染色质免疫沉淀

染色质免疫沉淀(ChiP)分析

染色质免疫沉淀分析

(Chromatin Immunoprecipitation Assay, ChiP)

真核生物细胞状态是由内源和外源因素共同影响的,所有信号传递途径的终点都是DNA。DNA通过核蛋白复合物组成染色质,染色质基因调控的一个重要作用位点。转录激活因子和辅助抑制因子的研究显示存在一种新的调节机制 “组蛋白密码”,其信息存在于组蛋白的转录后修饰等过程中。该类修饰包括组蛋白磷酸化、乙酰化、甲基化、ADP-核糖基化等过程。随着越来越多组蛋白核心结构区域和羧端修饰的确定,组蛋白密码在控制和调节基因功能过程中的作用越来越明确。

参与修饰的酶根据其作用的不同而分类:如组氨酸乙酰转移酶(HATs)可以将乙酰基团转到组蛋白上;组蛋白去乙酰酶(HDACs)可以去除氨基酸上的乙酰基团;组蛋白甲基转移酶(HMTs)可以将甲基基团转移到组蛋白上等。不同组氨酸修饰标记对应于不同的生物学过程,它可以作为调节因子的作用位点,也可以用来改变染色质结构。

凝胶电泳迁移率改变分析(EMSA)是目前研究转录调控蛋白和相应核苷酸序列结合的常用方法,但是由于许多转录调控蛋白有相似或相同的DNA结合位点,这种体外分析获取的结果不一定能真实地反映体内转录调控蛋白和DNA结合状况。

染色质免疫沉淀分析(ChiP)是基于体内分析发展起来的方法,它能真实、完整地反映结合在DNA序列上的调控蛋白。它是目前确定与特定蛋白结合的基因组区域或确定与特定基因组区域结合的蛋白质的最好方法。

ChiP技术和芯片技术的结合有利于确定全基因组范围内染色体蛋白的分布模式以及组蛋白修饰情况。

图:ChiP技术的示意图:

甲醛处理使蛋白质与DNA交联;

超声波将染色质打断成一定大小;

通过抗体沉淀蛋白质-DNA交联复合体;

解除交联,纯化DNA;

实时定量PCR检测DNA的量

应用:

组蛋白修饰酶的抗体作为“生物标记”

转录调控分析

药物开发研究

有丝分裂研究

DNA损失与凋亡分析

试剂盒组分

 ssDNA/Protein A Agarose  ssDNA/Protein A agarose  ssDNA/Protein G Agarose  ChIP Dilution Buffer  Low salt wash buffer  High salt wash buffer  LiCl Wash Buffer  TE Buffer

 0.5M EDTA

 5M NaCL

 1M Tris-HCl, pH 6.5  SDS Lysis Buffer

ChIP染色质免疫沉淀技术

染色质免疫沉淀技术(Chromatin Immunoprecipitation,简称ChIP)是研究体内蛋白质与DNA相互作用的一种技术。它利用抗原抗体反应的特异性,可以真实地反映体内蛋白因子与基因组DNA结合的状况。特别是近年来由于该技术不断的发展和完善,其应用范围已经从研究目的蛋白与已知靶序列间的相互作用,发展到研究目的蛋白与整个基因组的未知序列的相互作用;从研究一个目的蛋白与DNA的相互作用,发展到研究两个蛋白与DNA共同结合的相互作用;从研究启动子区域的组蛋白的修饰,发展到研究结合在DNA序列上的蛋白复合物。随着对基因功能研究的不断深入,这项技术正越来越多的被应用于科研的各个领域。

chip技术的原理

染色质免疫沉淀技术的原理是:在生理状态下把细胞内的DNA与蛋白质交联在一起,通过超声或酶处理将染色质切为小片段后,利用抗原抗体的特异性识别反应,将与目的蛋白相结合的DNA片段沉淀下来。染色质免疫沉淀技术一般包括细胞固定,染色质断裂,染色质免疫沉淀,交联反应的逆转,DNA的纯化,以及DNA的鉴定。因为ChIP实验涉及的步骤多,结果的重复性较低,所以对ChIP实验过程的每一步都应设计相应的对照,而且对结果的分析也需要有一定的经验。对于刚刚开始使用ChIP技术的研究人员来说,使用成熟的商品化试剂盒和相关的技术服务会达到事半功倍的效果,比如millipore公司的EZ-ChIP试剂盒就是专门为初学者设计的入门产品。下面我们就最基本的实验步骤,实验中的小技巧以及需要注意的问题简单介绍一下。

1. 细胞固定

甲醛能有效的使蛋白质-蛋白质,蛋白质-DNA,蛋白质-RNA交联,形成生物复合体,防止细胞内组分的重新分布。甲醛的交联反应是完全可逆的,便于在后续步骤中对DNA和蛋白质进行分析。交联所用的甲醛终浓度为1%,交联时间通常为5分钟到1个小时,具体时间根据实验而定。值得注意的是,交联时间如果过长,细胞染色质难以用超声波破碎,影响ChIP结果,而且实验材料也容易在离心过程中丢失。交联时间如果过短,则交联不完全,产生假阴性。甲醛的交联反应可被加入的甘氨酸终止。

2. 染色质断裂

交联后的染色质可被超声波或Micrococcal Nuclease切成400~600 bp的片段(用琼脂糖凝胶电泳检测),以便暴露目标蛋白,利于抗体识别。超声波是使用机械力断裂染色质,容易引起升温或产生泡沫,这都会引起蛋白质变性,进而影响ChIP的效率。所以在超声波断裂染色质时,要在冰上进行,且要设计时断时续的超声程序,保证低温。另外,超声探头要尽量深入管中,但不接触管底或侧壁,以免产生泡沫。总超声时间也不要太长,以免蛋白降解。Micrococcal Nuclease可以将染色质切成一到几个核小体,比超声波处理的结果更精致,更均一(图1)。另外,酶反应的条件比较温和,对DNA和DNA-蛋白复合物的损伤较小,而且蛋白不易变性。酶处理染色质适用于新鲜的细胞或组织样品和冰冻样品。在研究组蛋白时,经常采用的研究方法。因为N-ChIP没经过甲醛固定,超声波处理会打断组蛋白和DNA的结合,所以只能选择酶处理染色质的方法。对于甲醛固定的样品,一般选择超声波处理方法。也有研究人员使用酶处理的方法研究甲醛固定较温和的样品。Millipore公司有商品化的Micrococcal Nuclease处理的ChIP试剂盒(EZ-Enzyme)提供。

染色质免疫沉淀中的对照与抗体选择

Input对照:

在进行免疫沉淀前,需要取一部分断裂后的染色质做Input对照。Input是断裂后的基因组DNA,需要与沉淀后的样品DNA一起经过逆转交联,DNA纯化,以及最后的PCR或其他方法检测。Input对照不仅可以验证染色质断裂的效果,还可以根据Input中的靶序列的含量以及染色质沉淀中的靶序列的含量,按照取样比例换算出ChIP的效率,所以Input对照是ChIP实验必不可少的步骤。

Beads选择:

接下来,利用目的蛋白质的特异抗体通过抗原-抗体反应形成DNA-蛋白质-抗体复合物,然后使用Agarose beads或Magna beads沉淀此复合物,特异性地富集与目的蛋白结合的DNA片段。再经过多次洗涤,除去非特异结合的染色质后,用SDS+NaHCO3洗脱免疫沉淀复合物。Magna beads是近年来出现的一种新型beads,它使用方便,不像Agarose beads那样容易破裂,所以在操作过程中更简单,而且免去了离心的步骤,节省不少时间。

抗体选择:

染色质免疫沉淀所选择的目的蛋白的抗体是ChIP实验成功的关键。因为在蛋白质与染色质交联结合时,抗体的抗原表位可能因为与结合位点的距离太近,不能被抗体识别,所以不能有效地在体内形成免疫沉淀复合物,直接影响ChIP的结果。所以不是所有的抗体都能做ChIP实验的,只有经过ChIP实验验证后的抗体才能确保实验结果的可靠性。

阳性与阴性对照:

在做ChIP实验时,一定要做好实验对照,因为没有对照,很难对实验结果的可靠性进行评估。阳性抗体和阴性抗体对照是最基本的实验对照。阳性抗体通常选择与已知序列相结合的比较保守的蛋白的抗体,常用的包括组蛋白抗体或RNA Polymerase II抗体等。阴性抗体通常选择目的蛋白抗体宿主的IgG或血清。目的蛋白抗体的结果与阳性抗体和阴性抗体的结果相比较,才能得出正确结论。另外,还应考虑目的蛋白抗体与DNA的非特异性结合的可能,所以通常还会选择一对阴性引物,即目的蛋白肯定不会结合的DNA序列,作为该抗体的阴性对照。最佳的阴性对照引物是在靶序列上游的一段与目的蛋白肯定不能结合的序列。如果目的蛋白没有商品化的适用于染色质免疫沉淀实验的抗体,只有其他用途的抗体时,可以先做蛋白质免疫沉淀(Immunoprecipitation)检测。如果抗体可以成功的沉淀蛋白,再进行染色质免疫沉淀实验的检测。

交联反应的逆转和DNA的纯化

用不含DNase的RNase和Proteinase K,65oC保温6小时逆转交联,经DNA纯化柱回收DNA或用酚氯仿抽提、乙醇沉淀纯化DNA。DNA纯化柱纯化DNA的质量高,有利于下一步PCR等方法的检测。因为甲醛不仅交联DNA-蛋白质,还交联蛋白质-蛋白质,所以还可以对DNA序列上的蛋白质复合物进行分析。在逆转交联时不使用Proteinase K,然后用丙酮回收有机相中的蛋白质,进行分析。

DNA的鉴定

最常用的DNA的鉴定方法是半定量PCR和Real-time PCR。由于启动子区域的序列具有多样性的特点,所以不同的细胞系或不同的动物品系的同一基因的启动子序列有可能不

