生物实验操作

生物实验操作考查样卷

八师石河子市2015年初中毕业生

生物实验操作考查样卷 (学生用)

样卷二 观察人体的上皮组织和肌肉组织 (时间15分钟)

2.每人一桌,独立操作,不能看书,也不能商量,除实验器材短缺或仪器故 障外,不能向监考教师发问。

3.实验中应遵守考场纪律,按监考教师指令进行操作,各项指令性任务必须 全部完成,考查时间15分钟。

一、实验器材

显微镜、上皮组织永久切片,肌肉组织永久切片,对照用教学挂图。 二、实验要求

1.正确、熟练使用显微镜。

2.知道上皮组织的结构特点和主要功能。 3.知道肌肉组织的种类和分布的主要部位。

4.画出观察到的上皮组织或肌肉组织结构图,并注明各部分名称。

四、实验心得

观察人体的上皮组织和肌肉组织实验操作考查评分表

(供评分教师使用)

说明:1.考查前,评分教师对评分标准先进行认真学习。

2.评分标准供评分教师参考,学生实验时,只要方法正确,会进行实验操作,实验结果基 本正确,均可给分。

3.由于实验仪器所造成的实验结果有偏差,不应扣分。

4.本卷满分为10分,10~9分为A级,9分以下~7分为B级,7分以下~5分为C级,5分

监考教师(签名)

2015年 月 日

2

微生物实验操作

油镜的使用和维护

目的:掌握油镜的使用与维护,熟悉油镜的使用原理。 材料:显微镜,拭镜纸,液体石蜡油,二甲苯

原理:油镜的透镜极小,工作焦距最短,光线通过玻璃和空气,由于介质密度不同发生折射,射入镜筒的光线极少,视野暗,物象不清晰。如在玻片与镜头(透镜)之间加上折光率和玻片(n=1.52)相近的香柏油(n=1.515)就可减少光线的折射,加强视野的亮度,获得清晰的物象。

步骤:显微镜油镜的使用和维护

1.将显微镜平稳地安放在实验台适宜处。识别油镜头:标有100×、OIL、HI等字样。

2. 打开电源,用低倍镜对光,打开光圈,调节聚光镜的位置,使视野光线充足。

3. 标本上加镜油一滴,转动粗螺旋,使油镜头缓缓下降,用眼从侧面观察,直到油镜头浸入油中接近玻片为止。

4. 从目镜观察,同时徐徐转动粗螺旋提升,见模糊物象后再用细螺旋调节,直到见到清晰物象为止。

5. 观察完毕,粗螺旋提高镜头,取下标本片,油镜头使用后立即用擦镜纸擦净镜头上的油。如油已干,可在擦镜纸上滴少许二甲苯擦拭,并立即用另一擦镜纸

擦去二甲苯,因二甲苯能溶解镜头上的固定胶以致使镜头脱落。

6.将镜头转呈“八”字,调低聚光器,对号送入柜子内存放。

革兰染色

目的:掌握革兰染色的原理及操作。

材料:干净玻片,接种环,葡萄球菌和大肠杆菌18-24h培养后的混合菌液,酒精灯,一套革兰染液

原理:主要为细胞壁结构的差异。G+三维肽聚糖结构的交联度大,通透性低,脂质少或无,酒精作用使孔径缩小;而G-肽聚糖为二维疏松结构,薄,外膜含大量脂质,易被酒精溶解,使细胞壁通透性增高,结晶紫-碘复合物被酒精溶解而脱色。

步骤:

1. 细菌标本的制作

(1)涂片:无菌操作。取一接种环混合细菌悬液,涂布成直径约1cm的涂片,涂片应薄而均匀。

(2)干燥:涂片最好在室温中自然干燥。必要时可将标本面向上,放在酒精灯上方微火处干燥。

(3)固定:标本面向上,在酒精灯火焰外焰按钟摆的速度来回通过3次,放置待冷后染色。固定的目的是

杀死细菌,使细菌与玻片黏附较牢固。菌体蛋白质变性后,提高与染料的亲和力。

2. 革兰染色

(1)初染:滴加结晶紫染液1-2滴于涂片上,1min钟后用自来水缓缓冲洗。

(2)媒染:滴加碘液1-2滴,1min后用自来水缓缓冲洗。

(3)脱色:加95%酒精数滴,摆动玻片使酒精与细菌充分接触,约20-30s后,立即用自来水缓缓冲洗。

(4)复染:滴加稀释碳酸品红液,30-60s后,自来水缓缓冲洗。

用吸水纸吸干后,用油镜观察。镜检后,载片放入消毒缸。

细菌特殊结构的观察

目的:观察并掌握细菌的形态及特殊结构。

材料:细菌鞭毛、芽孢、荚膜的标本片;革兰阳性菌、革兰阴性菌染色标本片

示教:

革兰阳性菌:葡萄球菌,紫色

革兰阴性菌:大肠杆菌,红色

细菌鞭毛

细菌芽孢

细菌荚膜

细菌的分布

目的:了解细菌在自然界中的分布情况。

材料: 普通琼脂平板培养基、血平板、镊子、无菌棉拭子、革兰染液。

操作步骤:

1.空气中细菌的检查

(1)采用沉降法:取普通琼脂平板培养基1只,任意置一处,启盖约15分钟,再盖上,37oC培养24小时,观察有无细菌生长。

(2)结果判定:培养基表面可见多种大小、形态不一的菌落。

2. 皮肤表面细茵检查

(1)采用涂抹法: 先在平板底面用记号笔分成两区,作标记,将未消毒的手指在平板的1/2处表面轻轻涂抹划线,然后用碘酒、乙醇擦拭手指皮肤,用消毒后的手指在平板另一1/2处进行涂抹,操作完毕,置37℃培养24小时后,取出观察结果。

(2)结果判定:培养基表面有几种大小及形态不同的菌落生长,注意比较消毒前后细菌的生长情况。

3.咽喉部细茵检查

(1)用无菌棉拭子在咽喉部涂抹后,涂在血平板上,并划线分离,37oC培养24小时后观察结果。注意观察平板上菌落种类以及是否有溶血现象,并可挑取菌落进行革兰染色检查。口腔微生物检查也可用无菌牙签直接挑取少量牙垢,制成涂片,进行革兰染色检查。

(2)结果判定:血平板表面有大小和形态不同的菌落,有的菌落周围可见溶血环。牙垢涂片镜检可见革兰阳性菌和革兰阴性菌。

紫外线杀菌实验

目的:掌握紫外线杀菌的原理,熟悉紫外线杀菌实验的操作。材料:大肠杆菌,琼脂平板,无菌回形状纸片,接种环,镊子,紫外灯.

原理:紫外线波长范围为240~280nm,最适的波长为260nm,这与DNA吸收光谱范围相一致。其杀菌原理是紫外线易被核蛋白吸收,使DNA的同一条螺旋体上相邻的碱基形成胸腺嘧啶二聚体,从而干拢DNA的复制,导致细菌死亡或变异。紫外线特点:紫外线的穿透能力弱,不能通过普通玻璃、尘埃。

步骤:

1.平板密集划线接种。

2.在平板上贴无菌回形纸片。

3.UV照射30min(打开平板盖子)。

4.取出回形纸,将回形纸放入消毒缸中。

5.37oC培养24h后观察结果。

细菌代谢产物观察和生长现象

目的:掌握细菌代谢产物的检测和结果的判断。熟悉细菌在各种培养基中的生长现象。

材料:各种生化管,大肠杆菌、伤寒杆菌、产气杆菌、变形杆菌等。

原理:不同菌的酶系统不同,对底物的代谢产物也不同,用生化的实验方法可将产物检测出来,从而对细菌鉴定。

步骤:

一、细菌代谢产物观察

1. 糖发酵实验

将大肠杆菌、伤寒杆菌分别接种在葡萄糖发酵管内,37℃培养18-24h进行观察。培养基中指示剂为溴甲酚紫。

如能分解葡萄糖,则产酸,培养基由原来的紫色变为黄色,记录符合为“+”。如同时还产生气体,则其中

倒置的小管中有气泡出现,记录符合为“⊕”。 如能分解乳糖,则产酸,培养基由原来的紫色变为黄色,记录符合为“+”。如同时还产生气体,则其中倒置的小管中有气泡出现,记录符合为“⊕”。如培养基未变色,仍为紫色,则表明细菌不能分解乳糖不能分解乳糖。记录符合“-”。

2.枸橼酸盐利用实验

该培养基中提供的唯一碳源是枸橼酸钠。指示剂是澳麝香草酚兰。分别接种大肠杆菌和产气杆菌,37℃培养24h进行观察.

若斜面有菌落出现,培养基由原来的绿色变为深兰色,表明细菌能利用枸橼酸钠,记录符合“+”,反之“-”。

3.靛基质吲哚产生实验

能产生色氨酸酶的细菌,可分解蛋白胨水培养基中的色氨酸,产生靛基质。将大肠杆菌和产气杆菌分别接种在蛋白胨水培养基中,37℃培养48h后,每管各加吲哚试剂(对二甲基氨基苯甲醛)3-4滴,若出现红色化合物-玫瑰色吲哚,表明靛基质产生阳性“+”;反之为阴性:“-”。

4. 硫化氢产生实验

有的细菌能分解含硫氨基酸(胱氨酸、半胱氨酸)产生硫化氢。将大肠杆菌和变形杆菌分别接种在这样的

培养基中,37℃培养18-24h。若培养基中出现黑色沉淀物即为阳性“+”,表明产生的硫化氢与培养基中的铅盐(或铁盐)结合,生成黑色的硫化铅(或硫化铁)。

二、细菌生长现象

1、在液体培养基上生长情况

(1)表面生长:液体清晰,细菌生长在液面形成菌膜。如枯草杆菌。

(2)混浊生长:液体均匀混浊,或有少量沉淀。如大肠埃希菌。

(3)沉淀生长:液体清晰,细菌生长在管底,形成沉淀。如链球菌。

2、在固体培养基上的生长情况

(1)菌苔:在琼脂斜面培养基上长成菌苔。

(2)菌落:在平板上形成肉眼可见的细菌集团,称为菌落。观察时要注意菌落的大小、形状、表面形状、边缘是否整齐、透明度、颜色等,可作为鉴别细菌的依据之一。

(3)色素:水溶性色素和脂溶性色素。

3、在半固体培养基上的生长情况

有鞭毛的细菌,由于能运动,在半固体培养基内沿穿刺线弥漫性生长,使穿刺线变得模糊不清。无鞭毛的

细菌,因为不能运动,接种生仍没穿刺生长,穿刺线与周围界限清楚。

凝集实验(玻片法)

目的:掌握抗原抗体反应的基本原理和特异性,熟悉

凝集反应的操作。

材料:伤寒杆菌A-F群O多价血清、志贺氏痢疾多价

血清、生理盐水、未知菌、玻片。

原理:颗粒性抗原(凝集原)与相应的抗体(凝集素)直接结合,在一定的条件下形成肉眼可见的凝集现象。如红细胞ABO血型的测定,测定细菌的细菌凝集实验。

步骤:

