ChIP实验是一种有效的方案。例如,Chen 等针对CTCF在人类基因组中的结合位点研究,采用了多种不同单克隆抗体的混合物进行免疫沉淀。另外,有人利用表位附加标记技术表达融合蛋白进行免疫沉淀实验。常用的表位附加标记有红血球凝集素(Hemagglutinin)、生物素和c-Myc等。但哺乳动物细胞中难以引入表位附加标记的融合蛋白,并且其表达往往不同于其内源转录因子。染色质免疫沉淀获得的DNA数量往往很多,其中包含大量的非特异结合造成的背景噪音,采用严格的洗涤条件可以降低背景。Ogryzko等将靶蛋白与生物素受体片段融合表达, 通过抗生物素磁珠免疫沉淀,二者较强的结合力便于进行更为严谨的洗涤,达到降低背景的目的。

与传统的研究转录因子和DNA相互作用的方法相比,染色质免疫共沉淀技术是一种在体内研究DNA与蛋白质相互作用的理想方法。ChIP的优点在于能够在体内捕获转录因子和靶基因的相互作用,能同时快速地提供一种或者多种基因的调控机制,因此有巨大的应用价值。ChIP技术也有一定的局限性:第一,该技术需要抗目的蛋白或者特殊修饰标签的高度特异性抗体。第二,假阴性信号可能源于无效的抗体结合或者在交联过程中抗原受到干扰。第三,甲醛固定可能是暂时的,甚至是非特异的,可能导致相邻的蛋白形成假阳性信号。针对以上三方面,推荐在交联之后和抗体沉淀之前绘制一条标准曲线,以确定每次实验所需染色质的最佳量,确保材料的起始量相等。当检测的染色质模版(目的抗体的染色质免疫沉淀物)扩增出可检测的条带时,将染色质样品连续稀释以确定关键点;而此时对照(mock ChIPed)染色质模版需要浓缩以扩增出可见的条带。总之,染色质免疫共沉淀的步骤是需要精确的且要求一系列的预实验。第四,难以同时得到多个蛋白质对同一序列结合的信息等。反向染色质免疫共沉淀技术(reverse chromatin immunoprecipitation assay,Reverse ChIP)可以弥补这个缺陷,并且能定性、定量地准确鉴定目的蛋白质。Reverse ChIP是一种在体内状态下分析DNA和蛋白质相互作用的新方法。它用特异的核酸探针捕获靶DNA片段及与其相结合的蛋白质。蛋白质用质谱仪检测,以确定靶DNA位点全部相关的蛋白质。这种技术可对靶DNA位点相关蛋白质进行全面、系统地鉴定,特别能找到已知DNA元件相应的调节蛋白。其在发现鉴定、靶DNA位点相关蛋白质和研究DNA和蛋白质相互作用方面有重要的应用价值。

研究DNA-蛋白质相互作用的技术方法有多种,但研究体内状态下的方法仅有染色质免疫共沉淀技术(ChIP)。而该方法尚存在不足,如:难以同时得到多个蛋白质对同一序列结合的信息等。Reverse ChIP技术正好能弥补这些缺陷,并且可定性定量地准确鉴定目标蛋白质。由于DNA探针杂交技术和质谱方法的进步,Kingston和Déjardin于2009 年1 月建立了PICh(proteomics of isolated chromatin segments)技术,来验证端粒相关蛋白质。 Mittler,Butter 和Mann于2009年1月 建 立 了SILAC(stable isotope labeling with amino acids in cell culture)技术,来分析靶DNA位点相关蛋白质。2009年3月,Rusk把这两种方法综合到一起,做了简要介绍,并将其命名为reverseChIP技术。

ReverseChIP技术的核心是用DNA探针捕获靶DNA片段及与其相关的蛋白质。其基本原理是在活细胞状态下用甲醛固定细胞,以交联DNA-蛋白质的复合物。然后将此复合物超声切断为一定长度的染色质片段,用以脱硫生物素为标记物的DNA探针与靶DNA片段杂交,形成稳定的DNA探针-靶DNA片段及其相关蛋白质的杂交体。之后用亲和素磁珠结合脱硫生物素,以捕获此杂交体,离心得到的磁珠与杂交体被洗脱液洗脱,杂交体被游离出来。 加入交联反转液,使DNA-蛋白质复合物解交联,电泳得到靶DNA位点相关蛋白质,经纯化后,再进入质谱仪进行检测,以达到确定靶DNA位点全部相关蛋白质的目的,进而获得DNA-蛋白质相互作用的定性定量信息。