同。而且启动子区域多富含CG的序列,其PCR条件可能需要相应调整。有条件可设计不止一对引物来反复验证ChIP实验的结果(图2)。

ChIP技术的应用

染色质免疫沉淀的DNA适用于多种分析方法。如果目的蛋白的靶序列是已知的或需要验证的,可采用狭缝杂交(Slot blot)的方法,把靶序列特异性探针与染色质免疫沉淀的DNA杂交,来验证目的蛋白与DNA靶序列的特异性结合。还可以根据靶序列设计引物,用半定量PCR的方法进行测定,或采用Real-time PCR方法进行定量分析。如果目的蛋白的靶序列是未知的或高通量的(high-throughput),可采用Southern杂交。但因为免疫沉淀的DNA量较少,所以在研究时通常要用PCR方法扩增DNA探针,再进行整个基因组扫描。还可以把沉淀的DNA克隆到载体中,进行测序,寻找该序列附近的开放阅读框,发现新的基因调节序列。

目前,随着人类基因组测序工作的基本完成,研究目的蛋白和整个基因组的相互作用逐渐成为研究的热点。由于基因组中的信息量非常大,上述常规方法通常无法满足科研的需要。近年来发展起来的ChIP-chip技术将基因组DNA芯片(chip)技术与染色质免疫沉淀技术(ChIP)相结合,为研究目的蛋白与整个基因组相互作用提供了可能。ChIP-chip 技术通过标记染色质免疫沉淀富集的DNA片段,和另一个被标记不同探针的对照组样品一起,与DNA芯片杂交,再利用各种生物信息学方法对收集到的信号进行分析,具体的实验步骤请参考Dr. Richard Young在Nature Protocols上的文章。ChIP-chip技术已经被广泛应用于研究转录因子在整个基因组中的信号网络染色质修饰机制在基因组中的调控,DNA的复制,修复以及修饰,基因的转录与核运输等诸多方面。

染色质免疫沉淀技术还可用于分析两种蛋白共同结合的DNA序列,即ChIP reChIP方法。ChIP reChIP是在第一次ChIP的基础上不解交联,而继续进行另一个目的蛋白的免疫沉淀,从而得到与两种目的蛋白都结合的DNA序列。值得注意的是,因为通过两次免疫沉淀富集的DNA量比较少,所以在分析时通常要把多次免疫沉淀的DNA浓缩后再进行操作。

近年来ChIP技术也被用于研究RNA-蛋白的相互作用,其原理与DNA类似,也包括甲醛固定,超声波破细胞,免疫沉淀,交联逆转,RNA纯化和RNA

鉴定等步骤。所不同的

是,交联逆转只用Proteinase K,要进行RNA纯化和不含RNase的DNase处理,分析时用RT-PCR,芯片杂交要用cDNA芯片等。

染色质免疫沉淀ChIP

染色质免疫沉淀(ChIP)实验指南及技术总结

ChIP是一项比较流行的研究转录因子(transcriptionfactor,TF)与启动子(promoter)相互结合的实验技术。由于ChIP采用甲醛固定活细胞或者组织的方法,所以能比较真实的反映细胞内TF与Promoter的结合情况。当用甲醛处理时,相互靠近的蛋白与蛋白,蛋白与核酸(DNA或RNA)之间会产生共价键。细胞内,当TF与Promoter相互结合(生物意义上的结合)时,它们必然靠的比较近,或者契合在一起,这个时候用甲醛处理,能使它们之间产生共价键。

染色质免疫沉淀分析(ChiP)是基于体内分析发展起来的方法,它的基本原理是在活细胞状态下固定蛋白质-DNA复合物,并通过超声或酶处理将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段,然后通过抗原抗体的特异性识别反应沉淀此复合体,特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段,通过对目的片断的纯化与检测,从而获得蛋白质与DNA相互作用的信息。它能真实、完整地反映结合在DNA序列上的调控蛋白,是目前确定与特定蛋白结合的基因组区域或确定与特定基因组区域结合的蛋白质的一种很好的方法。CHIP不仅可以检测体内反式因子与DNA的动态作用,还可以用来研究组蛋白的各种共价修饰与基因表达的关系。而且,CHIP与其他方法的结合,扩大了其应用范围:CHIP与基因芯片相结合建立的CHIP-on-chip方法已广泛用于特定反式因子靶基因的高通量筛选;CHIP与体内足迹法相结合,用于寻找反式因子的体内结合位点;RNA-CHIP用于研究RNA在基因表达调控中的作用。

一般ChIP的流程是:甲醛处理细胞---收集细胞,超声破碎---加入目的蛋白的抗体,与靶蛋白-DNA复合物相互结合---加入ProteinA,结合抗体-靶蛋白-DNA复合物,并沉淀---对沉淀下来的复合物进行清洗,除去一些非特异性结合---洗脱,得到富集的靶蛋白-DNA复合物---解交联,纯化富集的DNA-片断---PCR分析。

在PCR分析这一块,比较传统的做法是半定量-PCR。但是现在随着荧光定量PCR的普及,大家也越来越倾向于Q-PCR了。此外还有一些由ChIP衍生出来的方法。例如RIP(其实就是用ChIP的方法研究细胞内蛋白与RNA的相互结合,具体方法和ChIP差不多,只是实验过程中要注意防止RNase,最后分析的时候需要先将RNA逆转录成为cDNA);还有ChIP-chip(其实就是ChIP富集得到的DNA-片段,拿去做芯片分析,做法在ChIP的基础上有所改变,不同的公司有不同的做法,要根据公司的要求来准备样品)。

第一天:

(一)、细胞的甲醛交联与超声破碎。

1、取出1平皿细胞(10cm平皿),加入243 ul 37%甲醛,使得甲醛的终浓度为1%(培养基共有9ml)。

2、37摄氏度孵育10min。

3、终止交联:加甘氨酸至终浓度为0.125M。450 ul 2.5M甘氨酸于平皿中。混匀后,在室温下放置5min即可。

4、吸尽培养基,用冰冷的PBS清洗细胞2次。

5、细胞刮刀收集细胞于15ml离心管中(PBS依次为5ml,3ml和3ml)。预冷后2000rpm

5min收集细胞。

6、倒去上清。按照细胞量,加入SDS Lysis Buffer。使得细胞终浓度为每200ul含2×106个细胞。这样每100ul溶液含1×106个细胞。再加入蛋白酶抑制剂复合物。假设MCF7长满板为5×106个细胞。本次细胞长得约为80%。即为4×106个细胞。因此每管加入400ul SDS Lysis Buffer。将2管混在一起,共800ul。

7、超声破碎:VCX750,25%功率,4.5S冲击,9S间隙。共14次。

(二)、除杂及抗体哺育。

8、超声破碎结束后,10,000g 4oC离心10min。去除不溶物质。

留取300ul做实验,其余保存于-80oC。

300ul中,100ul加抗体做为实验组;100ul不加抗体做为对照组;100ul加入4ul5MNaCl(NaCl终浓度为0.2M),65oC处理3h解交联,跑电泳,检测超声破碎的效果。

9、在100ul的超声破碎产物中,加入900ulChIPDilutionBuffer和20ul的50×PIC。 再各加入60ulProteinAAgarose/SalmonSpermDNA。4oC颠转混匀1h。

10、1h后,在4oC静置10min沉淀,700rpm离心1min。

11、取上清。各留取20ul做为input。一管中加入1ul抗体,另一管中则不加抗体。4oC颠转过夜。

(三)、检验超声破碎的效果。

取100ul超声破碎后产物,加入4ul5MNaCl,65oC处理2h解交联。分出一半用酚/氯仿抽提。电泳检测超声效果。

第二天:

(一)、免疫复合物的沉淀及清洗。

12、孵育过夜后,每管中加入60ulProteinAAgarose/SalmonSpermDNA。4oC颠转2h。 13、4oC静置10min后,700rpm离心1min。除去上清。

14、依次用下列溶液清洗沉淀复合物。清洗的步骤:加入溶液,在4oC颠转10min,4oC静置10min沉淀,700rpm离心1min,除去上清。

洗涤溶液:a.low salt wash buffer-one wash

b.highsalt wash buffer-one wash

c.LiCl wash buffer-one wash

d.TE buffer-two wash

15、清洗完毕后,开始洗脱。洗脱液的配方:100ul10%SDS,100ul1MNaHCO3,800ulddH2O,共1ml。

每管加入250ul洗脱buffer,室温下颠转15min,静置离心后,收集上清。重复洗涤一次。最终的洗脱液为每管500ul。

16、解交联:每管中加入20ul 5M NaCl(NaCl终浓度为0.2M)。

混匀,65oC解交联过夜。

第三天:

(一)、DNA样品的回收

17、解交联结束后,每管加入1ulRNaseA(MBI),37oC孵育1h。

18、每管加入10ul0.5MEDTA,20ul1MTris.HCl(PH6.5),2ul10mg/ml蛋白酶K。 45oC处理2h。

19、DNA片段的回收----omega胶回收试剂盒。最终的样品溶于100ulddH2O。

(二)、PCR分析

染色质免疫共沉淀实验

一、 染色质免疫共沉淀简介

真核生物的基因组DNA以染色质的形式存在。因此,研究蛋白质与DNA在染色质环境下的相互作用是阐明真核生物基因表达机制的基本途径。染色质免疫沉淀技术

(chromatin immunoprecipitation assay, CHIP)是目前唯一研究体内DNA与蛋白质相互作用的方法。它的基本原理是在活细胞状态下固定蛋白质-DNA复合物,并将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段,然后通过免疫学方法沉淀此复合体,特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段,通过对目的片断的纯化与检测,从而获得蛋白质与DNA相互作用的信息。CHIP不仅可以检测体内反式因子与DNA的动态作用,还可以用来研究组蛋白的各种共价修饰与基因表达的关系。而且,CHIP与其他方法的结合,扩大了其应用范围:CHIP与基因芯片相结合建立的CHIP-on-chip方法已广泛用于特定反式因子靶基因的高通量筛选;CHIP与体内足迹法相结合,用于寻找反式因子的体内结合位点;RNA-CHIP用于研究RNA在基因表达调控中的作用。由此可见,随着CHIP的进一步完善,它必将会在基因表达调控研究中发挥越来越重要的作用。