1.取清洁载物玻片一张,用蜡笔划为三格,并注明号码。于第一格和第二格内各加约30ul伤寒杆菌A-F群O多价血清及志贺氏痢疾多价血清,第三格内滴加

约30ul生理盐水。

2. 用接种环挑取待检菌种少许,分别均匀地涂抹于1、2、3格内的液体中。接种环每次使用前后均需经

酒精灯火焰烧灼灭菌。

3. 轻轻摇动玻片,数分钟后用肉眼观察结果,出现灰白色凝集颗粒者即为阳性反应;仍为均匀混悬液者为阴性反应。如结果不够清晰,可将玻片放于低倍显微

镜下观察。

沉淀反应(双扩散)

目的:掌握抗原抗体反应的基本原理和特异性,熟悉沉淀反应的操作。材料:干净玻片,玻璃蜡笔、打孔器、微量加样器、正常人血清IgG、羊抗人IgG

原理:将抗原与抗体分别加到电解质凝胶板相邻的两孔中,抗原与抗体双方自由扩散,在最适当比例处形成抗原抗体复合物(沉淀线)。

步骤:

1.制板:取干净玻片一片,用蜡笔分为三格,用吸管将4-5ml加热溶化的1.5%食盐琼脂充盈中格,制备琼脂板。

2. 打孔:待琼脂板凝固后,用打孔器打孔。孔间距约为5mm。

3. 封底:将打好孔的琼脂板凝板过火焰三次。

4. 加样:用微量加样器在三孔中加入生理盐水,正常人血清IgG和马抗人IgG。每孔加入约10μl。注意:加样时勿使液体溢出和孔内出现气泡。

5. 扩散:将琼脂板放入湿盘内,置37℃温箱中(均保持水平位置),于24小时后观察结果。

药敏实验(纸片法)

目的:掌握纸片法药敏实验方法,熟悉微生物培养,

了解抗生素对细菌的作用机制。了解含药纸片的制备 材料:大肠埃希菌,普通琼脂培养基,无菌镊子,打

孔器(直径6cm),抗生素纸片。

原理:药物在琼脂上扩散,形成浓度涕度,在一定的浓度下,对细菌抑制或杀死,浓度过低,则不能抑制

或杀死。从而形成一定大小的抑菌圈。

步骤:

1.平板上密集划线接种。

2.贴4-5种含抗生素的纸片于平板上。药片与平板边

缘相距至少1.5cm,药片之间相距至少2cm。

3. 37oC培养24h后观察结果。测量抑菌圈直径大小,

判断敏感性。

消毒剂对细菌的影响

目的:掌握含药纸片的制备。熟悉微生物培养,了解消毒剂对细菌的作用机制。

材料:大肠埃希菌,普通琼脂培养基,无菌镊子,打孔器(直径6cm),滤纸纸片(直径约6 mm),70%酒精,金星消毒水,紫药水、红药水。

原理:药物在琼脂上扩散,形成浓度涕度,在一定的浓度下,对细菌抑制或杀死,浓度过低,则不能抑制或杀死。从而形成一定大小的抑菌圈。

步骤:

1.平板上密集划线接种细菌。

2. 将无菌干燥的滤纸片放入各种消毒剂中浸湿,在容器边缘沥干,即为含药的滤纸片。

3. 将以上含药滤纸片贴于平板上,每块贴4种。药片与平板边缘相距至少1.5cm,药片之间相距至少2cm。

4. 37oC培养24h后观察结果。测量抑菌圈直径大小,判断抑菌效果。

(此材料来自精品课程)

东才生物实验操作手册

目 录

细胞培养 ................................................. 2 组织总RNA提取 ........................................... 4 RNA逆转录 ............................................... 7 普通PCR ................................................. 8 胶回收 ................................................... 9 RT-PCR .................................................. 10 同步RNA提取蛋白 ........................................ 12 蛋白提取 ................................................ 13 蛋白浓度测定 ............................................ 13 Western Blot配液 ....................................... 14 Western Blot步骤 ....................................... 15 Chip(染色质免疫共沉淀) ................................ 17

细胞培养

试剂及仪器

PBS(4℃保存)、培养基(4℃保存)、0.25% 胰蛋白酶(-20℃保存)、胎牛血清(-20℃保存)、封口膜、无菌枪头(白、蓝)、试管(10ml)、EP管盒、培养瓶、口罩、手套、帽子、培养皿(培养细胞和分离组织)、离心管、冻存管、过滤器、注射器、超净工作台、CO2培养箱(5%,维持PH值)、普通冰箱(培养用液、临时用血清、消化液)、-20℃冰箱(血清、酶类、抗体、药品)、离心机(沉淀细胞)、电热鼓风干燥箱(烘干、灭菌)、压力蒸气消毒器、恒温水浴箱(56℃×30 min,灭活血清中的抗体)、倒置显微镜(观察细胞状态)、普通显微镜(细胞计数)、电子称、液氮灌。 仪器处理及试剂配制 1、 123 °C高压灭菌30min(枪头、试管),然后放入电热鼓风干燥箱烘干过夜。 2、 培养基内加入10%胎牛血清。 3、 培养基中加入1%双抗。

4、 瓶口、瓶盖、镊子等使用前、使用后要在酒精灯上过火。

注意事项

1、 实验前检查培养箱温度和CO2浓度。 2、 检查CO2瓶压力和剩余量。 3、 临走时请确认关闭倒置显微镜。 4、 血清可中和胰蛋白酶。

5、 所有离心操作要用封口膜封口。

操作步骤

组织细胞取材

1、 常规处死动物(小白鼠断椎、大鼠吸入乙醚、兔子空气栓塞)。 2、 浸泡在75% 酒精中。

3、 解剖动物,用剪刀剪开皮肤,换一把剪刀取组织(取软骨保持其关节腔完整,周围带有

软组织)。

4、 组织放入超净工作台。 5、 PBS洗涤 2~3 次。

6、 换一把小剪刀,解剖出软骨组织(髋关节软骨帽)。 7、 用剪刀剪碎至 1 mm3 左右。 8、 加入0.25% 胰蛋白酶(5~6倍量)。

9、 放入37℃水浴锅内或培养箱中消化(消化过程中间歇摇晃)。 10、 待组织块疏松、色变白。 11、 100目孔径过滤器过滤。 12、 滤液移入离心管。 13、 离心管用封口膜封口。

14、 离心 800~1000 rpm×5 min。(平衡、盖离心机盖子) 15、 弃去上清液。 16、 加入培养液。 17、 细胞计数。

18、 稀释至50万/ml。 19、 移入培养瓶。

20、 瓶口喷75% 酒精消毒。 21、 确认培养瓶盖已拧松。 22、 放入CO2培养箱培养。

23、 24h后倒置显微镜下观察细胞贴壁情况。 细胞换液与传代

1、 查看酒精棉球是否够用。 2、 75%酒精擦拭超净工作台。

3、 准备封口膜和废液缸放入超净工作台。

4、 从-20℃冰箱中取出胰酶,放在培养箱中融化。 5、 取出PBS、培养基放在超净工作台。

6、 打开超净工作台紫外灯,照射 30 min ~ 60 min。 7、 打开细胞房紫外灯,照射 30 min ~ 60 min。 8、 关闭细胞房紫外灯。 9、 关闭超净工作台紫外灯。 10、 打开超净工作台照明灯,打开抽风。 11、 点燃酒精灯。 12、 75% 酒精擦拭倒置显微镜。 13、 取出培养瓶,拧开盖后直接倒去培养基。 14、 取PBS液 1 ml洗后倾去。 15、 加入胰蛋白酶 1 ml,放回培养箱中消化 10 min。 16、 加入 9 ml培养基。 17、 用1ml吸力吹打细胞。 18、 分装入两个新的培养瓶,拧上盖子。 19、 倒置显微镜观察细胞。 20、 瓶口75% 酒精喷雾消毒。 21、 放回培养箱(盖子不要盖紧)。 22、 收拾工作台,处理废物。超超净工作台紫外灯消毒 30 min。 23、 确认倒置显微镜已关闭。

种板与加药、固定

1、 300μl每片。

2、 培养箱中温育约5 min。 3、 加5 ml培养基。

冻存与解冻 1、 取冻存管。 2、 DMSO。

组织总RNA提取

准备工作

试剂及仪器

DEPC水、瓶子(100 ml)、封口膜、滤纸(一张+N条)、Trizol、氯仿、异丙醇、无水乙醇、无RNA酶枪头(蓝、黄)、无RNA酶EP管(1.5 ml)、EP管盒、PCR管、眼科剪、镊子、匀浆机、口罩、手套、帽子。 仪器处理及试剂配制

1、180 ℃烤箱烘烤6小时:瓶子(100 ml)、眼科剪、镊子 2、提前一天进行编号转换并对两套EP管提前编号。 3、剪封口膜。

4、剪滤纸,并在紫外灯下照射。

5、临时配制75%乙醇:按每个样本 1 ml×2 次=2 ml 算(1 体积DEPC水 + 3 体积无水乙醇)。 注意事项

1、 Trizol有毒,注意自我保护。

2、 在75% 乙醇中,RNA在 4℃至少保存1周,-20℃至少保存1年。 3、 注意环境要求流动性小,人员少。

4、 最后加DEPC水溶解前,可将DEPC水先放在60℃温箱中温育,可加速溶解。 5、 匀浆机最多可同时匀24管,离心机最多可离30管。

操作步骤

一、提抽

(一)组织抽提

1、组织从 –80 ℃冰箱中取出待溶解。 2、取组织 50 mg于EP管(1.5 ml)中。 3、加珠子 8~10 粒。 4、加入 Trizol:200μl。 5、封口膜封闭EP管。

6、置于匀浆机中(速度5,时间4 min,4 ℃)。

7、取出后观察是否充分匀浆,如未充分匀浆,继续置于匀浆机中匀浆。 8、去除封口膜,再加入 Trizol:800μl。(Trizol:200μl + 800μl = 1 ml) 9、室温静置 10 min(15 ℃ ~ 30 ℃)。

(二)细胞抽提

1、倒掉培养基,PBS洗,直接将1 ml Trizol 注入培养瓶(5×106~10×106),细胞刮子刮碎细胞。

2、或转入冻存管中冻存或直接进入分相操作(第 10 步)。

二、分相

10、在装有裂解物的EP管中加入 200μl 氯仿(为Trizol总体积的 1/5)。 11、剧烈振荡 30 秒。

12、冰上静置 > 10 min(关键)。 13、离心:12000 rpm×15 min,4 ℃(离心机盖盖子)。

分相为三层 上层:RNA(约为Trizol的 60%); 水相层

中间:DNA;

下层:蛋白质(酚-氯仿)。 有机相

14、小心吸取上清液,转移至另一 EP 管中200μl× 2次(或150μl ~ 170μl × 3 次)。1ml裂解物产生的上清液体积约为 400μl(或400μl ~ 600μl)。有机相和中间层含有DNA和蛋白质,避免触及,宁少勿多。