与目前其它研究DNA-蛋白质相互作用的技术方法相比,Reverse ChIP技术具有以下优

点:(1)可以同时得到靶DNA位点上多个蛋白质结合的信息;(2)此技术不使用抗体,只需要合成特定序列的DNA探针,以用来分析任何靶DNA位点上的相关蛋白质;(3)Reverse ChIP技术具有很高的灵敏度,可以用来分析低丰度的相关蛋白质;(4)能定性定量地鉴定相关蛋白质。由于该项技术发明时间尚短,亦存在一定的不足。如依赖核酸杂交以检测与靶DNA相结合的蛋白质,可能因探针与某些非靶DNA杂交而产生干扰.又如该技术需要纯化足够量的蛋白质,以满足质谱检测的需要,这可能要求大量的起始材料,也就是说需要处理大量的细胞。

随着功能基因组学研究的深入开展,在染色质水平研究基因的表达调控,是全面阐明真核基因表达调控机制的必经之路。染色质免疫共沉淀技术不仅可以检测体内反式因子与DNA的动态作用,还可以用来研究组蛋白的各种共价修饰与基因表达的关系。该技术被广泛应用于组蛋白转录后调控,组蛋白变体,转录因子,位于基因组或已知基因座上的染色质调控酶的定位等方面的研究。ChIP技术的应用使核蛋白和DNA的相互作用在基因表达、细胞分化或者抗病性等方面的研究有了很大的突破。特别是,ChIP技术能够揭示转录因子的结合位点和确定直接的靶基因序列,可在体内分析特定启动子的分子调控机制,因此被广泛应用于转录调控机制的研究方面。另外,以ChIP技术为基础的多种技术的应用,能够确定转录因子的结合基元,为转录因子生物学的研究提供了重要方法。染色质免疫共沉淀技术与其它方法的结合,扩大了其应用范围。近年来,ChIP技术与DNA微阵列芯片技术或高通量测序技术结合已经广泛应用于特定反式因子靶基因的高通量筛选方面,能够作出组蛋白修饰,组蛋白变体,整个基因组范围内转录因子的图谱。RNA-ChIP用于研究RNA在基因表达调控中的作用。由此可见,随着ChIP技术的进一步完善,它必将会在基因表达调控研究中发挥越来越重要的作用。

参 考 文 献

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范文九:染色质免疫共沉淀技术(CHIP)

染色质免疫共沉淀技术(ChIP)

关键词:染色质免疫沉淀2012-03-13 15:07 来源:互联网点击次数:12483 真核生物的基因组DNA以染色质的形式存在。因此,研究蛋白质与DNA在染色质环境下的相互作用是阐明真核生物基因表达机制的基本途径。染色质免疫沉淀技术(chromatin immunoprecipitation assay, CHIP)是目前唯一研究体内DNA与蛋白质相互作用的方法。它的基本原理是在活细胞状态下固定蛋白质-DNA复合物,并将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段,然后通过免疫学方法沉淀此复合体,特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段,通过对目的片断的纯化与检测,从而获得蛋白质与DNA相互作用的信息。CHIP不仅可以检测体内反式因子与DNA的动态作用,还可以用来研究组蛋白的各种共价修饰与基因表达的关系。而且,CHIP与其他方法的结合,扩大了其应用范围:CHIP与基因芯片相结合建立的CHIP-on-chip方法已广泛用于特定反式因子靶基因的高通量筛选;CHIP与体内足迹法相结合,用于寻找反式因子的体内结合位点;RNA-CHIP用于研究RNA在基因表达调控中的作用。由此可见,随着CHIP的进一步完善,它必将会在基因表达调控研究中发挥越来越重要的作用。