染色质免疫共沉淀可以:(1)组蛋白修饰酶的抗体作为“生物标记”;(2)转录调控分析;(3)药物开发研究;(4)DNA损失与凋亡分析。 二、ChIP的一般流程

甲醛处理细胞---收集细胞,超声破碎---加入目的蛋白的抗体,与靶蛋白-DNA复合物相互结合---加入ProteinA,结合抗体-靶蛋白-DNA复合物,并沉淀---对沉淀下来的复合物进行清洗,除去一些非特异性结合---洗脱,得到富集的靶蛋白-DNA复合物---解交联,纯化富集的DNA-片断---PCR分析。

三、PCR分析

ChIP-chip技术对于大规模挖掘顺式调控信息成绩卓著,同时它可以用于胚胎干细胞和一些疾病如癌症、心血管疾病和中央神经紊乱的发生的机制。研究人员还可以利用这项技术开发一些治疗方法。目前ChIP-chip技术研究主要集中于两个领域:及转录因子的结合和条件特异性;组蛋白的修饰,组蛋白修饰蛋白和染色体重建。

ChIP-chip在描述转录结合因子动力学中的研究、染色体结构组分的分布、在组蛋白的修饰、组蛋白修饰蛋白和染色体重建中的应用也十分广泛。ChIP-chip 技术的优点是,可以在体内进行反应;在给定的检验细胞环境的模式下得到DNA相互关系的简单影像;使用

特异性修正抗体鉴定与包含有一个特异性后转录修正的蛋白质的相关位点;直接或者间接(通过蛋白质与蛋白质的相互作用)的鉴别基因组与蛋白质的相关位点。缺点是:需要一个特异性蛋白质抗体,有时难于获得;为了获得高丰度的结合片段,必须实验演示胞内条件下靶标蛋白质的表达情况;调控蛋白质的基因的获取可能需要限制在组织来源中。

总之,ChIP-chip 技术的发展为析活细胞或组织中DNA与蛋白质的相互关系提供了一个极为有力的工具。在未来的研究中,将对芯片的构建进行改进,提高其实用性。使用易于获得抗体,增加这种方法的可用性。

在PCR分析这一块,比较传统的做法是半定量-PCR。但是现在随着荧光定量PCR的普及,大家也越来越倾向于Q-PCR了。此外还有一些由ChIP衍生出来的方法。例如RIP(其实就是用ChIP的方法研究细胞内蛋白与RNA的相互结合,具体方法和ChIP差不多,只是实验过程中要注意防止RNase,最后分析的时候需要先将RNA逆转录成为cDNA);还有ChIP-chip(其实就是ChIP富集得到的DNA-片段,拿去做芯片分析,做法在ChIP的基础上有所改变,不同的公司有不同的做法,要根据公司的要求来准备样品)。

实验方法

原理 在保持组蛋白和DNA联合的同时,通过运用对应于一个特定组蛋白标记的生物抗体,染色质被切成很小的片断,并沉淀下来。

IP是利用抗原蛋白质和抗体的特异性结合以及细菌蛋白质的“prorein A”特异性地结合到免疫球蛋白的FC片段的现象活用开发出来的方法。

目前多用精制的prorein A预先结合固化在argarose的beads上,使之与含有抗原的溶液及抗体反应后,beads上的prorein A就能吸附抗原达到精制的目的。

实验材料 细胞样品

试剂、试

剂盒 甲醛甘氨酸PBSSDS Lysis Buffer洗脱液RNaseA蛋白酶Komega胶回收试剂盒

仪器、耗

材 离心管超声仪电泳仪离心机

实验步骤 一、细胞的甲醛交联与超声破碎( 第一天)

1. 取出1平皿细胞(10 cm平皿),加入243 ul 37%甲醛,使得甲醛的终浓度为1%(培养基共有9 ml)。

5. 细胞刮刀收集细胞于15 ml离心管中(PBS依次为5 ml,3 ml和3 ml)。预冷后2 000 rpm 5 min收集细胞。

6. 倒去上清。按照细胞量,加入SDS Lysis Buffer。使得细胞终浓度为每200ul含2×106个细胞。这样每100 ul溶液含1×106个细胞。再加入蛋白酶抑制剂复合物。假设MCF7长满板为5×106个细胞。本次细胞长得约为80%。即为4×106个细胞。因此每管加入400 ul SDS Lysis Buffer。将2管混在一起,共800 ul。

7. 超声破碎:VCX750,25%功率,4.5 s冲击,9 s间隙。共14次。

二、除杂及抗体哺育 ( 第一天)

1. 超声破碎结束后,10 000 g 4℃离心10 min。去除不溶物质。

2. 留取300ul做实验,其余保存于-80℃。

3. 300 ul中,100 ul加抗体做为实验组;100 ul不加抗体做为对照组;100 ul加入4 ul 5 M NaCl(NaCl终浓度为0.2 M),65℃处理3 h解交联,跑电泳,检测超声破碎的效果。

4. 在100 ul的超声破碎产物中,加入900 ul ChIP DilutionBuffer和20 ul的50×PIC。

再各加入60 ul ProteinA Agarose/SalmonSpermDNA。4℃颠转混匀1 h。

5. 1 h后,在4℃静置10 min沉淀,700 rpm离心1 min。

6. 取上清。各留取20 ul做为input。一管中加入1 ul抗体,另一管中则不加抗体。4℃颠转过夜。

三、检验超声破碎的效果 ( 第一天)

1. 取100 ul超声破碎后产物,加入4 ul 5M NaCl,65℃处理2 h解交联。

2. 分出一半用酚/氯仿抽提。电泳检测超声效果。

四、免疫复合物的沉淀及清洗( 第二天)

1. 孵育过夜后,每管中加入60 ul ProteinA Agarose/SalmonSperm DNA。4℃颠转2 h。

2. 4℃静置10 min后,700 rpm离心1 min。除去上清。

3. 依次用下列溶液清洗沉淀复合物。清洗的步骤:加入溶液,在4℃颠转10 min,4℃静置10 min沉淀,700 rpm离心1 min,除去上清。

洗涤溶液:

(1)low salt wash buffer-one wash

(2)highsalt wash buffer-one wash

(3)LiCl wash buffer-one wash

(4)TE buffer-two wash

4. 清洗完毕后,开始洗脱。

洗脱液的配方:100 ul 10%SDS,100 ul1M NaHCO3,800 ul ddH2O,共1 ml。

每管加入250 ul洗脱buffer,室温下颠转15 min,静置离心后,收集上清。重复洗涤一次。最终的洗脱液为每管500 ul。

5. 解交联:每管中加入20 ul 5M NaCl(NaCl终浓度为0.2 M)。

6. 混匀,65℃解交联过夜。

五、DNA样品的回收(第三天)

1. 解交联结束后,每管加入1 ul RNaseA(MBI),37℃孵育1 h。

2. 每管加入10 ul 0.5 M EDTA,20 ul1M Tris.HCl(PH6.5),2 ul 10 mg/ml蛋白酶K。45℃处理2 h。

3. DNA片段的回收----omega胶回收试剂盒。最终的样品溶于100 ul ddH2O。

六、PCR分析(第三天)

注意事项 1. 注意抗体的性质。抗体不同和抗原结合能力也不同,免染能结合未必能用在IP反

应。建议仔细检查抗体的说明书。特别是多抗的特异性是问题。

2. 注意溶解抗原的缓冲液的性质。多数的抗原是细胞构成的蛋白,特别是骨架蛋白,缓冲液必须要使其溶解。为此,必须使用含有强界面活性剂的缓冲液,尽管它有可能影响一部分抗原抗体的结合。另一面,如用弱界面活性剂溶解细胞,就不能充分溶解细胞蛋白。即便溶解也产生与其它的蛋白结合的结果,抗原决定族被封闭,影响与抗体的结合,即使IP成功,也是很多蛋白与抗体共沉的悲惨结果。

3. 为防止蛋白的分解,修饰,溶解抗原的缓冲液必须加蛋白每抑制剂,低温下进行实验。每次实验之前,首先考虑抗体/缓冲液的比例。抗体过少就不能检出抗原,过多则就不能沉降在beads上,残存在上清。缓冲剂太少则不能溶解抗原,过多则抗原被稀释。

CHIP(染色质免疫共沉淀)

一、超声剪切染色质

1.用37℃预温的1%PFA固定10-20min,使DNA与蛋白质交联

2.终止交联,加入终浓度为0.125M的甘氨酸

3.用预冷的PBS洗2次

4.用PBS将细胞刮下(5mlPBS+1mMPMSF+1mg/ml抑肽酶)

5.4500rpm5min(此阶段细胞沉淀可储存于-80℃)

6.弃上清,按200ul/106个细胞加入SDS lysis buffer(现加PMSF&coktail),冰上10min(4℃rotation 30min)

7.27G针头注射器吹打3遍,若有气泡离心

8.超声:不可有气泡,超两次后放到冰上

9.离心:4℃,12000rpm,20min,上清转移到15ml离心管

二、Ab沉淀目的染色质

1.用dilution buffer稀释至1ml

2.取50ul Input(也可取少量做lgG阴性对照,RNaseⅡ阴性对照)

备注:取450ul做lgGcontrol,剩余500ul

3.剩下的加一抗(5ul/ml),4℃rotate过夜

4.向样品中加入50ul ProteinA+Gbeads, 4℃rotate2h, 之后可在冰上沉淀一会

5.离心,1000rpm1min,留上清

6.洗珠子,1ml/5min/次,在4℃rotate,再在冰上静置5min,1000rpm1min。 洗涤顺序为:低盐溶液→高盐溶液→LicL(之前在4℃)→TE→TE(室温)

三、去除蛋白质

1.Elution buffer(1%SDS、0.1MNaHCO3;0.5gSDS,0.42gNaHCO3 in 50ml ddH20)+250uL RT15min rotate →离心1000rpm1min→上清(收集)→+250ulRT 10min →金属65℃5min→上清(收集)

2.上清+20ul5M NaCl

Input+450ul elution buffer+20ul 5M NaCl

65℃ 6-7h或过夜

3.10ul0.5MEDTA,20ul1MTris-HCl +2ul 10mg/ml 蛋白酶K(50℃1h)?