三、RNA沉淀

15、加入与上清液等体积的异丙醇(约 400 μl)。. 16、颠倒混匀。

17、室温下静置 10 min(20 ℃ ~ 30 ℃)。(开烤箱至60 ℃,为第 30 步做准备) 18、离心:12000 rpm×10 min,4 ℃(离心机盖盖子)。 19、小心弃去上清液(直接倒去上清液),避免振动RNA沉淀。(RNA沉淀在EP管底的侧面形成,乳白色)

四、RNA清洗(清洗两次,去离子/盐)

20、离心管加入1 ml 预冷的 75% 乙醇(1 mlTrizol至少加 1 ml乙醇清洗DNA)。 21、弹起RNA,使沉淀振荡起来。 22、室温 9500 rpm×5 min,4℃(离心机盖盖子)。 23、小心弃去上清液(直接倒去上清液),避免振动RNA沉淀。

24、离心管加入1 ml 预冷的 75% 乙醇( 1 ml Trizol至少加 1 ml乙醇清洗DNA )。 25、弹起RNA,使沉淀振荡起来。 26、室温 9500 rpm×5 min,4℃(离心机盖盖子)。 27、小心弃去上清液(直接倒去上清液),避免振动RNA沉淀。

28、倒置于滤纸上,并用滤纸吸乙醇,放置 5 min( < 10 min,不可过干)。 29、加适量DEPC水 50μl( 25μl ~ 200μl ),保证RNA浓度 >1μg/μl。 30、温箱中60℃温育 5 min,混匀。 31、拿出后置于冰上。(或置于–80℃冰箱中)

五、测RNA浓度和纯度

取1μl样本在光度计上测量。

OD260 代表RNA的OD值,OD280 代表蛋白质的OD值。

OD260/OD280:< 1.8 蛋白质污染 1.8~2.0 理想范围 >2.0 RNA降解

六、调整RNA浓度

测得浓度(单位为:ng/μl),加DEPC水调至相同浓度。 取总RNA量为1000 ng(即1μg),逆转录过程中去除基因组DNA时变为总体积10μl。

1000ng/测得的浓度=应取RNA液的体积(保留至小数点后两位) 7μl-RNA液体积=应加水的体积(保留至小数点后两位)

应取RNA液的体积、应加水的体积均加入PCR管中,用于逆转录

RNA逆转录

准备工作

试剂及仪器

逆转录试剂盒、PCR管、无RNA酶枪头。 仪器处理及试剂配制 注意事项

操作步骤

1、 基因组DNA的去除反应

逆转录反应体系(20μl)

试 剂

②5×g DNA Eraser buffer ①g DNA Eraser Total RNA Total volume

反应条件

42℃ 2min(或者室温5 min) 4℃ 2、 反转录反应

逆转录反应体系(20μl)

试 剂

R buffer 2 ④5× primescript○R RT Enzyme Mix 1 ③Primescript○⑤RT Pimer mix 上一步的反应液 ⑥Rnase Free dH2O Total volume

反应条件

37℃ 15min 85℃ 5s

4℃ (或-20℃长期保存)

使用量 (μl)

4.0 1.0 1.0 10 4.0 20.0

使用量 (μl)

2μl 1μl 7μl 10.0

普通PCR

试剂及仪器

与实时定量的试剂可以共用,但不需要ROX,将0.4 μl换成水即可。 步骤 配胶:每一小块胶(1/4方格)需15 ml左右,浓度1%~3%均可(每15ml加琼脂粉0.15g~0.45g),浓度越高,跑胶时间越长,相对较好。

Loading Buffer:PCR产物=1:4~6,即每20μl的PCR产物加4μl左右Loading Buffer。 每孔加样20μl左右上述混合物。 Maker加5μl左右。 胶孔对着负极(黑色)。

设定电压100V,电流不管,时间35分钟左右,胶浓度高时,适当延长时间,40分钟左右。 紫外观察按左起第2个按钮。

胶回收

准备工作

试剂及仪器

Axygen kit(buffer DE-A/B、buffer W1/W2、Eluent),准备60℃水浴,检查DE-B是否有沉淀,W2中加入无水乙醇。 仪器处理及试剂配制

注意事项

1、 DNA不可长期暴露于紫外下,防损伤。

操作步骤

1、 在紫外灯下切下含有目的DNA的琼脂糖凝胶,用纸巾吸尽表面液体并切碎,计算重量,

论100 mg重量为一个凝胶体积(100 mg=100μl体积) 2、 加入3个凝胶体积的buffer DE-A液(300μl),混合后68℃水浴,间断混合(2 min~3 min),

至凝胶溶化(6 min~8 min),变为红色。 3、 加入0.5个A体积的B液(150μl),混合均匀,若分享DNA片段<400bp时,加入一

个凝胶体积的异丙醇(100μl),变为黄色。(混匀)

4、 吸取上述步骤3中的混合液,转移至DNA制备管(2 ml离心管)中,离心12000 rpm×1

min(2 min)。充滤液。

5、 加入500μl W1,离心12000 g×30 s(2 min),弃滤液。 6、 加入700μl W2,离心12000 g×30 s(2 min),弃滤液。以同样的方法加700μl W2

洗涤,离心12000 g×30 s(2 min),弃滤液。 7、 空转,离心:12000 g×1 min(2 min)。 8、 将制备管置于1.5ml离心管中,加入25μl ~30μl Eluent或去离子水,室温静置1 min,

12000 g×1 min,洗脱DNA(水加热65℃)。

RT-PCR

准备工作

试剂及仪器

RT-PCR试剂盒(SYBR GREEN、ROX)、DEPC水、引物(Forward Primer + Reverse Primer)、目标基因PCR胶回收产物、无RNA酶枪头(蓝、黄、白)、无RNA酶EP管(1.5 ml)、PCR管盒、PCR管、八联管、镊子、口罩、PE手套、小离心机(八联管用、EP管用)、旋涡机。

注意事项

1、SYBR GREEN和混MIX用的EP管,都需用锡泊纸避光。 2、所有操作在冰上进行。

3、引物定购回来时是干粉,一般按要求溶解至100μM保存,使用时需稀释至10μM。但β-actin表达量很高,需稀释至1μM使用。

操作步骤

一、稀释标准曲线 1、 取出我的百宝箱。 2、 准备冰块。

3、 取出(共有大EP管×7)DEPC水、目标基因PCR胶回收产物、RT-PCR试剂盒(SYBR

GREEN、ROX)、引物(Forward Primer + Reverse Primer)、无RNA酶EP管一个(1.5 ml)以及试验样本放于冰上。

4、 准备10~12个PCR管,在PCR板上正向排好(从左到右)。 5、 将板旋转180°,加 DEPC水18μl 。

6、 再将板旋转180° ,2μl 胶回收产物于第1管,依次倍比稀释(加样、离心、弹匀、

再离心、再弹匀、最后离心、取出2μl至下一管,稀释好的PCR管放在另一排,从右向左排列,最终是从左到右依次低浓度到高浓度排列)。

二、混MIX

7、 按下表顺序混MIX。

实时定量PCR反应体系(20μl) H2O

SYBR Premix Ex TaqTM ROX Reference Dye(50×) PCR Forward Primer (10 µM) PCR Reverse Primer (10 µM) DNA模板(cDNA溶液) Total

6.8 10.0 0.4 0.4 0.4 2.0 20.0

1× 1× 0.2 µM 0.2 µM

8、 旋涡混匀并离心(两次)。

9、 准备八联管于槽内,并置于冰上。 10、 将槽旋转180°放置,加MIX液18μl。 11、 再将槽旋转180°,先加标准曲线,再加空白对照和样本。 12、 戴PE手套。 13、 取出八联管盖并盖紧。 14、 标记。 15、 离心。 16、 放另一槽内再压紧。 17、 上机。 18、 打开程序,设置基本参数(2、1、2、1)、plate、RUN、文件名等。 19、 按加样顺序设定孔标记。、 20、 按加样顺序在在实验记录本上记录体系、反应条件、样本顺序、文件名等。

反应条件

95 ℃预变性 30 sec 95℃变性 5 sec 退火温度 30 sec 延伸温度 30 sec

同步RNA提取蛋白

1、 取上清后,加300μl无水乙醇,混匀 2、 室温放置3 min。

3、 离心:4900 rpm×5 min,4℃。 4、 上清至另一EP管中(编号)。 5、 加1.5 ml异丙醇,混匀。 6、 室温放置10 min。

7、 离心:12000 rpm×10 min,4℃。 8、 弃上清。

9、 加2 ml含0.3 mol盐酸胍的95%乙醇,洗沉淀。10、 室温放20 min。 ×3 11、 离心:9500 rpm×5 min,4℃。 12、 弃上清重复上步三次 13、 弃上清。 14、 加2 ml盐酸胍(0.3 mol) 15、 放置20 min。 16、 离心:9500 rpm×5 min,4℃。 17、 弃上清。 18、 加2 ml无水乙醇。 19、 放置20 min。 20、 离心:9500 rpm×5 min,4℃。 21、 真空抽干蛋白,沉淀5~10 min。 22、 1% SDS溶解。 23、 反复吹打。 24、 50℃温溶,使其完全溶解。 25、 离心:1000 rpm×10 min,4℃。 26、 取上清。 27、 -20℃保存。

注意事项

1、 每30~50 mg组织加1 ml Trizol,保证体积不超过Trizol的10%。 2、 每使用1 ml Trizol至少用1 ml 75%乙醇洗涤。

3、 DEPC水:将纯水加入瓶中,加DEPC,浓度0.1%,放置过夜,高压。 4、 75%乙醇,用DEPC水配制。

5、 0.3 mol盐酸胍的95%乙醇:盐酸胍 0.286g + 95%乙醇 10 ml. 6、 1% SDS:SDS 1g + 双蒸水 100 ml

蛋白提取

试剂:Western 细胞裂解液(碧云天)、PMSF(蛋白酶抑制剂)、PBS、异丙醇、乙醇。 用品:离心管、细胞刮、冰盒、EP管、滤纸、离心机(4℃)

操作步骤

1、 溶解细胞裂解液,混匀,分装,-20℃保存。

2、 配0.1M PMSF:17.4 mg + 异丙醇:1 ml 分装至EP管,-20℃保存。 3、 预冷PBS洗三次,置冰上。

4、 裂解液:1 ml + PMSF:10ml → 终浓度1 mM 5、 加入含PMSF裂解液,匀浆裂解。 6、 离心:12000 rpm×10 min,4℃。 7、 上清移至EP管中,-20℃保存。

蛋白浓度测定

试剂:BCA蛋白测量试剂盒(普利莱) 用品:温箱、96孔板、酶标仪、冰盒

操作步骤

1、 冰上裂解样本,BCA标准品。

2、 配工作液(WR) A + B=50:1。 3、 稀释标准品,做标准曲线

4、 样品或标准品:25ml + WR:200ml ,加入96孔板,混匀。 5、 温箱内60℃×30 min(或20 min)

6、 冷却至室温,酶标仪570 nm,OD测定(562 nm读数)。

Western Blot配液

1、 10% 过硫酸铵

AP【0.5 g】+ ddH2O【5 ml】 4℃ 保存1周。

2、 30% 丙烯酰胺一甲双丙烯酰胺(△PH < 7.0,温热利溶) 毒!!!