染色体免疫共沉淀(Chromatin Immunoprecipitation,ChIP)是基于体内分析发展起来的方法,也称结合位点分析法,在过去十年已经成为表观遗传信息研究的主要方法。这项技术帮助研究者判断在细胞核中基因组的某一特定位置会出现何种组蛋白修饰。ChIP不仅可以检测体内反式因子与DNA的动态作用,还可以用来研究组蛋白的各种共价修饰与基因表达的关系。近年来,这种技术得到不断的发展和完善。采用结合微阵列技术在染色体基因表达调控区域检查染色体活性,是深入分析癌症、心血管疾病以及中央神经系统紊乱等疾病的主要代谢通路的一种非常有效的工具。

它的原理是在保持组蛋白和DNA联合的同时,通过运用对应于一个特定组蛋白标记的生物抗体,染色质被切成很小的片断,并沉淀下来。IP是利用抗原蛋白质和抗体的特异性结合以及细菌蛋白质的“prorein A”特异性地结合到免疫球蛋白的FC片段的现象活用开发出来的方法。目前多用精制的prorein A预先结合固化在argarose的beads上,使之与含有抗原

范文十:国外ChIP-染色质免疫共沉淀实验方法-realtimePCR

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) Analysis for Protein-DNA Interactions

Weike Si, 6/22/05; Commented by TCH 8/6/05

ChIP is a widely used method to identify specific proteins associated with a

region of the genome, or in reverse, to identify regions of the genome

associated with specific proteins. These proteins can be isoforms of

histones modified at a particular amino acid or other chromatin associated

proteins. When employed with antibodies that recognize histone

modifications, ChIP can be used to “measure” the amount of the

modification. An example of this would include measurement of the amount

of histone H3 acetylation associated with a specific gene promoter region

under various conditions that might alter expression of the gene. Histones

are not the only proteins that can be studied using this technique. Much of

the recent interest has been in analyzing transcription factor distribution

throughout the genome or at specific loci.

When performing ChIP, cells are first fixed with formaldehyde to

crosslink proteins to DNA and then chromatin is harvested from the cells

and subjected to an immunoselection process, which requires the use of

specific antibodies. Any DNA sequences cross-linked to the protein of

interest will co-precipitate as part of the chromatin complex. After the

immunoselection of chromatin fragments and purification of associated

DNA, the detection of specific DNA sequences is performed. If the DNA

which will be detected is associated with the protein or histone modification

being examined, the relative representation of that DNA sequence will be

increased (or enriched) by the immunoprecipitation process.

Generally, standard PCR is performed to identify the DNA sequence

(the gene or region of the genome) associated with the protein of interest.

The relative abundance of a specific DNA sequence isolated via the

protein-specific immunoselection is compared to DNA obtained when using

an unrelated antibody control. DNA fragments are run on gels to facilitate quantitation of the PCR products. A much more accurate alternative to standard PCR is real time quantitative PCR (RT-qPCR). Cloning of

sequences from a ChIP experiment is also possible, to create libraries of fragments that are enriched for those that interact with a particular protein. The combination of chromatin IP with microarray applications (ChIP on chip) is a novel technique that is becoming more popular, allowing the generation of genome-wide maps of protein-DNA interactions or histone modifications.

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hiTE Buffer: 50mM Tris-HCl, 10mM EDTA, pH 7.5.

PBS: 10mM Na2HPO4 (dibasic, anhydrous), 2mM KH2PO4 (monobasic, anhydrous), pH 7.4, 150mM NaCl, 10mM sodium phosphate.

Formaldehyde: from Fisher Scientific

ChIP Lysis Buffer: 50mM HEPES/KOH pH 7.5, 150mM NaCl, 1mM EDTA, 1% Triton X-

100, 0.1% SDS, 0.1% sodium deoxycholate. Add protease inhibitors prior to use.

High Salt ChIP Wash Buffer: 50mM HEPES, pH 7.5 by KOH, 500mM NaCl, 1mM EDTA, 1% Triton X-100,0.1% SDS, 0.1% sodium deoxycholate. Add protease inhibitors prior to use. Protease Inhibitor Cocktail: Complete Protease Inhibitor Cocktail tablets (Roche Biochemicals). One tablet per 10ml of PBS or Lysis Buffer.

ChIP Elution Buffer: hiTE Buffer containing 1% SDS.

Protein A/G agarose: Sepharose 4B Protein G beads (GE Health Amersham Pharmacia). Glycine: 2.5M Glycine.