四、提纯DNA

1.加等体积(500ul)Tris-饱和酚,剧烈混匀,14500rpm10min, 取上清,加入500ulCHCl3混匀后14500rpm10min,取上清后再加入tRNA60ug (200ug/ml,3ul),加异丙醇500ul,离心14500rpm20min 弃上清

2.加70%酒精洗一遍,14500rpm5min,(要去掉上清,先倒掉,倒掉之后离心一下再扔掉液体)将管子倒扣空气晾干。

3.加30ul ddH2O 溶解,4℃过夜,-20℃保存。

免疫沉淀IP免疫共沉淀coIP染色体免疫沉淀ChIP

楼上说的准确的叫Co-IP。IP就是免疫沉淀,没有“共”,哈哈。 其实楼主的意思是既然有Pyk2 and p-Pyk2的抗体,直接检测western,就可以了,为什么还要用IP以后的样品来检测,这是因为p-Pyk2商业化的抗体特异性不好,可能对p-FAK或其他类似的磷酸化蛋白有交叉,所以我们一般为了准确性,看其磷酸化的变化,就先单独把这个蛋白免疫沉淀出来,在用4G10抗体来检测。而且这个方法看的是Pyk2蛋白全部的磷酸化位点的情况,而p-Pyk2商业化抗体一般都是识别某一格Tyr磷酸化位点的,所以这两种试验是有本质区别的,这种方法还应用于很多Tyrosine kinase receptor磷酸化的检测,因为这些蛋白磷酸化位点都特别多哈:)

免疫沉淀是指用抗体把抗原(包括单体、复合物)沉淀下来 ,是一种抗原纯化、浓集的方法;免疫共沉淀 指用抗体把抗原复合物沉淀下来,常用来研究蛋白质的相互作用

免疫沉淀(Immunoprecipitation, IP)

免疫沉淀是利用抗体特异性反应纯化富集目的蛋白的一种方法。抗体与细胞裂解液或表达上清中相应的蛋白结合后,再与蛋白A/G(ProteinA/G)或二抗偶联的agaose或Sepharose珠子孵育,通过离心得到珠子-蛋白A/G或二抗-抗体-目的蛋白复合物,沉淀经过洗涤后,重悬于电泳上样缓冲液,煮沸5-10min,在高温及还原剂的作用下,抗原与抗体解离,离心收集上清,上清中包括抗体、目的蛋白和少量的杂蛋白。

基本实验步骤

(1)收获细胞,加入适量细胞IP裂解缓冲液(含蛋白酶抑制剂),冰上或者4℃裂解30min, 12,000g离心30 min后取上清;

(2) 取少量裂解液以备Western blot分析,剩余裂解液将1μg相应的抗体和10-50 μl protein A/G-beads加入到细胞裂解液,4°C缓慢摇晃孵育过夜;

(3)免疫沉淀反应后,在4°C 以3,000 g速度离心5 min,将protein A/G-beads离心至管底;将上清小心吸去,protein A/G-beads用1ml裂解缓冲液洗3-4次;最后加入15μl的2×SDS 加样缓冲液,沸水煮10分钟;

(4)SDS-PAGE, Western blotting或进行质谱分析。

一、 样品处理:

免疫沉淀实验成功与否,第一步处理样品非常关键。免疫沉淀实验本质上是处于天然构象状态的抗原和抗体之间的反应,而样品处理的质量决定了抗原抗体反应中的抗原的质量,浓度以及抗原是否处于天然构象状态。所以制备高质量的样品以用于后续的抗体-agarose beads孵育对免疫沉淀实验是否成功非常关键。在这个环节中,除了要控制所有操作尽量在冰上或者4°完成外,最为关键的是裂解液的成份。

用于免疫沉淀实验的样品一般是原代培养细胞裂解液或者细胞系裂解液。我们以常用的RIPA裂解液为例(主要含有pH7.4左右的离子缓冲液,接近生理浓度下的NaCl,一定比例的去垢剂和甘油以及各类蛋白酶抑制剂等)来说明其各主要成份的用途,进而帮助我们如何针对不同的实验目的和不同的蛋白质特性来选择最佳的裂解液。

a. 缓冲液:离子缓冲液常采用pH7.4的Hepes或者Tris-Cl。

b. NaCl浓度一般习惯用150 mM,这主要是因为150 mM接近生理浓度,不会破坏蛋白质之间的相互作用。然而细胞内部的NaCl浓度并不是均一的,局部NaCl的浓度可以低到50 mM,150 mM的NaCl有可能会破坏这个区域的蛋白质相互作用。因此裂解液配方最佳的NaCl浓度要

视所分析的蛋白的亚细胞定位而定。

c. 甘油由于其粘性,可以对蛋白质之间的相互作用起到一个很好的保护作用。一般添加10%的甘油有助于稳定蛋白质之间的相互作用。

d. 裂解液中的去垢剂可以裂解细胞质膜,也同时破坏了许多细胞器的膜,从而释放了其中储存的许多蛋白酶。而由于用于免疫沉淀实验的去垢剂作用比较温和,因此蛋白酶的活性大部分得以保存。还有一部分蛋白酶来自胞质中,主要由于其抑制蛋白或者其活性抑制环境受到改变后从而恢复了蛋白酶活性。因此,添加蛋白酶抑制剂对于防止目的蛋白的降解从而完成免疫沉淀实验非常关键。一般主要通过添加EDTA抑制金属蛋白酶,通过Protease Cocktail(多种蛋白酶抑制剂混合物)可以抑制蛋白酶。

e. 去垢剂对于免疫沉淀实验尤其是免疫共沉淀实验是一个非常关键的因素。不同的去垢剂种类和不同的去垢剂浓度主要通过影响以下三个因素来影响免疫沉淀效果:

- 细胞质/器膜的通透性:因为许多目的蛋白都定位在细胞器中,所以必须先将这些蛋白释放出来,抗体才能与之反应。

- 膜蛋白的释放:许多膜蛋白的构象对去垢剂种类和浓度非常敏感,因此针对这类蛋白的免疫沉淀实验,需要谨慎地尝试多种去垢剂以及不同浓度。

- 蛋白相互作用:不同去垢剂对不同性质的蛋白质的相互作用影响程度不一样,需要根据具体蛋白的特性进行分析选择去垢剂种类和浓度。而由于何种去垢剂适应作用于何种蛋白质现在很难精准预测,所以一个更为切实可行的办法就是通过具体实验筛选合适的去垢剂种类和浓度。

二、 抗体-agarose beads孵育

裂解细胞,离心并去除不可溶的膜组份后,上清可以储存在-80°保存3个月,但最好能够使用新鲜制备的细胞裂解液上清去进行抗体-agarose beads孵育实验。抗体可以先加入上清中与样品孵育数小时后再加入Protein A或者G beads孵育过夜,也可以同时加入抗体和Protein A或者G beads孵育过夜。一般选择1mg总蛋白(1mg/ml)对应添加1 ug抗体,最高可以添加至5 ug抗体,过多的抗体会产生假阳性。这个步骤中关键因素在于选择合适的阴性对照。一般选用加同样量的IgG,但更为妥当的方法是选择针对胞内其它无关目的蛋白的一抗做对照。例如,做膜蛋白A的免疫沉淀,选择膜蛋白B来做阴性对照,只要确认二者之间没有相互作用;而做胞质可溶性蛋白C的免疫沉淀,则选择另外一个可溶性蛋白D来做阴性对照。同时,为避免Protein A或者G beads有(非)特异性吸附从而造成免疫沉淀实验结果的假阳性,一般在加入目的蛋白抗体之前,预先将Protein A或者G beads与细胞裂解液孵育数小时,然后取上清用于后续的抗体-agarose beads孵育。

同时,Protein A或者G beads对不同类型的抗体亲和力不同,结合一抗的种属和Ig亚型,选择合适的Protein A或者G beads也是决定免疫沉淀实验成功与否的一个重要因素。一般推荐使用Protein A和Protein G beads的混合物,这样可以达到最佳实验效果,而且省去了许多选择的烦恼。

三、 抗体-agarose beads复合物洗涤:

除了选择特异性好的抗体以及选择合适的阴性对照外,去除免疫沉淀实验非特异性的一个办法是对抗体-agarose beads复合物进行多次洗涤。一般洗涤缓冲液使用和裂解液一样的配方,但去除甘油,以减少由于甘油的粘性带来的非特异性吸附。针对不同的实验要求,还可以通过更改NaCl的浓度以及去垢剂的比例,种类来达到去除非特异性吸附的效果。例如,针对单纯的免疫沉淀而非免疫共沉淀实验或者虽然是进行免疫共沉淀实验,但蛋白质之间的结合比较牢靠,可以考虑使用低浓度(0.2-0.5%)的SDS洗涤抗体-agarose beads复合物,这样可

以去除绝大部分非特异性相互作用。

四、 鉴定

免疫沉淀实验用途非常广泛(见IP: Q&A),而且基于最基本的免疫沉淀实验衍生出了许多免疫沉淀相关实验手段(比如免疫共沉淀,染色质免疫沉淀和RNA-蛋白免疫沉淀),因此,免疫沉淀实验的鉴定方法主要视实验目的而定。