Acr【29g】 + Bis【1g】 + ddH2O →【100ml】 过滤,避光保存1个月 3、 10% SDS

SDS【10g】 + ddH2O → 【100ml】 5℃水溶,溶解充分,室温保存

4、 TEMED 毒!!! (神经毒性,临用时配制) 5、 1.5 M Tris HCl(PH=8.8)

Tris【18.15 g】+ 48 ml 1mol/HCl + 水 → 【100ml】 4℃ 过滤 Tris【12.12 g】+ ddH2O → 混HCl调PH至6.8 → 【100 ml】 6、 1×电泳缓冲液(PH=8.3)

25 mM Tris,0.25M甘氨酸,0.1%SDS

Tris【3.03g】 + 甘氨酸【18.77g】 + SDS【1g】 → 加ddH2O定容至【1000 ml】 室温保存,可重复使用2~3次;可配10×贮存液 7、 电转印缓冲液(PH=8.3)

甘氨酸39mM,Tris 48 mM,SDS 0.037%,乙醇20% 甘氨酸【2.9 g(14.4)】+ Tris【5.8 g(3.03)】+ SDS【0.37 g (0.5)】+ 甲醇【200 ml(200)】→ 加ddH2O定容至【1000 ml】

8、 TBS(Tris 25 mM,NaCl 0.15 M) PH=7.6 4℃,N个月

Tris【3.0285g】+ NaCl【8.766g】→ 加ddH2O定容至【1000 ml】 9、 TBST(含0.05% Tween20 的TBS)

TBS【500 ml】+ Tween20【0.25 ml】 混匀 10、 封闭液(含5% 脱脂奶粉 TBST)

奶粉【5 g】+ TBST【100 ml】 4℃保存,使用时恢复至室温,一次性使用 11、 丽春红染液

丽春红【0.5 g】+ 冰乙酸【1 ml】+ H2O →【100 ml】 可重复使用 12、 20% Tween 20

Tween20【10 ml】+ H2O →【50 ml】 混匀,4℃保存 13、 10% 甲醇

甲醇【3 ml】+ H2O→【30 ml】

1、 清洗

玻板:洗衣粉→自来水→10% PBS→自来水→无水乙醇(擦)→自来水→双蒸水→晾干 2、 玻板:检漏,滤纸吸干。 3、 配12%分离胶。7.5 ml胶块:

水 30% Acr-Bis 1.5 Tris(PH8.8)

10% SDS 10% AP TEMED

2.45 ml 3.0 ml 1.9 ml 0.075 ml 0.075 ml 0.004 ml

1.6 2.0 1.3 0.05 0.05 0.002

注:TEMED最后加,充分混匀,立即灌胶。

4、 用枪吸胶,沿玻板放入。胶升到红 上缘即可。然后在胶上小心注入水(慢),赶走气泡。 5、 30 min后水和胶之间有折线时,再等30 min使胶充分凝固,倒过上层水,并用滤纸吸

干。

6、 配25%分离胶(3 ml/胶)

水 30% Acr-Bis 1.0 Tris(PH6.8)

10% SDS 10% AP TEMED

2.1 ml 0.5ml 0.38ml 0.03ml 0.03ml 0.03ml

7、 加胶后,赶快插上1.5 mm梳子,在浓缩胶凝固过程中要经常在两边补胶,30min后,

竖直向上拔出梳子,取出胶条,吸干孔中的水。

8、 将胶放入电泳槽(小玻板向内,大的向外,另一边加塑料板)。 9、 加入电泳缓冲液,过内侧小玻板。 10、 加样:10~15μl,<60μg。 11、 电泳:恒压60V×1h(打开电泳仪,先将电压调0,电流调到最大,然后启动电泳仪,

调电压至60V) 12、 待样本进入二胶分界线时,调120V×2h。 13、 溴酚兰跑至2/3分离胶时,停止电泳。 14、 转膜:6张滤纸,2块海绵,1张NC膜(先在冰上泡30 min,作记号),泡入转印缓冲

液中泡30 min(PVSF膜→先泡甲醇10 min,无光膜之分) 15、 “三明治” 黑板(-) 红板(+)

黑板(-)

海绵 滤纸 胶

NC膜(光面对着胶)

滤纸

注:

上下滤纸不得接触 胶面滤纸<胶大小 膜面滤纸<膜大小

红板(+) 海绵 逐层赶走气泡

16、 切胶。 17、 夹子放入转印槽中,4℃,恒流250mA,转印2小时。 18、 NC膜蛋白朝上,剪去左下角,ddH2O中洗,10%甲醇浸泡1 min。于脱色摇床上,将

膜用1×丽春红染5 min。ddH2O洗数次。 19、 NC膜蛋白朝上,至封闭液中,2.5 h,吸干(37℃),120 rpm。 20、 一抗以(脱脂奶粉)封闭液稀释,膜面朝下,37℃振2 h,80~100 rpm,4℃过夜。 21、 回收一抗,4℃保存(一周),以TBST洗膜2次×10 min,

TBS洗膜1次×10 min。

22、 二抗以封闭液稀释,蛋白面朝下,37℃振1.5 h,80~100 rpm。 23、 洗膜同21。 24、 DAB显色:2 ml蒸馏水+2滴A混匀,再加2滴 B和C,再次混匀,将此液体滴加到

膜表面,避光显色10 min,H2O终止反应。

注意事项

1、 SDS分离范围

丙烯酰胺浓度(%)

15 10 7.5 5.0

线性分离范围

12~43 16~68 36~94 57~212

2、 胶灌入玻璃板后不能移动。

3、 分离胶中时间应尽量长,让溴酚兰刚跑出胶时为好。 4、 夹“三明治”要在转印液中进行。 5、 电泳在冰上进行,以免损伤电泳槽。

6、 丽春红染色时间不宜过长,以免不好脱色。

7、 封闭液及洗膜时120~140 rpm,抗体孵育80~100 rpm。 8、 DAB有致癌性,现配现用。

Chip(染色质免疫共沉淀)

第一天: 1.交联染色质制备

1) 将组织从-80℃冰箱中取出,在冰上解冻;

2) 取50 mg肝脏于1.5 mL离心管(根据自己所要检测的修饰种类,提前计算好需要几份

组织),用剪刀将组织切碎(或用匀浆器处理成组织块,我们实验中采用的条件是:组织:珠子:buffer=1:1:2,速度5,时间3 min)。然后转移到装有1 mL冰的 1×PBS的1.5 mL离心管中。

3) 加入27 μL 的37%甲醛溶液(终浓度为1%);室温孵育13 min;

4) 用53 μL甘氨酸(终浓度0.125 M)终止交联;室温孵育5 min,置于冰上; 5) 4℃ 2,000×g离心5 min,倒去液体;

6) 用1mL冰的1× PBS清洗组织三次,每次弹起悬浮物后,4℃ 2,000×g 离心5min; 7) 在1 mL冰的1×PBS(含蛋白酶抑制剂:PMSF 1 mM、Leupeptin 10 μg/ml、Pepstatin A

1 μg/ml)中用匀浆器匀浆组织直至清亮; 8) 4℃ 2,000×g离心5 min,倒去液体。 2 裂解细胞及超声染色质

1) 加入0.5 mL Lysis Buffer(含蛋白酶抑制剂,),温和地吸打,避免产生气泡; 2) 冰上孵育5 min;

3) 在EP管中超声破碎,超声破碎后溶液变清亮且无气泡;

超声参数:2号探头,信号输出40%,总时间4min,作用2 s,暂停1 s;(超声条件需要预实验,预实验步骤如下)

4) 4C,15,000×g离心10 min。取上清。

超声预实验:超声时设置不同的时间梯度,进行检测,看最适合的超声条件。超声后,用琼脂糖电泳检测:取200 μL超声处理液,加8 μL 5 M Nacl,65C水浴4 h解交联;加入20 μL Rnase A(10 mg/ml),于37℃水浴1 h;加入8 μL蛋白酶K(20 mg/ml),于37℃水浴1 h;用2%的琼脂糖胶电泳检测。 3 Protein G珠子的封闭

1) 将浸泡于20% PBS的Protein G beads(PBS: beads=1: 1)轻弹重悬;

2) 按40μL/sample悬液加到1.5 ml离心管中,4°C,4,500×g 离心1 min,沉淀beads。去

除含PBS的水相;

3) 加1 ml含1 mg/mL BSA的 TE buffer,4°C,4,500×g 离心1 min,去上清; 4) 重复离心两次;

5) 最终重悬beads于一倍体积的Dilution buffer。 4 染色质与抗体、beads共孵育

1) 于冰上,向超声处理液中加入2 mL的Dilution buffer; 2) 取10 μL稀释液作为“Input”,4℃保存;

3) 每1 mL稀释液加入40 μL封闭后的Protein G beads和抗体(8 μg IgG, 5 μg H3K4me3, 4

μg H3K9me2, 5 μg H3K27me3); 4) 在旋转摇床上,4℃孵育过夜。 第二天:

1 清洗免疫沉淀物

1) 4°C,4,500×g离心1 min,吸除上清,收集beads; 2) 加入1 mL Wash Buffer I,4,500×g 离心1 min,洗沉淀物; 3) 用Wash Buffer II, Wash Buffer III, 两次TE重复离心;

4) 在100 μL的Elution buffer(含200 μg/mL蛋白酶K)中轻弹重悬沉淀,室温孵育5 min; 5) 4,500×g 离心1 min,收集上清到新的1.5 mL离心管中; 6) 重复用Elution buffer洗一次,合并上清约200 µL。 2去交联及DNA纯化

1) 在10 µL“Input”中加入200 µL的Elution buffer(含200 μg/mL蛋白酶K); 2) 将免疫沉淀液和“Input”置于65°C水浴过夜解交联; 第三天: 1 DNA纯化

1) 用PCR纯化试剂盒纯化DNA;

2) 纯化的DNA用60µL水溶解,于-20°C保存。 2 Real time PCR检测

每个纯化后的样本(U-Input, U-IgG, H3K4me3, H3K9me2, H3K27me3)均针对启动子区进行Real time PCR,每个反应设置双管。 3 用双△Ct法进行统计

PCR纯化试剂盒/DNA纯化试剂盒(碧云天)

注意事项:

操作步骤 1、 加入等体积的溶液I,混匀。(例如如DNA样品体积为100 µL,则加入100 µL溶液I。

如果等体积混匀后体积较大,可以把部分样品加入到纯化柱内,经离心处理后,再加入剩余的样品继续处理。矿物油对于本试剂盒没有干扰。) 2、 加入到DNA纯化内,室温放置1分钟。