Sonicator: Fisher Scientific F60 Model

5M NaCl

One of the important parameters for ChIP assay is to establish optimal conditions required for shearing cross-linked DNA to 200-1000 base pairs in length. Optimal conditions required for shearing cross-linked DNA to 200-1000 base pairs in length depend on the cell type, cell concentration per lysis buffer and the

sonicator equipment, including the power settings and number of pulses.

We are using Fisher’s F60 Sonicator and our experience shows DNA is sheared to the

appropriate length with 12-second pulses x 4-5 (i.e., keep 1~2min. between pulses; make

sure samples are on ice all times) at 80% of maximum power (i.e., Setting = 14). Once

sonication conditions have been optimized, keep cell number consistent for subsequent

experiments. You’re strongly encouraged to optimize the DNA shearing condition using the

following two methods. Method #1 is simplistic and should be initially used to obtain the

preliminary settings for further testing described in Method #2. If you have already obtained

some of the sonication conditions, you can directly proceed with Method #2.

Be sure to keep the sample on ice at all times as the sonication generates heat which

will denature the DNA and proteins. Check the size of sonicated DNA by gel

electrophoresis after reversion of cross-links.

Method #1: Direct use of purified genomic DNA.

1. Add 1~2ug of purified genomic DNA into the 2-5ml microfuge tubes (the # of tubes will depend on how many sonication conditions you want to test). Bring up the volume in each tube to 200ul with ddH2O, Keep samples on ice.

2. Perform sonication (Fisher’s F60 model) by changing either the power settings (e.g., full scale = 20; 80% = 16; and 70% = 14) and/or the number of 10 to 15-second pulses (usually between 3 to 5 times). Please keep samples on ice all time; wait for 1-2 min. between pulses to avoid rapid heating up of the samples.

3. Transfer the sonicated DNA samples to a fresh set of 1.7ml tubes. Perform ethanol precipitation using our regular lab protocol.

4. Resuspend the DNA samples in 10-20ul of ddH2O. Load onto the1.2% ~ 1.5% agarose minigel and run it for 40-60min at 60-70 volts. Ideally, the center of the DNA smear should migrate along the 500bp-position.

Method #2: Use of the cross-linked cells.

Note: Whenever possible, place samples on ice.

1. Plate C3H10 cells in one T-75 flask (in 20ml complete medium) at 70% confluency at 37C 5% CO2 incubator. It should reach 80-90% confluency overnight, yielding ~1 x 107 cells.

2. Crosslink proteins to DNA by adding 540ul of 37% Formaldehyde directly to the 20ml cells culture medium (at a final concentration of 1% Formaldehyde). Incubate the flask room temperature for 5-10 minutes.

3. Add 1.0ml of 2.5M Glycine (final concentration 125 mM) to the medium for 10min, at room temperature to quench the formaldehyde.

4. Aspirate medium, removing as much medium as possible. Wash cells using 5 ml of ice cold PBS containing protease inhibitors (i.e., we are using Roche’s Complete PI cocktail tablets). Note: Add protease inhibitors to PBS just prior to use.

5. Add 2ml cold PBS, and scrape cells into a 50-ml conical tube.

6. Pellet cells for 3000 rpm, 5 minutes at 4ºC. Remove PBS and add 2.0 ml ChIP Lysis Buffer containing protease inhibitors to lyse cells for 30 min on ice.

7. Prepare multiple 200µl aliquots for sonication. Note: The 200 ul of ChIP Lysis Buffer is per 2 X 106

cells; if more cells are used, the resuspended cell pellet should be divided into 200µl aliquots so that each 200µl aliquot contains ~1 X 106 cells.

8. Sonicate lysate to shear DNA to lengths between 200 and 1000bp being sure to keep samples ice cold (e.g., 80% power ×12sec×4times, between pulses incubate on ice for 1-2min).

9. Recover DNA by phenol/chloroform extraction, ethanol precipitation, wash ×2. Run samples (e.g., 20ul per sample) in 1.5% agarose gel to visualize shearing efficiency.

Note: Numerous controls can be set up. Most common ones are treated (e.g., AdWnt3A) vs. untreated (e.g., AdGFP), and/or gene-specific antibody (e.g., anti-β-catenin) vs. non-specific antiserum (e.g., a control IgG). Additionally, PCR reactions can be carried out to detect control genomic loci (e.g., GAPDH promoter region).