我们在本手册中主要简单概述常见的免疫沉淀之后的WB检测需要注意的实验环节。由于免疫沉淀实验使用目的蛋白抗体加Protein A/G beads与样品孵育,因此在最后离心获得抗体-agarose beads复合物后,eppendorf管中主要含有抗体,目的蛋白,Protein A/G beads以及一些其它非特异性作用蛋白。其中,抗体和目的蛋白以及Protein A/G beads三者之间是以非共价健结合在一起,只有Protein A/G与agarose beads是共价结合在一起的。因此,最后经过添加含巯基乙醇的加样缓冲液以及煮沸变性并离心出去Protein A/G beads后,eppendorf管只有抗体和目的蛋白以及少量非特异性吸附蛋白。这样SDS-PAGE中就含有目的蛋白和抗体二种蛋白,由于加样缓冲液中含有巯基乙醇从而导致抗体的重链与轻链之间的二硫键被破坏从而使得抗体分子变成重链分子(55KD)和轻链分子(25KD)。因此,WB显色反应中除了能检测到目的蛋白外,如果所使用的二抗与用于免疫沉淀实验的抗体分子属于同一种属的话,还能检测到重链和轻链分子。通常用于免疫沉淀的抗体量非常大(1ug),所以当目的蛋白的大小接近重链或者轻链分子时,重链或者轻链分子的WB信号常常由于信号过强而导致影响对目的蛋白的WB结果判断。

针对上述情况,通常有二种解决办法:

a. 选择不同种属的抗体分别进行免疫沉淀实验和WB实验,这样再选择一个种属交叉反应比较弱或者无种属交叉反应的二抗进行WB实验,就可以大大减弱重链和轻链分子的WB信号。

b. 使用交联剂将抗体和Protein A/G beads交联,然后通过添加不含巯基乙醇的加样缓冲液处理目的蛋白-抗体-agarose beads复合物,最后离心去除抗体-agarose beads复合物,上清中只留下目的蛋白。

免疫共沉淀(Co- Immunoprecipitation, Co-IP)

是利用抗原和抗体的特异性结合以及细菌的Protein A或G特异性地结合到免疫球蛋白的Fc片段的现象开发出来的方法。其基本原理是,在细胞裂解液中加入抗兴趣蛋白的抗体,孵育后再加入与抗体特异结合的结合于Agarose珠上的Protein A或G,若细胞中有与兴趣蛋白结合的目的蛋白,就可以形成这样一种复合物:“目的蛋白—兴趣蛋白—抗兴趣蛋白抗体—Protein A或G”,经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,复合物又被分开。然后经免疫印迹或质谱检测目的蛋白。这种方法得到的目的蛋白是在细胞内与兴趣蛋白天然结合的,符合体内实际情况,得到的结果可信度高。这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合;也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档。

免疫共沉淀优点

(1)相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的,处于天然状态;

(2)蛋白的相互作用是在自然状态下进行的,可以避免人为的影响;

(3)可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物

免疫共沉淀缺点

(1)可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质-蛋白质相互作用;

(2)两种蛋白质的结合可能不是直接结合,而可能有第三者在中间起桥梁作用;

(3)必须在实验前预测目的蛋白是什么,以选择最后检测的抗体,所以,若预测不正确,实验就得不到结果,方法本身具有冒险性。

一 原理:免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation)是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。 其原理是:当细胞在非变性条件下被裂解时,完整细胞内存在的许多蛋白质-蛋白质间的相互作用被保留了下来。如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X,那么与X在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。目前多用精制的prorein A预先结合固化在argarose的beads上,使之与含有抗原的溶液及抗体反应后,beads上的prorein A就能吸附抗原达到精制的目的。这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合;也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档。

其优点为:(1)相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的,处于天然状态;(2)蛋白的相互作用是在自然状态下进行的,可以避免人为的影响;(3)可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物。缺点为:(1)可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质-蛋白质相互作用;

(2)两种蛋白质的结合可能不是直接结合,而可能有第三者在中间起桥梁作用; (3)必须在实验前预测目的蛋白是什么,以选择最后检测的抗体,所以,若预测不正确,实验就得不到结果,方法本身具有冒险性。

二、准备工作:

预冷PBS,RIPA Buffer,细胞刮子(用保鲜膜包好后,埋冰下),离心机

1. 用预冷的PBS洗涤细胞两次,最后一次吸干PBS;

2. 加入预冷的RIPA Buffer(1ml/107个细胞、10cm培养皿或150cm2培养瓶,0.5ml/5×106个细胞、6cm培养皿、75cm2培养瓶)

3. 用预冷的细胞刮子将细胞从培养皿或培养瓶上刮下,把悬液转到1.5EP管中,4℃,缓慢晃动15min(EP管插冰上,置水平摇床上)

4. 4℃,14000g离心15min,立即将上清转移到一个新的离心管中

5. 准备Protein A agarose,用PBS 洗两遍珠子,然后用PBS配制成50%浓度,建议减掉枪尖部分,避免在涉及琼脂糖珠的操作中破坏琼脂糖珠

6. 每1ml总蛋白中加入100μl Protein A琼脂糖珠(50%),4℃摇晃10min(EP管插冰上,置水平摇床上),以去除非特异性杂蛋白,降低背景

7. 4℃,14000g离心15min,将上清转移到一个新的离心管中,去除Protein A珠子

8. (Bradford 法)做蛋白标准曲线,测定蛋白浓度,测前将总蛋白至少稀释1:10倍以上,以减少细胞裂解液中去垢剂的影响(定量,分装后,可以在-20℃保存一个月)

9. 用PBS将总蛋白稀释到约1 μg/μl,以降低裂解液中去垢剂的浓度,如果兴趣蛋白在细胞中含量较低,则总蛋白浓度应该稍高(如10 μg/μl)

10. 加入一定体积的兔抗到500μl总蛋白中,抗体的稀释比例因兴趣蛋白在不同细胞系中的多少而异

11. 4℃缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或室温2h,激酶或磷酸酯酶活性分析建议用2 h室温孵育

12. 加入100μl Protein A琼脂糖珠来捕捉抗原抗体复合物,4℃缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或室温1h,如果所用抗体为鼠抗或鸡抗,建议加2 μl"过渡抗体"(兔抗鼠IgG,兔抗鸡IgG)

13. 14000rpm瞬时离心5s,收集琼脂糖珠-抗原抗体复合物,去上清,用预冷的RIPA buffer洗3遍,800μl/遍,RIPA buffer有时候会破坏琼脂糖珠-抗原抗体复合物内部的结合,可以使用PBS

14. 用60μl 2×上样缓冲液将琼脂糖珠-抗原抗体复合物悬起,轻轻混匀,缓冲液的量依据上样多少的需要而定(60 μl足够上三道)

15. 将上样样品煮5min,以游离抗原,抗体,珠子,离心,将上清电泳,收集剩余琼脂糖珠,上清也可以暂时冻-20℃,留待以后电泳,电泳前应再次煮5min变性。

RIPA Buffer配制:

基础成分:

Tris-HCl(缓冲液成分,防止蛋白变性)

NaCl(盐份,防止非特异蛋白聚集)

NP-40(非离子去污剂,提取蛋白;用H2O配制成10%储存液)

去氧胆酸钠(离子去污剂,提取蛋白;用H2O配制成10%储存液;避光保存)

注意:准备激酶(致活酶)实验时,不要加去氧胆酸钠,因为离子型去污剂能够使酶变性,导致活性丧失。

RIPA蛋白酶抑制剂

苯甲基磺酰氟(PMSF)(用异丙醇配制成200mM的储存液,室温保存)

EDTA(钙螯合剂;用H2O配制成100mM的储存液,PH 7.4)

亮抑酶肽(Leupeptin)(用H2O配制成1mg/ml的储存液,分装,-20℃保存)

抑蛋白酶肽(Aprotinin)(用H2O配制成1mg/ml的储存液,分装,-20℃保存)

胃蛋白酶抑制剂(Pepstatin)(用甲醇配制成1mg/ml的储存液,分装,-20℃保存) RIPA磷酸(酯)酶抑制剂

激活的Na3VO4(用H2O配制成200mM的储存液,见Sodium Orthovanadate Activation Protoco)

NaF(200mM的储存液,室温保存)

注意:在准备做磷酸(酯)酶实验的时候,不加磷酸酯酶抑制剂

工作液配制:

配制100ml的modified RIPA buffe:

1. 称取790mg 的Tris-Base,加到75ml 去离子水中,加入900mg的NaCl,搅拌,直到全部溶解,用HCl调节PH值到7.4

2. 加10 ml 10%的NP-40

3. 加2.5 ml 10%的去氧胆酸钠,搅拌,直到溶液澄清

4. 加1 ml 100mM的EDTA,用量筒定容到100ml,2-8℃保存

5. 理论上,蛋白酶和磷酸酯酶抑制剂应该在使用当天同时加入(抑蛋白酶肽,亮抑酶肽,胃蛋白酶抑制剂各100 μl; PMSF, Na3VO4, NaF各500 μl),但是PMSF在水溶液中很不稳定,30分钟就会降解一半,所以PMSF应该在使用前现加,其他抑制剂成分可以在水溶液中稳定5天。

各种成分在工作液中的终浓度:

* Tris-HCl: 50 mM, pH 7.4

* NP-40: 1%

* 去氧胆酸钠:0.25%

* NaCl: 150 mM

* EDTA: 1 mM

* PMSF: 1 mM

* 抑蛋白酶肽,亮抑酶肽,胃蛋白酶抑制剂: 各1 μg/ml

* Na3VO4: 1 mM

* NaF: 1 mM

三、实验流程为:

(1)转染后24-48 h 可收获细胞,加入适量细胞裂解缓冲液(含蛋白酶抑制剂),冰上裂解30min, 细胞裂解液于4°C, 最大转速离心30 min后取上清;

(2)取少量裂解液以备Western blot分析,剩余裂解液加1μg相应的抗体加入到细胞裂解液,4°C缓慢摇晃孵育过夜;