3、 最高速(16000 g,约12000~14000 rpm左右)离心一分钟,倒弃收集管内的液体。(注

意:这一步一定要达到16000g,较低离心速度会导致回收效率下降。) 4、 在DNA纯化柱内加入700 µL溶液II,室温放置1 min。 5、 最高速离心1 min,洗去杂质。倒弃收集管内的液体。

6、 再加入500 µL溶液II,最高速离心1 min,进一步洗去杂质。倒弃收集管内的液体。 7、 最高速再离心1 min,除去残留液体并让残留的乙醇充分挥发。

8、 将DNA纯化柱置于1.5 ml离心管上,加入30 µL溶液III到管内柱面上,放置1 min。 9、 最高速离心1min,所得液体即为高纯度DNA。

免疫组织化学

材料

1. 0.01M PBS PH:7.2~7.4 2. 0.3%Triton-100 (破膜)

3. 5%血清(封闭,注意与二抗来源相同) 4. 一抗 5. 荧光二抗

6. 50%缓冲甘油(封片)

实验步骤

1. 冰冻切片后室温干燥20 min(根据温度可调节)

2. 4℃冷丙酮固定10 min,晾干后用指甲油在组织周围画一适当大小的圈,距离组织不宜

太近,与组织保持5 mm左右的距离 3. 0.3%Triton破膜30 min 4. PBS漂洗3次,每次5 min 5. 悬空加入血清封闭1 h 6. 甩干血清,擦干周边水分

7. 悬空加入一抗,稀释度参考说明书,4℃过夜 8. 次日37℃复温1 h(时间随温度可调) 9. PBS漂洗3次,每次5 min

10. 悬空加入二抗,稀释度参考说明书,37℃孵育1 h,避光操作 11. PBS 漂洗3次,每次5 min 12. 缓冲甘油封片 13. 荧光显微镜观察

生物实验操作实验

生物实验操作实验(一)考点及评分表

探究发生在口腔内的化学性消化

主考签字: 监考教师签字:

题目:探究发生在口腔内的化学性消化

实验目的:设计对照实验,探究唾液淀粉酶的消化作用。

材料用具:漱口杯、小烧杯(50ml)2个、量筒(10ml)2个,编上1、2号(10ml)的试管2支、备用试管2支,试管架、滴管、0.5—1%的淀粉浆糊、清水、恒温水浴锅、2%碘液等。 实验步骤: 1、取唾液

(1)用凉开水将口漱净。

(2)略张开口,舌尖抵在下颌门齿的下方(或口中含少许清水),约3分钟,将下唇搁在小烧杯口上,收集唾液。 2、设计实验并实施

(1)用量筒分别量取2ml淀粉溶液;注入编有1、2号的洁净试管中。 (2)再同时向两支试管内分别注入2ml唾液和2ml清水;充分振荡试管。 (3)将两支试管同时放在37℃(教师控制,可调至38-39℃)水浴中保温5—10分钟左右。

(4)同时取出两支试管稍冷却后各加入2滴碘液,振荡两支试管,观察现象。 3、实验现象描述

滴加碘液后,1号试管内液体呈现的颜色是_____________;2号试管内液体呈现的颜色是:____________。(举手示意监考教师检查实验结果、观察现象) 4、分析现象,得出结论:略 根据实验现象分析说明:

1号试管内:__________________________________________________ 2号试管内:__________________________________________________ 5、实验完毕、清洁整理实验器具和试验台(淀粉不要倒掉)。

题目:显微镜观察番茄果肉细胞

姓名: 班级: 学校:

实验内容要点: 1.制作临时装片;

2.用显微镜观察细胞的结构

实验材料用具:新鲜的番茄果实、显微镜(安装好放在实验台上)、洁净的载玻片和盖玻片、镊子、滴管、解剖针、吸水纸、清水、干净的纱布。 实验要求:

1、用纱布擦拭载玻片和盖玻片,用滴管吸取清水,在载玻片中央滴一滴清水; 2、制作番茄果肉细胞的临时装片

用解剖针挑取少许果肉细胞,在载玻片中央的水滴中均匀涂抹(果肉堆积过厚扣分),用镊子夹起盖玻片一端,使另一端先接触水滴,并缓缓盖上盖玻片,无明显气泡。

3、用低倍镜观察番茄果肉细胞(1)正确对光;(2)安放临时装片,调节粗准焦螺

旋找到物像;(3)调节细准焦螺旋,观察番茄果肉细胞。

4、绘图(绘图结束后请举手示意考评教师查看显微镜下的图像)

画成示意图,或者不是显微镜视野观察的图都扣分。错字扣分,没有写图名称的扣分,用箭头标注的扣分。

5、实验完毕,清洁整理材料用具、实验台,显微镜归位。

生物实验操作实验( 二)考点及评分表

观察番茄果肉细胞

合肥市四十五中2014年初中实验生物试题(A)

显微镜观察番茄果肉细胞

班级 学号 姓名

实验内容要点: 1.制作临时装片;

2.用显微镜观察细胞的结构

实验材料用具:新鲜的番茄果实、显微镜(安装好放在实验台上)、洁净的载玻片和盖玻片、镊子、滴管、解剖针、吸水纸、清水、干净的纱布。 实验要求:

1、用纱布擦拭载玻片和盖玻片,用滴管吸取清水,在载玻片中央滴一滴清水; 2、制作番茄果肉细胞的临时装片

用解剖针挑取少许果肉细胞,在载玻片中央的水滴中均匀涂抹(果肉堆积过厚扣分),用镊子夹起盖玻片一端,使另一端先接触水滴,并缓缓盖上盖玻片,无明显气泡。

3、用低倍镜观察番茄果肉细胞(1)正确对光;(2)安放临时装片,调节粗准焦螺

旋找到物像;(3)调节细准焦螺旋,观察番茄果肉细胞。

4、绘图(绘图结束后请举手示意考评教师查看显微镜下的图像)

画成示意图,或者不是显微镜视野观察的图都扣分。错字扣分,没有写图名称的扣分,用箭头标注的扣分。

5、实验完毕,清洁整理材料用具、实验台,显微镜归位。

合肥市四十五中2014年初中实验生物试题(B)

探究发生在口腔内的化学性消化

班级 学号 姓名

实验目的:设计对照实验,探究唾液淀粉酶的消化作用。

材料用具:漱口杯、小烧杯(50ml)2个、量筒(10ml)2个,编上1、2号(10ml)的试管2支、备用试管2支,试管架、滴管、0.5—1%的淀粉浆糊、清水、恒温水浴锅、2%碘液等。 实验步骤: 1、取唾液

(1)用凉开水将口漱净。

(2)略张开口,舌尖抵在下颌门齿的下方(或口中含少许清水),约3分钟,将下唇搁在小烧杯口上,收集唾液。 2、设计实验并实施

(1)用量筒分别量取2ml淀粉溶液;注入编有1、2号的洁净试管中。 (2)再同时向两支试管内分别注入2ml唾液和2ml清水;充分振荡试管。 (3)将两支试管同时放在37℃(教师控制,可调至38-39℃)水浴中保温5—10分钟左右。

(4)同时取出两支试管稍冷却后各加入2滴碘液,振荡两支试管,观察现象。 3、实验现象描述

滴加碘液后,1号试管内液体呈现的颜色是_____________;2号试管内液体呈现的颜色是:____________。(举手示意监考教师检查实验结果、观察现象) 4、分析现象,得出结论:略 根据实验现象分析说明:

1号试管内:__________________________________________________ 2号试管内:__________________________________________________ 5、实验完毕、清洁整理实验器具和试验台(淀粉不要倒掉)。

合肥市2014年初中毕业实验操作考试生物评分表

试题A: 显微镜观察番茄果肉细胞

监考老师:

合肥市2014年初中毕业实验操作考试生物评分表

监考老师:

生物实验操作

Hucker 改良的革兰氏染色法鉴定微生物

一、实验器材

1、设备:显微镜(尼康YS100、YS2-H)

2、材料:酒精灯、接种环、双层瓶(内装香柏油和二甲苯)、载玻片、盖片、擦镜纸、白纸、革兰氏染色液(结晶紫染液、碘液、95%乙醇、番红液)、生理盐水

3、菌种:(1)大肠杆菌;(2)枯草芽孢杆菌

二、实验步骤

1、涂片

取一块洁净载玻片,在载玻片的左、中、右3处各滴加一小滴无菌生理盐水,且均匀分布,用接种环以无菌操作方式分别从大肠杆菌和枯草芽孢杆菌斜面上挑取少许菌苔于左、右一水滴中,从大肠杆菌斜面和枯草芽孢杆菌斜面上各挑取少许菌苔同置于中间一水滴中,分别混匀并涂成薄膜。

2、干燥

室温自然干燥。

3、固定

涂面朝上,通过火焰2-3次。

此操作目的是使细胞质凝固,以固定细胞形态,并使之牢固附着在载玻片上。

4、初染

滴加结晶紫液,以刚好将菌膜覆盖为宜,染色1-2min,水洗。

5、媒染

用碘液冲去残水,并用碘液覆盖约1min,水洗。

6、脱色

用滤纸吸去玻片上的残水,将玻片倾斜,在白色背景下,用滴管流加95%乙醇脱色,直至流出的乙醇无紫色时,立即水洗。

7、复染

用番红液复染约2min,水洗。

8、镜检

干燥后,用油镜观察,比较。

正确结果:菌体被染成深紫色的是革兰氏阳性菌,被染成红色的是革兰氏阴性菌。

三、要求

1、竞赛选题内容应在 2小时内完成;

2、载玻片要洁净无油迹;要用活跃生长期的幼培养物做革兰氏染色;涂片不宜过厚,以免脱色不完全造成假阳性;

3、固定操作中,火焰不宜过热,以玻片不烫手为宜;

4、革兰氏染色结果是否正确,乙醇脱色是革兰氏染色操作的关键环节。脱色不足,阴性菌被误染成阳性菌;脱色过度,阳性菌被误染成阴性菌;脱色时间一般为20-30s;

5、显微镜使用时,物镜应从低倍到高倍依次转换;

6、在显微镜视野下观察出两种菌(大肠杆菌;枯草芽孢杆菌)的形态,在混菌中区分革兰氏阴性菌和阳性菌,并作图;

7、写出实验报告,包括实验目的、原理、器材与材料、实验步骤、结果与讨论。

胰蛋白酶比活力的测定

一、实验原理

胰蛋白酶能催化蛋白质的水解,该酶对于由碱性氨基酸(如精氨酸,赖氨酸)的羧基与其他氨基酸所形成的肽键具有高度专一性。本实验利用胰蛋白酶能催化N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯(BAEE)水解生成N-苯甲酰-L-精氨酸(BA)的原理,进行胰蛋白酶的活力测定。由于BAEE在253nm处的紫外吸收远低于BA,而BAEE在胰蛋白酶的催化下逐渐生成BA,反应体系在253nm的紫外吸收值随之增加,因此可以以⊿A253nm来计算胰蛋白酶的酶活力。