Prior to starting this section:

• Obtain ice for incubation of PBS (see Step 3) and for incubating culture dish (see Step 6). Prepare 1X PBS and put on ice. This will be used for washes and needs to be ice cold. Warm SDS Lysis Buffer to room temperature to ensure SDS is in solution before proceeding with cell lysis.

1.

2. Plate C3H10 T1/2 cells in T-75 flasks at 70-80% confluency. Infect cells with an optimal titer of AdWnt3A or AdGFP in T-75 flasks containing 20ml of

growth media. For C3H10T1/2 cells, there are approximately 1 x 107 cells per T-75

flask. This will generate a preparation of chromatin that can be used for up to 5 separate immunoprecipitations per flask.

At 36 to 45hrs after infection, add 540µl of 37% Formaldehyde to 20ml of growth media (Final concentration is ~1%) to crosslink and gently swirl the flask to mix.

Incubate at room temperature for 10 minutes. 3. 4.

5. Meanwhile, remove 10ml of ice cold 1X PBS to a separate tube for every T-75 flask and

add one tablet of the Complete PI tablet. Put on ice.

6. Add 1.0ml of 2.5M Glycine (final concentration 125 mM) to each T-75 flask to quench

excessive Formaldehyde.

7.

8. Swirl to mix and incubate at room temperature for 5 minutes. Aspirate medium as completely as possible, being careful not to disturb the cells.

9. Add 10ml of cold 1X PBS to wash cells.

10. Remove PBS. Add 1.0ml cold PBS containing Protease Inhibitor Cocktail. Scrape cells from each flask into a microfuge tube. Spin at 700xg at 4°C for

11. During spin, prepare ~10ml of ChIP Lysis Buffer containing Complete PI Inhibitors

Cocktail .

12. Resuspend cell pellet in 1.0ml of ChIP Lysis Buffer with PI cocktail. Cell Density is

important for reliable cell lysis. Adjust accordingly if different cell concentrations are desired as the ratio of lysis buffer to cell (for every 1x107 C3H10T1/2 cells,1.0ml of Lysis Buffer is recommended for this protocol).

13. Aliquot between 200µl per microfuge tube. Lysate can be frozen at -80°C at this step.

14. If optimal conditions for sonication have already been determined, proceed to Section B. Prior to starting this section:

Optimal conditions required for shearing cross-linked DNA to 200-1000bps in length need to be determined as described in Part I.

1.

2.

3. If desired, remove 5µl of cell lysate from Section A, Step 13 for agarose gel analysis of unsheared DNA. If lysate from Section A, Step 13 was previously frozen, thaw on ice. Sonicate cell lysate on ice using the conditions optimized in Part 1, Method #2. Sheared cross-linked chromatin can be stored at -80°C for up to a few months. Spin at 12,000-15,000 x g at 4°C for 10 minutes to remove insoluble material, transfer

supernatant into new sterile microtubes in 100µl aliquots. Each 100µl aliquot contains 2 x 106 cell equivalents of lysate which is enough for one immunoprecipitation.

1. Prepare enough ChIP Lysis Buffer containing protease inhibitors for the number of

desired immunoprecipitations and store on ice.

• Each IP requires the addition of 900µl of ChIP Lysis Buffer with PIs.

• Samples include Wnt3A vs. GFP-treated; anti-β-catenin vs. mouse IgG control. In some cases, no antibody/IgG controls can also be set up.

2. Prepare one microfuge tube containing 100µl of sheared crosslinked chromatin (Section

B, step 3) for the number of desired immunoprecipitations and put on ice. If lysate has been previously frozen, thaw on ice.

• Alternatively, if multiple immunoprecipitations will be performed from the same lysate preparation, place the entire volume for the number of desired immunoprecipitations in one large tube that will be able to accommodate a volume of 1.1ml for each IP.

• Each 100µl will contain ~2 x 106 cell equivalents of chromatin.

3. Add 400µl of ChIP Lysis Buffer into each tube containing 100µl of cell lysate/chromatin.

4. Add 60µl of pre-washed Protein G Agarose for each IP.

• The Protein G Agarose is 50% slurry, which should be washed in ChIP Lysis Buffer containing PI cocktails twice. Gently mix by inversion before removing.