(3)取10μl protein A 琼脂糖珠,用适量裂解缓冲液洗3 次,每次3,000 rpm离心3 min;

(4)将预处理过的10μl protein A 琼脂糖珠加入到和抗体孵育过夜的细胞裂解液中4°C缓慢摇晃孵育2-4h,使抗体与protein A琼脂糖珠偶连;

(5)免疫沉淀反应后,在4°C 以3,000 rpm 速度离心3 min,将琼脂糖珠离心至管底;将上清小心吸去,琼脂糖珠用1ml裂解缓冲液洗3-4次;最后加入15μl的2×SDS 上样缓冲液,沸水煮5分钟;

(6)SDS-PAGE, Western blotting或质谱仪分析。通过免疫共沉淀确定结合蛋白

1.用磷酸盐缓冲液洗30块10 cm培养板上的适宜细胞。刮去每块板上的细胞到1 ml冰冷的EBC裂解缓冲液中。

2.将每毫升细胞悬液转移到微量离心管中,在微量离心机上4℃以最大速度离心15 min。

3.收集上清(约30 ml)并加入30μg的适当抗体,4℃摇动免疫沉淀物1 h。

4.加入0.9 ml的蛋白质A-Sepharose 悬液,4℃摇动免疫沉淀物30 min。

5.用含900 mmol/L NaCl的NETN洗蛋白A-Sepharose混合物,再重复洗5次。最后,用

NETN洗一次。

6.吸出混合物的液体部分。加入800μl的1×SDS胶加样缓冲液到球珠中,煮沸4 min。

7.将样品加入到大孔的不连续SDS-PAGE梯度胶中,在10 mA的恒定电流下电泳过夜。

8.通过考马斯蓝染色观察蛋白质泳带。

9.从胶上切下目标带,将其放到微量离心管中,用1ml 50%乙腈洗两次,每次3 min。

10. 用胰蛋白酶消化胶中的蛋白质,再将肽电洗脱。

11. 通过窄孔高效液相色谱分离肽。将收集的肽在ABI 477A或494A机器上进行自动Edman降解测序。

四、注意的问题:

(1)细胞裂解采用温和的裂解条件,不能破坏细胞内存在的所有蛋白质-蛋白质相互作用,多采用非离子变性剂(NP40 或Triton X-100)。每种细胞的裂解条件是不一样的,通过经验确定。不能用高浓度的变性剂(0.2%SDS),细胞裂解液中要加各种酶抑制剂,如商品化的 cocktailer。

(2)使用明确的抗体,可以将几种抗体共同使用

(3)使用对照抗体:

单克隆抗体:正常小鼠的IgG或另一类单抗

兔多克隆抗体:正常兔IgG

在免疫共沉淀实验中要保证实验结果的真实性,应注意以下几点:

(1) 确保共沉淀的蛋白是由所加入的抗体沉淀得到的,而并非外源非特异蛋白,单克隆抗体的使用有助于避免污染的发生;

(2) 要确保抗体的特异性,即在不表达抗原的细胞溶解物中添加抗体后不会引起共沉淀;

(3) 确定蛋白间的相互作用是发生在细胞中,而不是由于细胞的溶解才发生的,这需要进行蛋白质的定位来确定。

染色质免疫共沉淀技术(ChIP)

真核生物的基因组DNA以染色质的形式存在。因此,研究蛋白质与DNA在染色质环境下的相互作用是阐明真核生物基因表达机制的基本途径。染色质免疫沉淀技术(chromatin immunoprecipitation assay, CHIP)是目前唯一研究体内DNA与蛋白质相互作用的方法。它的基本原理是在活细胞状态下固定蛋白质-DNA复合物,并将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段,然后通过免疫学方法沉淀此复合体,特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段,通过对目的片断的纯化与检测,从而获得蛋白质与DNA相互作用的信息。CHIP不仅可以检测体内反式因子与DNA的动态作用,还可以用来研究组蛋白的各种共价修饰与基因表达的关系。而且,CHIP与其他方法的结合,扩大了其应用范围:CHIP与基因芯片相结合建立的CHIP-on-chip方法已广泛用于特定反式因子靶基因的高通量筛选;CHIP与体内足迹法相结合,用于寻找反式因子的体内结合位点;RNA-CHIP用于研究RNA在基因表达调控中的作用。由此可见,随着CHIP的进一步完善,它必将会在基因表达调控研究中发挥越来越重要的作用。

染色体免疫共沉淀(Chromatin Immunoprecipitation,ChIP)是基于体内分析发展起来的方法,也称结合位点分析法,在过去十年已经成为表观遗传信息研究的主要方法。这项技术帮助研究者判断在细胞核中基因组的某一特定位置会出现何种组蛋白修饰。ChIP不仅可以检测体内反式因子与DNA的动态作用,还可以用来研究组蛋白的各种共价修饰与基因表达的关系。近年来,这种技术得到不断的发展和完善。采用结合微阵列技术在染色体基因表达调控区域检查染色体活性,是深入分析癌症、心血管疾病以及中央神经系统紊乱等疾病的主要代谢通路的一种非常有效的工具。

染色质免疫共沉淀原理

它的原理是在保持组蛋白和DNA联合的同时,通过运用对应于一个特定组蛋白标记的生物抗体,染色质被切成很小的片断,并沉淀下来。IP是利用抗原蛋白质和抗体的特异性结合以及细菌蛋白质的“prorein A”特异性地结合到免疫球蛋白的FC片段的现象活用开发出来的方法。目前多用精制的prorein A预先结合固化在argarose的beads上,使之与含有抗原的溶液及抗体反应后,beads上的prorein A就能吸附抗原达到精制的目的。实验最需要注意点就是抗体的性质。抗体不同和抗原结合能力也不同,免染能结合未必能用在IP反应。建议仔细检查抗体的说明书。特别是多抗的特异性是问题。其次,要注意溶解抗原的缓冲液的性质。多数的抗原是细胞构成的蛋白,特别是骨架蛋白,缓冲液必须要使其溶解。为此,必须使用含有强界面活性剂的缓冲液,尽管它有可能影响一部分抗原抗体的结合。另一面,如用弱界面活性剂溶解细胞,就不能充分溶解细胞蛋白。即便溶解也产生与其它的蛋白结合的结果,抗原决定族被封闭,影响与抗体的结合,即使IP成功,也是很多蛋白与抗体共沉的悲惨结果。再次,为防止蛋白的分解,修饰,溶解抗原的缓冲液必须加蛋白每抑制剂,低温下进行实验。每次实验之前,首先考虑抗体/缓冲液的比例。抗体过少就不能检出抗原,过多则就不能沉降在beads上,残存在上清。缓冲剂太少则不能溶解抗原,过多则抗原被稀释。

ChIP的一般流程

ChIP的一般流程:

甲醛处理细胞---收集细胞,超声破碎---加入目的蛋白的抗体,与靶蛋白-DNA复合物相互结合---加入ProteinA,结合抗体-靶蛋白-DNA复合物,并沉淀---对沉淀下来的复合物进行清洗,除去一些非特异性结合---洗脱,得到富集的靶蛋白-DNA复合物---解交联,纯化富集

的DNA-片断---PCR分析。

在PCR分析这一块,比较传统的做法是半定量-PCR。但是现在随着荧光定量PCR的普及,大家也越来越倾向于Q-PCR了。此外还有一些由ChIP衍生出来的方法。例如RIP(其实就是用ChIP的方法研究细胞内蛋白与RNA的相互结合,具体方法和ChIP差不多,只是实验过程中要注意防止RNase,最后分析的时候需要先将RNA逆转录成为cDNA);还有ChIP-chip(其实就是ChIP富集得到的DNA-片段,拿去做芯片分析,做法在ChIP的基础上有所改变,不同的公司有不同的做法,要根据公司的要求来准备样品)。

具体操作流程:

第一天:

(一)、细胞的甲醛交联与超声破碎。

1、取出1平皿细胞(10cm平皿),加入243 ul 37%甲醛,使得甲醛的终浓度为1%(培养基共有9ml)。

2、37摄氏度孵育10min。

3、终止交联:加甘氨酸至终浓度为0.125M。450 ul 2.5M甘氨酸于平皿中。混匀后,在室温下放置5min即可。

4、吸尽培养基,用冰冷的PBS清洗细胞2次。

5、细胞刮刀收集细胞于15ml离心管中(PBS依次为5ml,3ml和3ml)。预冷后2000rpm 5min收集细胞。

6、倒去上清。按照细胞量,加入SDS Lysis Buffer。使得细胞终浓度为每200ul含2×106个细胞。这样每100ul溶液含1×106个细胞。再加入蛋白酶抑制剂复合物。假设MCF7长满板为5×106个细胞。本次细胞长得约为80%。即为4×106个细胞。因此每管加入400ul SDS Lysis Buffer。将2管混在一起,共800ul。

7、超声破碎:VCX750,25%功率,4.5S冲击,9S间隙。共14次。

(二)、除杂及抗体哺育。

8、超声破碎结束后,10,000g 4oC离心10min。去除不溶物质。

留取300ul做实验,其余保存于-80oC。

300ul中,100ul加抗体做为实验组;100ul不加抗体做为对照组;100ul加入4ul5MNaCl(NaCl终浓度为0.2M),65oC处理3h解交联,跑电泳,检测超声破碎的效果。

9、在100ul的超声破碎产物中,加入900ulChIPDilutionBuffer和20ul的50×PIC。 再各加入60ulProteinAAgarose/SalmonSpermDNA。4oC颠转混匀1h。

10、1h后,在4oC静置10min沉淀,700rpm离心1min。

11、取上清。各留取20ul做为input。一管中加入1ul抗体,另一管中则不加抗体。4oC颠转过夜。

(三)、检验超声破碎的效果。

取100ul超声破碎后产物,加入4ul5

MNaCl,65oC处理2h解交联。分出一半用酚/氯仿抽提。电泳检测超声效果。

第二天:

(一)、免疫复合物的沉淀及清洗。

12、孵育过夜后,每管中加入60ulProteinAAgarose/SalmonSpermDNA。4oC颠转2h。 13、4oC静置10min后,700rpm离心1min。除去上清。

14、依次用下列溶液清洗沉淀复合物。清洗的步骤:加入溶液,在4oC颠转10min,4oC

静置10min沉淀,700rpm离心1min,除去上清。

洗涤溶液:a.low salt wash buffer-one wash

b.highsalt wash buffer-one wash

c.LiCl wash buffer-one wash

d.TE buffer-two wash

15、清洗完毕后,开始洗脱。洗脱液的配方:100ul10%SDS,100ul1MNaHCO3,800ulddH2O,共1ml。

每管加入250ul洗脱buffer,室温下颠转15min,静置离心后,收集上清。重复洗涤一次。最终的洗脱液为每管500ul。

16、解交联:每管中加入20ul 5M NaCl(NaCl终浓度为0.2M)。

混匀,65oC解交联过夜。

第三天:

(一)、DNA样品的回收

17、解交联结束后,每管加入1ulRNaseA(MBI),37oC孵育1h。

18、每管加入10ul0.5MEDTA,20ul1MTris.HCl(PH6.5),2ul10mg/ml蛋白酶K。 45oC处理2h。

19、DNA片段的回收----omega胶回收试剂盒。最终的样品溶于100ulddH2O。

(二)、PCR分析

ChIP-chip技术对于大规模挖掘顺式调控信息成绩卓著,同时它可以用于胚胎干细胞和一些疾病如癌症、心血管疾病和中央神经紊乱的发生的机制。研究人员还可以利用这项技术开发一些治疗方法。目前ChIP-chip技术研究主要集中于两个领域:及转录因子的结合和条件特异性;组蛋白的修饰,组蛋白修饰蛋白和染色体重建。

ChIP-chip在描述转录结合因子动力学中的研究、染色体结构组分的分布、在组蛋白的修饰、组蛋白修饰蛋白和染色体重建中的应用也十分广泛。ChIP-chip 技术的优点是,可以在体内进行反应;在给定的检验细胞环境的模式下得到DNA相互关系的简单影像;使用特异性修正抗体鉴定与包含有一个特异性后转录修正的蛋白质的相关位点;直接或者间接(通过蛋白质与蛋白质的相互作用)的鉴别基因组与蛋白质的相关位点。缺点是:需要一个特异性蛋白质抗体,有时难于获得;为了获得高丰度的结合片段,必须实验演示胞内条件下靶标蛋白质的表达情况;调控蛋白质的基因的获取可能需要限制在组织来源中。

总之,ChIP-chip 技术的发展为析活细胞或组织中DNA与蛋白质的相互关系提供了一个极为有力的工具。在未来的研究中,将对芯片的构建进行改进,提高其实用性。使用易于获得抗体,增加这种方法的可用性。

CHIP-seq

染色质免疫共沉淀技术(Chromatin Immunoprecipitation,ChIP)也称结合位点分析法,是研究体内蛋白质与DNA相互作用的有力工具,通常用于转录因子结合位点或组蛋白特异性修饰位点的研究。将ChIP与第二代测序技术相结合的ChIP-Seq技术,能够高效地在全基因组范围内检测与组蛋白、转录因子等互作的DNA区段。

ChIP-Seq的原理是:首先通过染色质免疫共沉淀技术(ChIP)特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段,并对其进行纯化与文库构建;然后对富集得到的DNA片段进行高通量测序。研究人员通过将获得的数百万条序列标签精确定位到基因组上,从而获得全基因组范围内与组蛋白、转录因子等互作的DNA区段信息。

技术应用

该技术主要应用于:

1.组蛋白修饰酶的抗体作为“生物标记”

2.转录调控分析

3.药物开发研究

4.有丝分裂研究

5.DNA损失与凋亡分析

植物染色质免疫沉淀试剂盒

植物染色质免疫沉淀试剂盒(EpiQuik Plant ChIP Kit)

名称:植物染色质免疫沉淀试剂盒,EpiQuik Plant ChIP Kit

产品规格:24 reactions,48 reactions

产品简介:

启维益成提供的EpiQuik™植物染色质免疫沉淀试剂盒包括全套的试剂,允许试验者有效地在体内研究蛋白-DNA相互关系。整个过程可以在6小时内完成,产品效果远远优于任何竞争对手的试剂盒。EpiQuik™植物染色质免疫沉淀试剂盒适用于将特异性免疫沉淀与定性和定量PCR、ChIP-Seq、ChIP-on-chip结合使用。

这个试剂盒具有如下优点:

快速和简单的程序,实验能在6小时内完成。

微孔板的形式使得分析灵活:手动或高通量。

包括DNA纯化柱:节省时间和减少劳动力。

与所有的DNA扩增方法兼容。

能达到简单、可靠和一致的检测条件。

背景信息

蛋白质-DNA相互作用在细胞功能,如信号转导,基因转录,染色体分离,基因复制和重组,和表观遗传沉默中发挥了关键作用。在植物中,DNA结合蛋白和同源启动子序列之间的相互作用建立了基因的时间和空间的表达模式,并影响了体内的平衡,发育和适应性。染色质免疫沉淀(ChIP)识别特定的调节蛋白及其靶基因的全基因组关联之间的直接提供了一个有利的工具。不像其他的方法如EMASA,DNA微阵列,报告基因检测,是在体外分析DNA和蛋白质的相互作用,染色质免疫沉淀(ChIP)可以在活细胞中检测特定蛋白结合到一个特定的基因序列。

程序

启维益成提供的该试剂盒包括从植物细胞中成功实施染色质免疫沉淀所需要的所有试剂。特别是,该试剂盒包括一个ChIP级二甲基组蛋白H3-K9抗体和正常小鼠IgG的阴性对照。从细胞染色质提取,剪切,添加到抗体封闭的微孔中。抗体捕获蛋白质-DNA复合物后DNA被释放,反转后通过特异设计的快速离心柱纯化。洗脱下来的DNA可用于各种下游应用。 起始材料

起始材料可包括各种植物组织(花、叶、幼苗)。在一般情况下,每个反应输入量应该是从20到50毫克的植物组织。

运用染色质免疫沉淀技术筛选AP-2α的靶基因

  摘要:在后基因组时代。DNA。蛋白质的相互作用是研究基因表达调控的一个重要领域。染色质免疫沉淀技术(chromatin immunoprecipitation assay,简称ChIP)是目前唯一研究体内DNA与蛋白质相互作用的方法。对与ChIP有关的实验条件进行了优化。获得了较优的实验条件。并运用ChIP实验筛选出了转录因子activator protein-2 alpha(AP-2α)的未知靶基因,对于进一步研究AP-2α的功能和调控网络打下了基础。   关键词:染色质免疫沉淀技术;靶基因;AP-2α   中图分类号:Q786   文献标识码:A   文章编号:1007-7847(2008)02-0150-04

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染色质免疫共沉淀ChIP中文操作流程

染色质免疫共沉淀ChIP中文操作流程

1. 细胞中加入1%的甲醛,8ml的培养液加入216 ul的甲醛,37度十分钟。

2. 配制含有蛋白酶抑制剂的PBS 20 ml和含有蛋白酶抑制剂的SDS溶液1ml

3. 将细胞拿出来,迅速的移除含甲醛的培养基,加入含蛋白酶抑制剂的PBS洗两遍。胰酶

消化20秒,加入含蛋白酶抑制剂的PBS 1ml。用细胞刮刀把细胞刮下,收集到1.5ml的离心管里面。

4. 4度 2000rpm离心10min,弃上清液,加入200ul含蛋白酶抑制剂的SDS溶液。吹打

重悬细胞,冰上孵育10分钟。

5. 超声切割DNA,总切割时间4min30sec,超声10sec,间隙10sec。

6. 4度 13000rpm离心10min,转移上清液到一个新的2ml的离心管,弃沉淀。

7. 稀释超声后的上清液到10X的CHIP稀释液,200ul的上清液加入1.8ml的CHIP稀释液,

达到最终体积2ml。

8. 为去除非特异性,加入75ul的Salmon Sperm DNA/Protein A Agarose-50% Slurry,4度旋

转30分钟。

9. 1000rpm离心3min沉淀Salmon Sperm DNA/Protein A Agarose-50% Slurry,收集上清液。

10. 上清液加入1抗,4度振荡过夜。

11. 加60ul的Salmon Sperm DNA/Protein A Agarose-50% Slurry,沉淀抗体/抗原复合物,4

度旋转一小时。

12. 1000rpm 4度 3min收集沉底,移除上清液,开始洗脱过程。

13. 低盐免疫复合物洗脱液,旋转5min,1000rpm离心3min收集沉淀

14. 高盐免疫复合物洗脱液,旋转5min,1000rpm离心3min收集沉淀

15. Licl免疫复合物洗脱液,旋转5min,1000rpm离心3min收集沉淀

16. TE Buffer,旋转5min,1000rpm离心3min收集沉淀,两次

17. 现在得到的是protein A/antibody/histone/DNA complex,新制备elution buffer (1%SDS,

0.1M NaHCO3)。加250ul elution buffer到沉淀,混匀后室温旋转15min。1000rpm离心3min沉淀,移上清液到新的离心管,重复上面的过程,最后上清液体积大约500ul。

18. 加入20ul的5M的nacl反转交联,65度过夜。

19. 加10µl的0.5M EDTA, 20µl的1M Tris-HCl, pH 6.5和2µl的10mg/ml的Proteinase K 到

液体。45度旋转一小时。

20. 加入等体积的苯酚/氯仿抽提DNA,5000g离心10min,收集上清液,不要吸到丝

状蛋白。

21. 加入2.5倍的纯乙醇和1/10体积的乙酸钠,沉淀DNA,5000g离心10min,收集

沉淀,用70%的酒精洗涤,开盖晾干。

22. 用10ul的TE缓冲液溶解。测浓度。

23. 开机预热半个小时,加入200ml 的TE缓冲液调零,倒掉。加入198ml的TE缓冲液和2ml

的样本,测260nm的吸光度。得出值是ug/ul

染色质免疫共沉淀技术(ChIP)