胰蛋白酶的酶活力单位定义(底物BAEE):在本实验条件下,以BAEE为底物,每分钟使⊿A253nm增加0.001所需的酶量定义为1个酶活力单位。

二、实验器材

1、设备:分光光度计(UVmini-1240)、旋涡混合器(QL-901)、微量移液器。

2、材料:试管、试管架、石英比色皿、记号笔、枪头(1000微升、200微升、10微升)、5mL移液管、吸耳球、擦镜纸、滤纸、洗瓶、烧杯。

3、试剂:胰蛋白酶样品(浓度为mg/mL,体积为Xml,需用Tris-HCl缓冲液(水)自行稀释指定倍数后测定(这里可以指定几个倍数,视实际酶活力而定))、0.05mol/L pH 7.8 Tris-HCl缓冲液、2mmol/L BAEE。

三、实验步骤

1、取多支试管,分别标号为1、2、3、4…等,1号为空白组,其余为测定组,按照表1顺序加入各相关试剂。

表1. 胰蛋白酶活性测定加样程序 试剂/mL

0.05mol/L,pH 7.8 Tris-HCl缓冲液

待测胰蛋白酶

去离子水

2mmol/L BAEE

总体积 空白组 1.5 — 0.1 1.5 3.1 测定组 1.5 0.1 — 1.5 3.1

2、以空白组校正A253nm值至0,测定组中加入底物液BAEE后,立即混合均匀,用比色皿在UVmini-1240分光光度计上测定光吸收值A253nm,同时记录时

间。

3、每间隔1min读取A253nm值一次,至6min终止读数。

4、通过调节酶的浓度,控制测定组测得⊿A253nm/min在0.05-0.10之间数据视为有效。

5、计算每分钟平均A253nm增加值即⊿A253nm/min。

⊿A253nm =【(A6min-A3min)/3 + (A5min-A2min)/3 + (A4min-A1min)/3】/3

四、要求

1、竞赛选题内容应在 2小时内完成;

2、微量移液器在吸取液体时避免平置、倒置等状态,防止液体流入移液器腔体内;

3、微量移液器用后要调至最大量程放置;

4、测吸光度之前要分别用水和样品润洗比色杯;

5、滤纸用于吸干比色杯上残留的液体,擦镜纸用于擦试比色杯的光面;

6、比色杯用完后要用水清洗干净,并倒扣在平皿上;

7、写出实验报告,包括实验目的、原理、器材与材料、实验步骤、结果与讨论。

8、实验报告需计算出⊿A253nm/min、所用胰蛋白酶的总活力、胰蛋白酶的比活力。

中考生物实验操作试题

中考生物实验操作试题

实验一 显微镜的使用

材料用具:显微镜、一组目镜和物镜、擦镜纸、干净纱布、植物玻片标本(如双

子叶植物茎永久横切片)

注意:1.实验前取下显微镜的目镜和物镜,放入镜盒。 2.实验前将光圈调至最小。 评分细则:

主要实验步骤 一、取镜与安放

右手握住镜臂,左手托住镜座,将显微镜镜筒向前,镜臂向后,轻轻放在实验台上。镜臂靠近身体略偏左,镜座距实验台7cm。 二、对光

双手转动粗准焦螺旋,使镜筒上升,转动转换器,使低倍物镜对准通光孔。 左眼对准目镜,右眼睁开。同时转动反光镜,将光线反射到镜筒里,直到整个视野呈雪白色为止 三、放置玻片标本

将玻片轻放载物台上,标本正对通光孔的中心,用压片夹压住玻片的两端

四、观察

从侧面注视物镜,转动粗准焦螺旋,使物镜下降直至物镜距离标本2-3mm为止。

左眼注视目镜,转动粗准焦螺旋,使镜筒缓缓上升,直到视野中出现物象。微调细准焦螺旋,使物像更加清晰。尝试通过移动玻片的为止,使“e”字移动视野中央。 五、收镜

观察完毕,先提升镜筒,取下玻片标本。 转动转换器,使两个物体伸向前方。 将镜筒缓慢降至最低处。 将反光镜放在直立的位置。 将显微镜放回原处。

实验二 制作和观察洋葱表皮细胞临时装片

材料用具:显微镜、载玻片、盖玻片、刀片、镊子、解剖针、吸水纸、滴瓶、滴

管、干净纱布、清水、稀碘液、洋葱鳞片叶。

评分细则:

主要实验步骤 1. 制作临时装片

一、准备和取材

用洁净的纱布把载玻片和盖玻片擦拭干净; 用滴管在载玻片中央滴1-2滴清水。

用刀片切取一块洋葱鳞片叶或用刀片在洋葱鳞片叶上划“#”(大约0.5cm²),用镊子撕取洋葱鳞片叶的内表皮;把撕取的表皮浸入载玻片上的水滴中,并用解剖针展平 (2)盖盖玻片

用镊子夹起盖玻片,使它的一边先接触载玻片上的液滴,然后缓缓地放下,盖在

要观察的材料上。 (3)染色

把一滴碘液滴在盖玻片的一侧,用吸水纸从盖玻片的另一侧吸引,使染液浸润标本的全部。

二、用显微镜观察洋葱鳞片叶表皮细胞 (1)取镜与安放

右手握镜臂,左手托镜座,把显微镜放在实验台中央略偏左,距实验台边缘约7cm。 (2)对光

上升镜筒,转动转换器,使低倍物镜对准通光孔

左眼注视目镜,右眼睁开,同时转动反光镜,使视野明亮 (3)安放玻片并调焦

将玻片轻放载物台上,标本正对通光孔的中心,用压片夹压住玻片的两端 双手转动粗准焦螺旋,使镜筒缓缓下降,同时眼睛从侧面看着物镜下降,直到物镜接近玻片

一只眼注视目镜,同时转动粗准焦螺旋,使镜筒缓缓上升至视野中出现物像,微调细准焦螺旋使物像清晰。 (4)观察

移动玻片,将物像移到视野中央,在低倍镜下观察洋葱鳞片叶表皮细胞 三、整理器材:显微镜恢复到实验前状态。

实验三 观察种子结构

一、 实验材料

镊子 、解剖刀、放大镜、碘液、浸泡过的种子(玉米种子、花生、大豆)、载玻片(培养皿) 二、 实验步骤

1. 观察菜豆种子的外形

外部结构:外形呈肾形,最外面是种皮以及种脐。

观察种子的内部结构:

a. 先剥去种皮:用镊子夹住种子,再用解剖刀沿种脐划开,再用镊子或者手

去除种皮。

b. 种皮的内部是胚。 胚包括胚芽,子叶(富有营养),胚芽、胚轴、胚根 把两片子叶分开,用放大镜观察,其中一片子叶上有胚芽、胚轴、胚根 胚芽: 是生有两片幼叶的部分(发育成幼苗的茎和叶) 胚根: 与胚芽相对的一端 (发育成幼苗的根)

胚轴: 连接胚芽和胚根的部分 (发育成连接根和茎部分) 子叶: 转运胚乳中营养物质供胚发育 2.观察玉米种子的结构:

a. 先找到有胚的一面,用镊子夹住玉米种子,用解剖刀从中间切开。

在纵剖面上滴上一滴碘液。被染成蓝色部分是胚乳(提供营养物质),未染色 的部分是种皮(果皮)和胚 胚芽(发育成茎和叶) 胚根(发育成根)

胚轴: 连接胚芽和胚根的部分 (发育成连接根和茎部分) 2. 整理实验材料

将废弃物放入垃圾盒内,整理好桌面。

实验四 制作和观察人的口腔上皮细胞

实验器材:

显微镜、载玻片、盖玻片、吸水纸、纱布、滴管、镊子、稀碘液、生理盐水(0.9%氯化钠溶液)、消毒牙签(一端尖,一端钝)、一次性杯子、擦镜纸(备用)、污物杯、垃圾桶。

(一) 制作口腔上皮细胞临时装片 (1) 准备和取材

用洁净的纱布把载玻片和盖玻片擦拭干净;用滴管在载玻片中央滴1-2滴生理盐水。清水漱口后,用消毒牙签在口腔内侧壁上轻轻刮几下,把牙签上的碎屑涂抹在载玻片上的生理盐水中。 (2) 盖盖玻片

用镊子夹起盖玻片,使它的一边先接触载玻片上的液滴,然后缓缓地放下,盖在要观察的材料上。 (3) 染色

把一滴碘液滴在盖玻片的一侧,用吸水纸从盖玻片的另一侧吸引,使染液浸润标本的全部。

(二) 用显微镜观察口腔上皮细胞 (1) 取镜与安放

右手握镜臂,左手托镜座,把显微镜放在实验台中央略偏左,距实验台边缘约7cm。 (2) 对光

上升镜筒,转动转换器,使低倍物镜对准通光孔;

一只眼注视目镜,另一只眼睁开,同时转动反光镜,使视野明亮。 (3) 安放玻片并调焦 将玻片轻放载物台上,标本正对通光孔的中心,用压片夹压住玻片的两端; 双手转动粗准焦螺旋,使镜筒缓缓下降,同时眼睛从侧面看着物镜下降,直到物镜接近玻片; 一只眼注视目镜,同时转动粗准焦螺旋,使镜筒缓缓上升至视野中出现物像,微调细准焦螺旋使物像清晰。 (4) 观察

移动玻片,将物像移到视野中央,在低倍镜下观察洋葱鳞片叶表皮细胞 (三)整理好实验材料,放归原处。

生物实验操作考查总结

生物实验总结

魏红

紧张而有序的生物实验操作考试终于如期举行并圆满结束。纵观整个实验操作,绝大部分的 学生能够正确对待,态度端正并通过亲自动手操作,大大的调动了同学们的积极性,在整个考试过程中,我也发现了 一些问题还有待于改正。

一.存在的问题

出现问题较多的是:

1、不能够正确使用显微镜:

①目镜和物镜不能够区分。②手摸目镜或物镜、反光镜。③未装目镜或物镜未对准通光孔对光就进行观察,就说看不清楚。④把装片放到载物台上,才去调节反光镜。⑤不用低倍镜对光或找物象。⑥下降时看目镜。⑦物镜离载物台太高还继续上升,找不到物象。不会左右或前后移动装片找物象⑧实验完成后未把物镜偏到通光孔的一侧,而是正对通光孔。⑨有的学生找到物象后,把显微镜拿给监考教师看。

2、绘图

①不能够对照视野内的图形进行画图。②绘图不规范或不会绘图③名称标错或漏掉名称

④脱离开显微镜进行模图。⑤有的标名称时还看显微镜。

3、实验用具使用不规范。

4、结论不正确或丢掉结论

5、整理不规范或不整理。

每个实验中出现的问题

1、观察植物细胞

问题:显微镜使用不规范:未用低倍镜对光和观察,手摸反光镜,下降时未看物镜。细胞核内未点点;制作装片时滴水太少或太多,出现气泡或学生用手压装片,撕取的洋葱表皮太大,或用外表皮,不识盖玻片,用载玻片当成盖玻片。画图时画模式图,与视野中图像不一致。有的把细胞壁写成细胞膜,有的画图时核膜未画出。物象不清晰。装片未清洗