• This step serves to “preclear” the chromatin, i.e., to remove proteins or DNA that may bind nonspecifically to the Protein G agarose.

5.

6. Incubate for 1 hour at 4°C with rotation. Pellet agarose by brief centrifugation (3000-5000 x g for 1 minute).

• Do not spin Protein G Agarose beads at high speeds. Applying excessive g-force may crush or deform the beads and cause them to pellet inconsistently.

7. Remove 10µl (1%) of the supernatant as Input and save at 4°C until Section D, step 1.

• If different chromatin preparations are being carried together through this protocol, remove 1% of the chromatin as Input from each.

8. Collect the supernatant by aliquoting 400-500 µl into fresh microfuge tubes.

9. Add the immunoprecipitating antibody to the supernatant fraction:

• For anti-β-catenin, add 1.0-10µg of antibody per tube.

• For the negative control, Normal Mouse IgG, add 1.0µg of antibody per tube.

10. Incubate at 4°C for 2~4 hours with rotation.

• It may be possible to reduce the incubation time of the IP. This depends on many factors (antibody, gene target, cell type, etc.) and will have to be tested empirically.

11. Add 100µl of Protein G Agarose (pre-washed with ChIP Lysis Buffer) for 1 hour at

4°C with rotation.

• This serves to collect the antibody/antigen/DNA complex.

12. Pellet Protein G Agarose by brief centrifugation (3000-5000 x g for 1 minute) and

remove the supernatant fraction.

13. Wash the Protein G Agarose-antibody/chromatin complex by resuspending the beads in

1.0ml each of the cold buffers containing PI cocktail in the order listed below and

incubating for 3-5 minutes on a rotating platform followed by brief centrifugation (3000-5000 x g for 1 minute) and careful removal of the supernatant fraction:

a) ChIP Lysis Buffer wash 5min × 2 times, at RT

b) High Salt ChIP Lysis Buffer (w/0.5M NaCl) wash 5min × 2 times, at RT

c) ChIP Lysis Buffer wash 5min × 1 times, at RT

d) hiTE buffer wash 5min × 1 times, at RT

Prior to starting this section:

• Bring ChIP Elution Buffer to room temperature. A precipitate may be observed but will go into solution once room temperature is achieved.

• Set water bath to 65°C for use in Section E.

1. Make ChIP Elution Buffer for all IP tubes and all Input tubes (see Section C, step 7).

2. For Input tubes (see Section C, step 7), add 200µl of Elution Buffer and set aside at

room temperature until Section E.

3. Add 100µl of Elution Buffer to each tube containing the antibody/agarose complex. Mix

by flicking tube gently.

4. Incubate at room temperature for 15 minutes.

5.

6.

Pellet agarose by brief centrifugation (3000-5000 x g for 1 minute) and collect supernatant into new microfuge tubes. Repeat steps 4-6 and combine eluates (total volume = 200µl).

1. To all tubes (IPs and Inputs) add 8µl of 5M NaCl and incubate at 65°C for 4-5 hours (or

overnight) to reverse the DNA – Protein crosslinks (Note: This step can also be

carried out in PCR heating blocks). After this step the sample can be stored at -20°C and the protocol continued the next day.

2. Optional: to all tubes, add 1µl of RNase A and incubate for 30 minutes at 37°C.

3. Optional: add 4µl 0.5M EDTA, 8µl 1M Tris-HCl and 1µl Proteinase K and incubate at

45°C for 1-2 hours.

1. To each uncrosslinked sample (~200µl), add 100µl of 7.5M (NH4)2OAc and 250µl of

PC-8. Perform PC-8 extraction as our regular lab protocol. Repeat PC-8 extraction(s) if necessary.

To each sample, add 5µl seeDNA co-precipitate to each sample and mix well. Add 700µl cold 100% ethanol. Spin samples (in 1.7ml Eppendorf tubes) at top speed for 5 min. Wash pellets with 70% ethanol twice. Air-dry the pellets.

Dissolve samples in 100µl ddH2O. Samples are ready for being used for real-time PCR /regular PCR analysis or Kept at -20C or -80C. 2. 3.

4. Perform real-time PCR /regular PCR use our regular lab protocols.