染色质免疫共沉淀技术(ChIP)

真核生物的基因组DNA以染色质的形式存在。因此,研究蛋白质与DNA在染色质环境下的相互作用是阐明真核生物基因表达机制的基本途径。染色质免疫沉淀技术(chromatin immunoprecipitation assay, CHIP)是目前唯一研究体内DNA与蛋白质相互作用的方法。它的基本原理是在活细胞状态下固定蛋白质-DNA复合物,并将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段,然后通过免疫学方法沉淀此复合体,特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段,通过对目的片断的纯化与检测,从而获得蛋白质与DNA相互作用的信息。CHIP不仅可以检测体内反式因子与DNA的动态作用,还可以用来研究组蛋白的各种共价修饰与基因表达的关系。而且,CHIP与其他方法的结合,扩大了其应用范围:CHIP与基因芯片相结合建立的CHIP-on-chip方法已广泛用于特定反式因子靶基因的高通量筛选;CHIP与体内足迹法相结合,用于寻找反式因子的体内结合位点;RNA-CHIP用于研究RNA在基因表达调控中的作用。由此可见,随着CHIP的进一步完善,它必将会在基因表达调控研究中发挥越来越重要的作用。

染色体免疫共沉淀(Chromatin Immunoprecipitation,ChIP)是基于体内分析发展起来的方法,也称结合位点分析法,在过去十年已经成为表观遗传信息研究的主要方法。这项技术帮助研究者判断在细胞核中基因组的某一特定位置会出现何种组蛋白修饰。ChIP不仅可以检测体内反式因子与DNA的动态作用,还可以用来研究组蛋白的各种共价修饰与基因表达的关系。近年来,这种技术得到不断的发展和完善。采用结合微阵列技术在染色体基因表达调控区域检查染色体活性,是深入分析癌症、心血管疾病以及中央神经系统紊乱等疾病的主要代谢通路的一种非常有效的工具。

它的原理是在保持组蛋白和DNA联合的同时,通过运用对应于一个特定组蛋白标记的生物抗体,染色质被切成很小的片断,并沉淀下来。IP是利用抗原蛋白质和抗体的特异性结合以及细菌蛋白质的“prorein A”特异性地结合到免疫球蛋白的FC片段的现象活用开发出来的方法。目前多用精制的prorein A预先结合固化在argarose的beads上,使之与含有抗原的溶液及抗体反应后,beads上的prorein A就能吸附抗原达到精制的目的。实验最需要注意点就是抗体的性质。抗体不同和抗原结合能力也不同,免染能结合未必能用在IP反应。建议仔细检查抗体的说明书。特别是多抗的特异性是问题。其次,要注意溶解抗原的缓冲液

的性质。多数的抗原是细胞构成的蛋白,特别是骨架蛋白,缓冲液必须要使其溶解。为此,必须使用含有强界面活性剂的缓冲液,尽管它有可能影响一部分抗原抗体的结合。另一面,如用弱界面活性剂溶解细胞,就不能充分溶解细胞蛋白。即便溶解也产生与其它的蛋白结合的结果,抗原决定族被封闭,影响与抗体的结合,即使IP成功,也是很多蛋白与抗体共沉的悲惨结果。再次,为防止蛋白的分解,修饰,溶解抗原的缓冲液必须加蛋白每抑制剂,低温下进行实验。每次实验之前,首先考虑抗体/缓冲液的比例。抗体过少就不能检出抗原,过多则就不能沉降在beads上,残存在上清。缓冲剂太少则不能溶解抗原,过多则抗原被稀释。

ChIP的一般流程:

甲醛处理细胞---收集细胞,超声破碎---加入目的蛋白的抗体,与靶蛋白-DNA复合物相互结合---加入ProteinA,结合抗体-靶蛋白-DNA复合物,并沉淀---对沉淀下来的复合物进行清洗,除去一些非特异性结合---洗脱,得到富集的靶蛋白-DNA复合物---解交联,纯化富集的DNA-片断---PCR分析。

在PCR分析这一块,比较传统的做法是半定量-PCR。但是现在随着荧光定量PCR的普及,大家也越来越倾向于Q-PCR了。此外还有一些由ChIP衍生出来的方法。例如RIP(其实就是用ChIP的方法研究细胞内蛋白与RNA的相互结合,具体方法和ChIP差不多,只是实验过程中要注意防止RNase,最后分析的时候需要先将RNA逆转录成为cDNA);还有ChIP-chip(其实就是ChIP富集得到的DNA-片段,拿去做芯片分析,做法在ChIP的基础上有所改变,不同的公司有不同的做法,要根据公司的要求来准备样品)。

具体操作流程:

第一天:

(一)、细胞的甲醛交联与超声破碎。

1、取出1平皿细胞(10cm平皿),加入243 ul 37%甲醛,使得甲醛的终浓度为1%(培养基共有9ml)。

2、37摄氏度孵育10min。

3、终止交联:加甘氨酸至终浓度为0.125M。450 ul 2.5M甘氨酸于平皿中。混匀后,在室温下放置5min即可。

4、吸尽培养基,用冰冷的PBS清洗细胞2次。

5、细胞刮刀收集细胞于15ml离心管中(PBS依次为5ml,3ml和3ml)。预冷后2000rpm 5min收集细胞。

6、倒去上清。按照细胞量,加入SDS Lysis Buffer。使得细胞终浓度为每200ul含2×106个细胞。这样每100ul溶液含1×106个细胞。再加入蛋白酶抑制剂复合物。假设MCF7长满板为5×106个细胞。本次细胞长得约为80%。即为4×106个细胞。因此每管加入400ul SDS Lysis Buffer。将2管混在一起,共800ul。

7、超声破碎:VCX750,25%功率,4.5S冲击,9S间隙。共14次。

(二)、除杂及抗体哺育。

8、超声破碎结束后,10,000g 4oC离心10min。去除不溶物质。

留取300ul做实验,其余保存于-80oC。

300ul中,100ul加抗体做为实验组;100ul不加抗体做为对照组;100ul加入4ul5MNaCl(NaCl终浓度为0.2M),65oC处理3h解交联,跑电泳,检测超声破碎的效果。

9、在100ul的超声破碎产物中,加入900ulChIPDilutionBuffer和20ul的50×PIC。

再各加入60ulProteinAAgarose/SalmonSpermDNA。4oC颠转混匀1h。

10、1h后,在4摄氏度静置10min沉淀,700rpm离心1min。

11、取上清。各留取20ul做为input。一管中加入1ul抗体,另一管中则不加抗体。4oC颠转过夜。

(三)、检验超声破碎的效果。

取100ul超声破碎后产物,加入4ul5MNaCl,65oC处理2h解交联。分出一半用酚/氯仿抽提。电泳检测超声效果。

第二天:

(一)、免疫复合物的沉淀及清洗。

12、孵育过夜后,每管中加入60ulProteinAAgarose/SalmonSpermDNA。4oC颠转2h。

13、4oC静置10min后,700rpm离心1min。除去上清。

14、依次用下列溶液清洗沉淀复合物。清洗的步骤:加入溶液,在4oC颠转10min,4oC静置10min沉淀,700rpm离心1min,除去上清。

洗涤溶液:a.low salt wash buffer-one wash

b.highsalt wash buffer-one wash

c.LiCl wash buffer-one wash

d.TE buffer-two wash

15、清洗完毕后,开始洗脱。洗脱液的配方:100ul10%SDS,100ul1MNaHCO3,800ulddH2O,共1ml。

每管加入250ul洗脱buffer,室温下颠转15min,静置离心后,收集上清。重复洗涤一次。最终的洗脱液为每管500ul。

16、解交联:每管中加入20ul 5M NaCl(NaCl终浓度为0.2M)。

混匀,65oC解交联过夜。

第三天:

(一)、DNA样品的回收

17、解交联结束后,每管加入1ulRNaseA(MBI),37oC孵育1h。

18、每管加入10ul0.5MEDTA,20ul1MTris.HCl(PH6.5),2ul10mg/ml蛋白酶K。

45oC处理2h。

19、DNA片段的回收----omega胶回收试剂盒。最终的样品溶于100ulddH2O。

(二)、PCR分析

ChIP-chip技术对于大规模挖掘顺式调控信息成绩卓著,同时它可以用于胚胎干细胞和一些疾病如癌症、心血管疾病和中央神经紊乱的发生的机制。研究人员还可以利用这项技术开发一些治疗方法。目前ChIP-chip技术研究主要集中于两个领域:及转录因子的结合和条件特异性;组蛋白的修饰,组蛋白修饰蛋白和染色体重建。

ChIP-chip在描述转录结合因子动力学中的研究、染色体结构组分的分布、在组蛋白的修饰、组蛋白修饰蛋白和染色体重建中的应用也十分广泛。ChIP-chip 技术的优点是,可以在体内进行反应;在给定的检验细胞环境的模式下得到DNA相互关系的简单影像;使用特异性修正抗体鉴定与包含有一个特异性后转录修正的蛋白质的相关位点;直接或者间接(通过蛋白质与蛋白质的相互作用)的鉴别基因组与蛋白质的相关位点。缺点是:需要一个特异性蛋白质抗体,有时难于获

得;为了获得高丰度的结合片段,必须实验演示胞内条件下靶标蛋白质的表达情况;调控蛋白质的基因的获取可能需要限制在组织来源中。

总之,ChIP-chip 技术的发展为析活细胞或组织中DNA与蛋白质的相互关系提供了一个极为有力的工具。在未来的研究中,将对芯片的构建进行改进,提高其实用性。使用易于获得抗体,增加这种方法的可用性。