2、馒头有部分学生不能按照要求取等量,在馒头对唾液的消化作用这个实验中,大部分的同学能够把握好整个实验的操作要求,但一部分同学在各个环节都一失分。一般学生在前两个环节取唾液和装适量的馒头都做得很好,但在加入等量的清水和唾液时,有的同学A.B试管不能去等量,相差太大。在测温度时,失分率太高,原因在于很多同学没有先用温度计去测水温,直接放入温水中,没有养成良好的实验习惯。在滴碘液的时候,一部分学生也是 没有养成良好的实验习惯,没有充分振荡,在最后一个回收清洗环节,学生都做得比较好,比较到位。

二、 对策

1、生物实验的操作规范要很好的加强。

2、加强课堂教学和实验教学的联系,培养学生的探究能力。

3、实验过程中注意实验技能的培养,让学生养成良好的动手操作能力以及良好的实验习惯。

微生物实验室安全操作

微生物实验室的安全操作规程

1 实验室安全

1.1 微生物实验室的生物安全性

1.2 科室安全文档

(a)生物危害防护:实际操作规程见(《实验室生物安全通用要求》,中华人民共和国国家标准GB19489-2004。2004-01-05发布,2004-10-01实施。)

(b)实验室安全:原则和措施见(《微生物和生物医学实验室生物安全通用准则》,中华人民共和国卫生行业标准WS 233-2002。2002-12-03发布,2003-08-01实施。)

1.3 应用:

以上的操作规程应用于微生物科室的所有部门。工作人员或访问人员必须遵守各项规定。

1.4 关于新规定或现行规定的修改案:

任何新规定或现行规定的修改案必须通知负责科室安全的人员及相关人员,他们将建议科室主任考虑实施。

1.5 生物性危害

1.5.1 与各种操作有关的生物危害水平取决于:

a.处理的传染性物质的本身:

按照传染性物质对个人和社区的潜在危险性以及经空气传播的可能性,其划分成不同等级。所采用的等级划分详见"《实验室生物安全通用要求》";原则和措施(见《微生物和生物医学实验室生物安全通用准则》)。

b.使用的设备和设施:

处理不同等级的传染性物质的要求在"实验室安全"中已规定。这些符合要求的设备都要承担重要临床工作,科室负责人必须保证中应污染物水平。

c.培训,特别是员工的安全性培训和安全性经验积累。所有员工应该接受一定训练,能安全处理任何实验室可能碰到的物质,避免将实验不能处理或规定之外的传染性物质暴露在实验室,即使暴露事故在实验室,即使暴露事故发生也要会正确处理。

1.5.2 传染性物质的分类

1.5.2.1分类系统

生物危害防护:[见1.2 (a)],根据生物因子对个体和群体的危害程度将其分为4级,危害等级Ⅳ最具危害性。

1.5.2.2危险群/生物安全水平:1-4

a.危险群/生物安全水平:1——对健康成人无致病性,对社区无危害性。通常一般微生物操作就足够,不需特殊安全设备,工作的附近要有洗手设施。培养基上包含未鉴定物,因此,妥善处理对各级安全水平都至着重要。

b.危险群/生物安全水平:2——人类疾病相关物质,这种物质对实验室工作人员有中度危险,并具有一定程度社区危险性。医院微生物室所涉及的绝大多数物质属此安全水平,生物危害警告应张贴,并且限制接近,应用醒目标语,若是能产生空气传播或飞溅的I,II类物质都应使用相应的操作台。实验室应提供类似防护衣、手套和眼罩,尤其是配戴隐形眼镜者,也应提供类似安全水平的洗手设施,并且临近工作区也应有高压灭菌装置。所有废物和反复使用设备的去污染应有特定的程序。

c.危险群/生物安全水平:3——人类疾病相关物质,具有潜在空气传播性,能引起严重的、致命的疾病,对实验室工作人员高度危险,并具有一定程度社区危险性。所有含有或怀疑含有生物3级物质的标本必须标以"小心污染"标签,并且同时标于盛放标本容器和申清单。应对所有血液、体液、分离的人体组织等有普通防护意识,它们都应被视作传染源。在此生物安全水平等级,实验室应控制对其接近。凡涉及该类物质都应使用I或II类工作台操作,也可以遵循II级操作注意事项,对所有废物进行去污染处理,包括工作服和重复使用设备。

d.危险群/生物安全水平:4——对个人的危险如生物安全3级,但对社区有高度危险性。这些传染性物质包括:

蜱源性脑炎病毒

支里半亚-刚果牛血热病毒 Marburg Virus

艾波拉病毒 Lagsa fever Virus Junin HF Virus Machupo HF Virus

Guanaruto HF Virus

Herpesvirus simiae (B Virus)

1.6 以下预防措施,所有实验工作人员必须遵守:

1.6.1 工作服

a.所有实验室成员在工作期间必须始终穿着所提供的工作服。离开实验室时,工作服须挂在指定地方,不得在实验室外冼工作服。

b.在处理含有或怀疑含有生物安全3级物质的标本时,必须在工作服外穿隔离衣。 c.在生物安全操作台内处理标本和培养基时,必须戴手套。

1.6.2 洗手池

洗手池须供应洗洁剂和纸巾。

1.6.3 洗手

所有工作人员在离开工作区必须洗手,并且要先脱去工作服和手套。

1.6.4 食物、饮水、吸烟、化妆品

食物和饮料不允许带入任何处理标本的房间。不允许在处理标本的任何地方吸烟。不允许在处理标本的任何地方使用化妆品。

1.6.5 伤口和擦伤

手上的伤口和擦伤必须覆盖保护物。

1.6.6 个人衣物

个人衣物不允许带入实验室,并且必须保存在带锁的柜子里。

1.6.7 口吸移液管

这是禁用的。要求使用机械移液装置。

1.7 常规预防措施应用于所有血液、体液、组织标本的操作中:

1> 无论何时都应尽可能避免使用注射器、针头或其它锐器。

2> 使用过的针头和一次性切割器必须丢入专门的带有盖子的桶内,以备安全处理,防止容器过满盛装。

3> 使用过的针头不许重新使用或再用手操作。

4> 打烂的玻璃必须放入坚硬的容器(不要用手),然后再放入黑色垃圾袋,如果是污染的,使用黄色垃圾袋。

5> 在接触具有潜在性传染性标本培养基、组织,必戴保护性手套,防止皮肤直接接触。如果手套有可见的污染,必须先除去污染,再更换。手上有皮炎或伤口

的工作人员的需要间接接触传染性物质的人员应戴保护性手套。

6> 在处理完标本、结束工作,甚至在上述规定带手套时,应常规洗手。

7> 当血液、血液制品或其它体液污染发生时,应停止工作洗手,戴一次性手套再清除污染区。建议用含有效氯1000ppm的次氯酸钠溶液。如果污染区较大用浸有次氯酸钠溶液的湿布覆盖10min去污染,并标示相应的警告,丢弃废物及手套到生物安全级物理容器。注意飞溅的水滴和流淌的水会将污染带到主污染区以外。

8> 所有在实验室使用的具有潜在污染性的物质都需去污染,最好先高压,再做处理。

9> 任何可能产生飞溅或气雾的操作都应在生物安全操作台里进行。这些操作包括离心,分离血清,混合,超声,收集组织受精卵,以及处理含有浓集的感染物质标本。

1.8 实验室物质处理

a> 黑色塑料袋用来收集未污染或经高压处理的废物。

b> 废纸篓用来收集未污染的废纸、用过的纸巾等。

c> 所有可能传染的物质必须高压或焚化。

d> 所有丢弃的标本、培养基和实验室废物必须放在专门容器里

e> 用白色聚丙烯罐盛装2%新鲜配置次氯酸液,以临时放置工作中丢弃的标本、污染吸头和棉拭子,待一天工作结束之后,再经高压处理。

f> 黄色塑料袋用来处理污染的实验室废物。它们应封口,再由工人拿去焚烧。 g> 带盖、带标签硬质容器用来盛装针头等锐器。

1.9 实验室传染性物的消毒

高压

a.所有培养基的传染性物质都要高压,除非准备焚烧的,高压的最大好处是使传染性物质离开实验室可保证安全。

b.用作此目的的高压设备应在医学技师监督下由实验室工人操作。

c.高压设备应定期由医院设备组测试、检修。这些测试包括商业使有的芽胞试纸实验。多个高压设备应有使用记录,并自使用之日起由医学技师连续记录。任何不符都要向安全人员报告。

1.10 去污染

去污染剂:

1> 次氯酸溶液:用白色聚丙烯罐装新鲜配置的含有效氯1000ppm的2%次氯酸溶液,放在多个工作室。

2> 5%的Printol:其50%水溶液用来处理溅在地板和家具上的污染。

3> 戊二醛:新鲜配制成一定浓度,主要用于不能使用次氯酸钠的仪器去污染,如离心机等。

4> 75%乙醇:主要用于对清洁表面的快速去污染。

1.11 离心机

1.11.1 注意事项:

a> 使离心机用的试管应具是厚管或塑料的,离心前应仔细检查是否缺损。

b> 离心机需放置在合适的位置,操作都应能看见离心缸,以便能正确地将离心架放在转子上。

c> 离心桶和离心架配对使用,负载后需仔细平衡。

d> 为避免脱架和试管内溶液溅出,开始采用低转速,然后逐渐升高。

e> 离心机内缸应由高级人员定期检索,内壁必须用戊二醛定期清洁,去污染。 f> 在对含有或怀疑含有生物安全操作3级标本离心时,必须加盖密封,密封盖只有在一级生物安全操作台内才能打开。

1.11.2 离心时,试管破裂

a> 如果正在离心时,发生或怀疑发生试管破裂,电动机应立即断电,并在30min后才能打开离心机盖。

b> 如离心后发现破裂,应立刻关闭机盖,保持至少30min。

c> 立即通知安全员。

d> 戴厚手套,使用镊子或用镊子夹棉鉴清除破碎玻璃碎片。

e> 所有破裂试管,玻璃碎片,离心桶和转子必须放在专门消毒剂中去污染,要求消毒剂不具腐蚀性,对浸生物安全物质有效。然后,或者浸泡至24小时,或者高压。

f> 未破裂,带盖的试管也应放在另一含有消毒剂的容器中1后,再对其内容物处理。

i> 离心缸必须用戊二醛棉拭子清洁,过夜,再重复擦拭,再用水清洁洗净并干燥。 g> 含有生物安全3级物质的密封离心桶必须在密封状态下取出,在一级生物安全操作台内打开。如果试管破裂,离心桶密封盖应松松地盖上,对离心桶高压。

1.12 破裂和溢出

任何重要的破裂的溢出都应通知安全人员。在处理含有或怀疑含有生物案例的溢出物,应先得到安全人员的建议。

1.12.1 病毒培养基的泄漏

a> 用浸有20%次氯酸钠的纸巾覆盖溅洒出的污染物用容器碎片。

b> 覆盖10-15min。

c> 戴一次性手套,清扫纸巾和碎片于合适的容器(如塑料袋,但不包括含有碎玻璃或其它锐利物体),用一片硬纸板去清扫,不能用刷子或尘掸,除非它们适于高压。手指远离碎玻璃。

d> 将碎片和使用后的废物放在实验室废物箱。

e> 用常规工作消毒剂擦拭污染区及其周围可能飞溅区。

1.13 泄漏的标本

实验室不泄漏的标本,但要以塑料密封后退还到病房。

1.14 紫外线消毒:培养基,试剂分装和病人血清应存放-70°C和-30°C冰箱。操作存放于-30°C或以下温度冰箱物质,应戴手套,例如当标本从低温冰箱取出或放入时。

1.15 生物安全柜(台)

实验室应配备II级生物安全柜。

1.15.1 级别

I :基本要求:定向流动保护,要求气流从外流入安全柜,并且远离操作者,指向传染物。经HEPA过滤排后,紧好由导管引向室外,以便清除去污染后的各种蒸汽。

II:基本要求:经过滤气体垂直流向,既保护操作者也要保护工作不受污染。 IIA:70%的过滤气体重新循环至工作区,废气导向室外经HEPA过滤。和内流经式工作区的气流速度平均0.4m/s或略高。

IIB:流进气体流速平均0.5m/s或更好。按照不同型别(IIB1,IIB2,IIB3),气

体排出比例从70%到100%。根据工作选择不同型。如有毒化学物质和放射线同位素不能再循环至工作区。

III :基本要求:操作者与传染物安全隔离,并且整个操作过程都要提高。安全柜所在的环境也要一定程度隔离,以防手套破裂。

1.15.2 生物安全柜的安装

安全柜要发挥某安全防护功能必须注意安装位置,废气应通过管道以保护环境不受污染。如果需购置这类设备应联系CUHK安全办公室,在种类,牌子,样式,安装位置和安装以及与其它设施的相邻关系上获得指导。

1.15.3 常规检查和安全操作以及工作区的消毒

有一份操作规程详尽地叙安全柜的常规使用也应包括安全柜发生意外时应采取的行动。每一个使用者必须阅读规程使后签名。

1.15.4 注意:

安全柜应尽可能避免使其处于不安全状态,但有时因为安全柜的意外,使用者被迫这样做。此时,应张贴注意以警告其它人不得再使用。

1.15.5 去污染和再认证

由受过训练的人员,配戴个人防护用具,来做污染工作。要求:安全柜在密闭条件下用干燥多聚甲醛蒸汽醺蒸,使用浓度8500ppm。(安全柜的体积应包括外周供应和废气过滤设备。)在温度20-25°c,相对温度不低于60%环境保持4h,甲醛蒸汽,如果允许,可直接抽出室外,若不允许可在安全柜内用氨基重碳盐吸收。 因为空气有限的穿透力,在处理潜在传染性物质时最好使用HEPA过滤器,以及高压或焚化后再丢弃。

1.17.5.2 再认证

这项工作由专门人员进行,去污染后安全柜性能再认证定,及过滤器的更换,测试是否有漏气,调试空气流速是否合规定,以及检测过滤器的性能。再认证应至少一年做一次,或是装置移动,过滤器维修后。应备有去污染,维修和再认证的记录,并且应方便使用者的查阅。

2. 实验安全操作程序:

2.1 工作人员在采集标本过程中应当防止病原微生物扩散和感染,并对标本的来源、采集过程和方法等作详细记录。

2.3 实验过程中绝对禁止吸烟、饮食等,不要以手抚头面部等。

2.4 处理样本的过程中易产生高危害气溶胶时,要求同时使用适当的个人防护装备、生物安全柜和/或其它物理防护设备。如可产生含生物因子的气溶胶,应在适当的生物安全柜中操作。细菌的分离培养、菌种开封、转种、研磨、稀释等操作,均应在生物安全柜中进行。

2.5 使用接种环进行操作时,接种环应在工作灯的内焰中燃烧,以避免菌液或菌块飞溅。

2.6 稀释菌液时,吸管、针管要缓慢插入试管或烧瓶底部,小心操作避免产生气泡或气溶胶。

2.7 使用注射器加样时,用过的针头切勿再重新入套或拔开注射器与针头,应直接放入锐器收集器,以免划破皮肤造成接种感染。

2.8 菌株库要设专人管理,并按照国家微生物菌毒种管理办法执行。2.9进行毒菌操作过程中,不要穿戴巳经污染的防护性手套触摸门柄、仪器或毒菌区以外区域,避免由于粗心扩大污染范围。

2.10 试验结束后,操作过程中所有可能与生物危险物接触或被污染的试验器械和物品,能够高压消毒的必须高压消毒,不能进行高压消毒的设备、仪器,应使用有效的消毒剂擦洗后再以紫外灯近距离长时间消毒。

2.11 实验中发生意外污染情况,应立即通知主管人员并做好处理污染物和相应区域的准备,不得擅自采用其它禁止的方法进行消毒处理。

2.12 实验室内任何微生物的样本,废弃物都必须经高温高压灭菌后,方可按一般垃圾处理。

2.13 实验室所用任何个人防护装备应符合国家有关标准的要求。实验室应确保具备足够的有适当防护水平的清洁防护服供使用。还应穿戴其它的个人防护装备,如手套、防护镜、面具、头部面部保护罩等。

3. 实验室污物处理及消毒操作程序:

3.1 实验室含有生物危险物的临床标本及被污染的一次性用品,试验完成后,应在操作台或实验区域内以紫外灯近距离照射消毒 2小时以上,再经高压消毒后方可丢弃或焚烧。

3.2 可重复使用的实验用品及器材,完成实验后,应在操作台或实验区域内经紫

外灯近距离照射消毒2小时以上后,再交有关人员进行高压消毒和煮沸洗刷。

3.3 实验用的试管、吸管、注射器,须装在加盖不漏的容器内,经高压灭菌后取出。

3.4 培养物或实验室垃圾,在丢弃前必须经高压消毒和紫外灯近距离长时间照射处理。不允许积存垃圾和实验室废弃物。已装满的容器应定期运走。在去污染或最终处置之前,应存放在指定的安全地方,通常在实验室区内。

3.5 实验室废弃物应置于适当的密封且防漏容器中安全运出实验室。有害气体、气溶胶、污水、废液应经适当的无害化处理后排放,应符合国家相关的要求。

3.6 实验过程中,如标本或含标本的前消化处理液被打翻污染了操作台或地面,应以吸满70%酒精的卫生纸覆盖污染区,15分钟以后卫生纸方可移去。

3.7实验室内未经消毒的污水,禁止直接排入公共排水系统,更不允许混入居民生活垃圾。

4. 意外事故处理程序:

4.1 如果发生意外,必须立即通知实验室主管人员和医院生物安全办公室,并在有关人员的指导监督下对出事现场进行处理,绝对禁止未经报告而私自对出事现场给予非规范的处理。

4.2 实验过程中,如污染物溅落到身体表面,或有割伤、刺伤、烧伤、烫伤等情况发生,应立即停止实验工作进行紧急处理,更换被污染的实验服,皮肤表面用消毒液清洗,伤口以碘酒或酒精消毒,眼睛用无菌生理盐水冲洗。

4.3 如果发生菌液溢出,含菌种的培养管破碎等,造成中 、小面积污染,可用比污染面积大25%以上的纱布覆盖污染区域,边缘用脱脂棉围住,向纱布倾倒5%苯酚溶液或70%的酒精,浸泡2小时以上(其间适量加溶液防止干燥),再经紫外灯近距离(1米内)照射2小时以上;被污染的器械、容器等立即浸泡于70%酒精中2小时以上,再次着防护衣进入房间,将污染溢出物和用于清洁的纱布放入可耐受高压的双层塑料袋内并尽快高压。

4.4 如果发生气溶胶污染或大面积污染,应立即停止实验并关闭实验室,对污染区域进行紫外灯照射消毒过夜;第二天对污染区进行24小时封闭空气熏蒸消毒(乙醛消毒法﹕5ml乙醛+2g高锰酸钾/m3空间)。

4.5 临床医务人员应对事故受害者和消毒人员进行医学随访。

微生物实验操作规范

1.显微观察:

遵循从低倍到高倍观察,一定要在低倍下确实观察到了目标(验证方法:(1)物象会随载物台移动而动;(2)个头的大小要符合理论大小:um级);然后直接转换镜头到高倍,而不要去上下移动载物台,当转过镜头后,再微调,使物像清晰;观察真菌,物镜头到40倍即可;观察细菌要转到100倍镜头,且要滴加香柏油,注意滴油操作,先找到目标后,再将镜头转出露出空间,将油滴到目标上,再把镜头转回来,微调即可。

2.接种技术:

接种前应该先准备待接菌种和接种器皿,做好标记。

(1)平板涂布接种:倒培养基的标准操作动作,右手托瓶底,左手拿平板,会开关盖,在火焰上方操作;涂布的量0.1-0.2mL,用涂布棒均匀涂开

(2)斜面接种:注意一手拿两支试管的拿法,操作时塞子用右手小指等夹住,接种环灭菌,无菌操作;

(3)划线接种:分三区或四区均可,注意平板的方向转动,接种针划线接好第一区后要火焰灭菌,然后再划第二区,如此进行下去。

(4)接种完毕,应放置于合适的培养箱进行培养。

3.血球计数板使用:

熟悉显微镜的使用,熟悉计数板的格子布局,知道要数哪些格子中的细胞,并且会计算

4.革兰氏染色:

步骤要记好,每一环节的时间要正确,尤其需要严格计时的脱色环节(30秒);注意制片的大小及涂菌体的量;会观察结果并判断阴阳性。

生物实验操作技能大赛

2011年龙都街道吕标初中生物教师

基本功比赛实施方案

一、比赛目的

为落实诸城市教育局关于加快中学生物教师专业化发展的意见文件精神,加大对生物教师的实验操作技能,为教师提供学习锻炼的平台,促进教师提高教学水平,打造高素质的合格教师队伍,我校举行了生物教师实验操作技能大赛活动。

二、参赛对象

思想好、师德正、事业心强的龙都街道吕标初中生物教师,年龄45岁以下的一线英语教师。

三、比赛内容

参赛选手从生物教材中的演示实验和学生实验。

1.分组实验。抽签决定分组实验课题,并完成实验操作和说课演讲。(15分钟)。

2.演示实验。参赛教师抽签决定演示实验课题,并完成实验演示和讲解。

3.评委当场打分,计分。

三、比赛时间和地点

选拔赛:学校选拔赛于2011年11月23日下午进行。生物教研组组织。 地点:四楼会议室

四、比赛办法

1.初赛:由各级部层层选拔,最后按比例选出选手,每级部一名参加教研室组织的比赛。

2.评委当场打分,计分。

2011年11月21日